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1 临床生物化学检验常用技术 第三章 2 本章主要内容第一节光谱分析技术第二节电化学分析技术第三节干化学分析技术第四节电泳分析技术第五节基因扩增技术 3 教学目标和要求 掌握1 光谱分析技术的基本原理及定性和定量方法 2 电位分析法的概念 离子选择性电极的结构及类型 3 基因扩增技术的原理 反应体系的组成及注意事项 熟悉 影响光谱分析技术 电泳技术的因素 各种分析技术在生化检验中的应用 4 第一节光谱分析技术 本节主要内容一 光谱分析技术的基本原理二 光谱分析技术在临床生物化学检验中的应用补充 分光光度计的基本结构 操作方法 5 一 光谱分析技术的基本原理 利用各种化学物质都具有发射 吸收或散射光谱谱系的特征 以此来确定物质性质 结构或含量 光谱分析技术分类 发射光谱分析技术 火焰光度法 原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术 紫外 可见光分光光度法 原子吸收分光光度法和红外光谱法 散射光谱分析技术 比浊法 6 一 分光光度技术的基本原理 1 吸光度与透光度 A lgT lgI I0 lgI0 I 当时 一部分光被散射 一部份光被吸收 另有一部分光透过溶液 设入射光强度为I0 透射光强度为I I和I0之比称为透光度 表示透过光强度与入射光强度的比值即 T I I0 T 100为T 称为百分透光度 透光度的负对数称为吸光度即 光线通过溶液 7 8 朗伯 比尔定律 I0 入射光强度C 溶液浓度b 液层厚度I 透射光强度T 透光度A 吸光度k 吸光系数 I0 I 2 Lambert Beer定律 9 Lambert Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律 该定律是分光分析的理论基础 其表达式为 A KLC 式中A为吸光度 K为比例常数 称为吸光系数 L为溶液层厚度 称为光径 C为溶液浓度 Lambert Beer定律适用于可见光 紫外光 红外光和均匀非散射的液体 表示 吸光度与和溶液中吸光物质的浓度C和溶液的厚度L的乘积成正比 10 当溶液浓度C的单位为g L 溶液液层厚度L的单位为cm时 K叫 吸光系数 用 表示 其单位为L g cm当溶液浓度C的单位为mol L 溶液液层厚度L的单位为cm时 K叫 摩尔吸光系数 用 psilon 表示 其单位为L mol cm 此时 A LC 的意义是 当液层厚度为1cm 物质浓度为1mol L时在特定波长下的吸光度值 11 是物质的特征性常数 摩尔吸光系数越大 表示物质对波长为 的光的吸收能力越强 同时在分光光度法中测定的灵敏度也越大 吸光系数大小取决于吸光物质的性质 入射光的波长及温度 1 物质不同 吸光系数不同 属于物质的特征常数 2 溶剂不同 同一物质吸光系数也不同 3 光波长不同 吸光系数不同 12 吸收定律的适用条件 必须是使用单色光为入射光 溶液为稀溶液 吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分溶液 吸光度的加和性 A总 A1 A2 A3 An溶液中有多种吸光物质时 总吸光度等于各吸光物质吸光度总和 13 二 原子吸收分光光度法 AtomicAbsorptionSpectrometry AAS 基本原理 根据待测元素的气态原子 能吸收同种原子所发射的特征光辐射 吸收特征符合Lambert beer定律 即一定条件下 原子的吸光度同待测元素基态原子的浓度成正比 计算出试样中待测元素的含量 这种方法称为原子吸收光谱法 14 四大部分组成 光源 单色器 原子化器 检测器 15 1 选择性高 干扰少 共存元素对待测元素干扰少 一般不需分离共存元素 原子吸收分光光度法特点 2 灵敏度高 火焰原子化法 10 9g mL 石墨炉 10 13g mL 3 测定的范围广 测定70多种元素 4 分析速度快 5 精密度 准确度高 火焰法误差 1 石墨炉法3 5 16 原子吸收分光光度法与紫外可见吸收光度法异同点 相同点 1 都是依据样品对入射光的吸收进行测量的 2 两种方法都遵循朗伯 比耳定律 3 就设备而言 均由四大部分组成 即光源 单色器 吸收池 或原子化器 检测器 17 1 在可见 紫外分光光度法中 吸光物质是溶液中被测物质的分子或离子对光的选择吸收 原子吸收光谱法吸光物质是待测元素的基态原子对光的选择吸收 这种光是由待测元素制成的空心阴极灯 称元素灯 作光源 2 单色器与吸收池的位置不同 紫外可见 光源 单色器 比色皿 原子吸收 光源 原子化器 单色器 异同点 18 二 光谱分析技术在临床生物化学检验中的应用 一 分光光度技术的定性方法 定性依据 最大吸收波长 max和摩尔吸光系数 2 摩尔消光系数 方法 1 最大吸收波长 max方法 确定是什么物质 19 二 分光光度技术的定量方法 1 标准曲线法 根据Lambert Beer定律 液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系 配制一系列浓度的标准品溶液 浓度应包含高 中 低浓度范围 按标本处理方法作相同处理 在特定波长下测定吸光度 以标准液浓度为横座标 以吸光度为纵座标 按最小二乘法的原理 将对应各点连成一条通过原点的直线 这条直线称为标准曲线 待测溶液测定吸光度后 从标准曲线上可查出其相应的浓度 方法 确定有多少物质 浓度 20 21 制作和应用标准曲线时应注意下面几点 1 测定条件发生变化时 如更换标准品和试剂等 应重新绘制 2 标准品应有高的纯度 标准液的配制应准确 3 当待测液吸光度超过线性范围时 应将标本稀释后再测定 4 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 5 标准曲线上应标明制作日期 制作人和名称 22 2 比较法 Cu Au Cs As 己知浓度的标准品和标本作同样处理 使用相同的空白 同时测定标准管和标本的吸光度 根据测定的吸光度及标准品浓度 可直接计算出标本的浓度 计算公式为 其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度 Cs和As分别为标准管浓度和吸光度 用标准品法定量时 标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近 23 3 其它分析方法 包括差示法 多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法 24 1 光学因素 要求入射光是单色光 入射光的谱带越宽 其误差越大 2 化学因素 浓度 pH 溶剂和温度等因素可影响化学平衡 三 光谱分析技术的影响因素 25 补充分光光度计的基本结构 最常用的是可见分光光度计和紫外 可见光分光光度计 五大部分 结构 26 27 一 光源 光源 是一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光 光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱 并有足够的强度和良好的稳定性 在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化 光源种类 可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯 可发射320 2500nm 紫外光光度计常用氢灯和氘灯作为光源 150 400nm 28 二 单色器 定义 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器 由入射狭缝 准直镜 色散元件 聚焦元件和出射狭缝等几部分组成 色散元件种类 滤光片 棱镜 光栅 其核心部分是色散元件 起分光的作用 29 30 三 比色杯 又称为吸收池或比色皿 材料 常用无色透明 耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 表1 一些材料的有效透明区 31 32 五 显示器 四 检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号 并将电信号放大的装置 常用的检测器为光电管和光电倍增管 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置 33 分光光度计的操作方法 1 开721 A分光光度计的开关 将比色池的盖子打开 通电20分钟使仪器预热 2 将波长旋至测定的波长 3 将空白液 校准液或待测液放入比色池 将空白液置于光路中 4 将开关置于T位 打开比色池盖子 用光量粗调和光量细调调节T为0 0 关上比色池盖子 调节T为100 0 5 将开关置于A 用消光调零调节A为0 06 重复步骤4和57 将校准液或待测液推入光路 测量溶液的吸光度 A 34 二 吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度 在25 将4mg铬酸钾溶于100ml的0 05mol LKOH中 放入比色池中 在不同波长下测定吸光度值 与己知的标准吸光度校正表进行比较 可检测仪器吸光度的准确度 三 波长的校正 镨钕滤光片 528nm处有最大吸收峰 干涉滤光片 589nm处有最大吸收峰 35 第二节电化学分析技术 本节主要内容一 电化学分析技术的基本原理二 电极分析法在临床检验中的应用三 电极分析法的影响因素 36 溶液的电化学性质是指电解质溶液通电时 其电位 电流 电导和电量等电化学特性随化学组分和浓度而变化的性质 一 电化学分析技术的基本原理 37 建立在溶液电化学性质基础上 并利用这些性质 通过电极这个变换器 将被测物质的浓度转变成电学参数而进行检测的方法 电化学分析法 Electrochemicalanalysis 测定物理量 参与反应的化学物质的量 确定 电位电流电导电量 38 电位分析法 以测定电池两极间电位差或电位差的变化来进行定量分析的电化学分析方法称电位分析法 Potentiometruy 39 电位分析法的理论依据 能斯特方程表示电极电位与溶液中对应离子活度之间存在的定量关系 单个电极的电位是无法测量的 因此 由指示电极与参比电极组成电池用电位计测量该电池的电动势 即可得到该电极的相对电位 相对于同一参比电极的的不同电极的相对电位是可以相互比较的 并可用于计算电池的电动势 40 原电池 由指示电极和参比电极构成 1 指示电极电极电位随被测物质活度变化的电极 离子选择性电极 2 参比电极与被测物质无关 提供测量电位参考的电极 具有恒定电位值的电极 甘汞电极和银 氯化银电极 正极 参比电极负极 指示电极 41 离子选择电极分析法 ionselectiveelectrode ISE 是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法 离子选择性电极分为 玻璃膜电极和敏化电极带有对被测离子选择性响应的敏感膜 膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移 从而产生电位改变 电极电位 1 离子选择电极基本结构 特点 仅对溶液中特定离子有选择性响应 42 离子选择电极的结构 离子选择电极 43 2 电极电位膜内外被测离子活度的不同而产生电位差 3 电极电位的测量ISE与参比电极共同浸入样品试液中构成一个原电池 通过测量原电池的电动势E 便可求得被测离子的活度或浓度 能斯特方程 44 离子选择性电极作正极时 对阳离子响应的电极 取正号 对阴离子响应的电极 取负号 45 离子选择性电极的电极电位表示为 阳离子选择性电极为 阴离子选择性电极为 n为离子电荷数 Cx为被测离子浓度 fx为被测离子活度系数 K在测量条件恒定时为常数 46 一 常用的离子选择电极1 玻璃膜电极敏感膜由玻璃材料制成 是发现较早的ISE 由于其敏感膜的组成不同 现已有pH Na K Li Ag Ca2 iCa2 Mg等玻璃电极 分为固态和液态两种 Na 电极就是利用玻璃膜对离子的选择性透过制成的固态电极 而K 电极是在聚乙烯膜上结合缬氨霉素制成的液态电极 二 电化学分析法在临床检验中的应用 47 2 气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极 二氧化碳气敏电极 它是由pH玻璃膜电极构成 在玻璃电极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜 透气膜允许二氧化碳扩散进出碳酸氢钠溶液 从而引起pH的变化 便可测定二氧化碳的含量 其他的还有测定氨 氯等气敏电极 指示电极通常选用玻璃电极 作用是对待测气体的浓度或分压变化做出选择性响应 48 3 酶电极是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极的敏感膜上组成的生物传感器 在酶电极法测定葡萄糖时 葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢 而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧电极或过氧化氢电极测得 从而以间接方式得知样品中葡萄糖的含量 常用的酶电极还有测定尿素 尿酸 肌酐 维生素C 乙醇 乳酸 蛋白质等酶电极 49 二 离子选择电极的分析方法1 标准曲线法2 标准比较法3 标准加入法 50 三 样品测定方式 间接法 血清经一定离子强度缓冲溶液稀释后由电极测量 直接法间接法 ISE测量方法分类 直接法 血清不经稀释直接由电极测量 51 四 电极分析法在临床检验中的应用 电化学临床分析仪是利用电化学分析技术而设计的临床分析仪器 52 电解质分析仪 采用离子选择性电极 ISE 测量体液中离子浓度的仪器 测量指标 钾 钠 氯 钙 锂 pH值等 53 利用电极对血样中的酸碱度 pH 二氧化碳分压 PCO2 和氧分压 PO2 进行测定的仪器 血气分析仪 测量指标 pH PCO2 PO2 AB SB BB TCO2 BEblood BEECF SO2等 54 三 电极分析法的影响因素 离子强度络合剂干扰物质空气湿度 温度其他 55 第三节干化学分析技术 自学 56 第四节电泳技术 本节主要内容一 电泳的基本原理二 电泳技术的分类三 影响电泳的因素四 常用电泳技术五 电泳区带的测定六 特殊电泳技术 57 电泳 指带粒子在电场中向着与其所带电荷相反的电极移动的现象 电泳技术 electrophoresistechnique 利用各种带电粒子电泳速度不同 对多组分物质进行分离 然后进行定性 定量分析的技术 58 主要用于蛋白质 核酸等的分离 鉴定和定量目前已经发展到自动化的电泳系统 整个电泳过程包括点样 电泳 脱色 扫描定量都实现了自动化操作 同时用半干胶技术取代液体缓冲液 使得电泳操作更规范简便 电泳结果重现性更好 59 一 溶液中粒子的带电状态 许多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解离的基团 在一定的PH下 这些基团会带上正电或负电 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小 形状的不同 使带电分子产生不同的迁移速度 从而实现样品中各种分子的分离 一 电泳分析的基本原理 60 电泳迁移率 指带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度 即每厘米电压下降1V的电场强度下带电粒子每秒内移动的距离 二 电泳的迁移率 61 一定的pH条件下 能吸附其他带电粒子或本身带有可解离基团的物质颗粒 在电场中必然受到电性相反的电极吸引而移动 电泳速度 V 与颗粒带电量 Q 及电场强度 E 成正比 与粒子半径 r 和介质粘度 成反比 V EQ 6 r 电泳迁移率大小与颗粒带电量 大小和形状及介质粘度有关 62 三 影响电泳的因素 一 分子的形状和性质 二 电场强度 三 电泳缓冲液缓冲溶质溶液的pH值离子强度 五 支持介质1 电渗作用2 吸附作用 决定了带电颗粒解离的程度 也决定了物质所带净电荷的多少 是指单位长度支持物体上的电位降 溶液的离子强度越高 带电颗粒泳动速度越慢 反之越快 通常缓冲液离子强度选择在0 05 0 1mol L之间 即介质对样品的滞留作用 六 蒸发 63 电场强度 粒子在电场中的移动速度 与电场强度成正比 电场中因施加的端电压不同 分为常压和高压电泳 常压电泳一般在500V以下 电势梯度约为10 20V cm 高压电泳一般在500V以上 电势梯度约为20 200V cm 高压电泳会产生大量的热 所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置 64 缓冲液 缓冲液应选用使分离的物质稳定 而且不与其发生反应的体系 缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性质 状态 因而会影响迁移率和分离效果 缓冲液的离子强度 一般以0 05 0 10mol L浓度为宜 离于强度低 产热少 电泳快 区带明显扩散 离子强度高 区带尖锐 泳动距离短 产热多 65 电渗就是指在电场中 液体对固体支持物的相对移动 66 二 常用电泳分析技术1 移动界面电泳2 区带电泳3 稳态电泳 67 一 醋酸纤维素薄膜电泳 celluloseacetateelectrophoresis 以醋酸纤维素薄膜为支持介质 分辩力好 对蛋白质吸附极少 拖尾现象轻微 不吸附染料 对区带周围的染料能完全洗去 不干扰测定 样品需要量少 介质又可以透明后定量扫描等优点 68 临床生物化学上分离血清蛋白 糖蛋白 脂蛋白 血红蛋白 甲胎蛋白及同工酶等大分子物质 69 琼脂 琼脂糖琼脂胶 脱去SO42 丙酮酸酯基 二 琼脂或琼脂糖凝胶电泳 优点 1 含液体量大 疏松 扩散小 对蛋白吸附极弱 2 均匀 区带整齐 分辨率高 3 电泳速度快 4 透明度好 5 区带易着色 样品易洗脱 6 干膜可长期保存 70 71 三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物是目前分辨率最高的支持物之一 适用 1 分离各种蛋白质组分 2 测定蛋白质或核酸分子量 核酸序列分析 3 基因变异或同功酶研究 72 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶具有一定的网状结构 如果形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径 样品分子在通过凝胶孔洞时 所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状有关 聚丙烯酰胺凝胶电泳 73 1 分子筛效应蛋白质进入分离胶 由于凝胶有一定的孔径 不同的蛋白质分子大小不同 受到的阻力不同 小分子受阻力小 走在前面 大分子受阻力大 走在后面 2 电荷效应同一般电荷 电荷效应及分子筛的功能 大大提高了分离能力 是目前分辨率最高的电泳支持介质 74 四 电泳区带的测定电泳区带的定性 定量测定可用直接法或染色法 1 区带定性分析区带染色蛋白区带染色用氨基黑10B 溴酚蓝 考马斯亮蓝 丽春红等 脂蛋白染色常用苏丹红 苏丹黑等 核酸区带染色常用溴乙啶 多发性骨髓瘤 M带肝硬化 桥 75 2 区带定量分析 1 光密度扫描法 2 洗脱比色法 76 三 自动电泳分析技术四 电泳分析技术在临床中的应用 一 蛋白电泳1 血清蛋白电泳新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳 染色后 通常可见5条带 即清蛋白 1 2 和 球蛋白 血清蛋白电泳图谱 77 2 免疫固定电泳常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定 一般用于单克隆Ig增殖病 单克隆Ig病 本周氏蛋白和游离轻链病 多组分单克隆Ig病 重链病 CSF寡克隆蛋白鉴别 多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断 免疫固定电泳图谱 78 3 脂蛋白电泳检测各种脂蛋白 包括胆固醇和甘油三酯 主要用于高脂血症的分型 冠心病危险性估计 以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生 发展 诊断和治疗效果观察的研究等 脂蛋白电泳图谱 79 4 尿蛋白电泳主要目的是 确定尿蛋白的来源 了解肾脏病变的严重程度 从