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基因克隆的一般流程 基因的获得 PCR RT PCR 载体 连接 准备感受态细胞 转化 重组子筛选 下游工作 载体的选择 基因工程载体一般要求 能在宿主细胞中复制繁殖 有较高的自主复制能力 易进入宿主细胞 进入效率越高越好 合适的多克隆位点 MCS 可接受外源片段 且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制 易从宿主细胞中分离纯化出来 便于重组操作 有筛选标志 当其进入宿主细胞 或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来 便于克隆操作 常用的载体有质粒 噬菌体和病毒等 重组DNA技术的一般流程 目的DNA的获得目的DNA与载体的连接重组子导入受体细胞重组子的筛选和鉴定 实验一 pEGFP NGF质粒载体的构建 NGF基因的克隆 T A克隆 NGF sense aGAGCTCaagatgctgtgcctcaagccagtNGF antisense atGGGCCCgtctagatccagagtgtctg 5 6 pEGFP荧光质粒表达载体 质粒DNA的酶切反应结果 质粒M酶切反应M酶切反应 pEGFPpT NGF 酶切产物凝胶回收操作步骤 GelExtractionKit 仔细切下含DNA的凝胶 置一称重的1 5ml离心管中 称重 按300 lS1溶液 100mg凝胶加入的比例加入S1溶液 置50 水浴10分钟 使凝胶完全溶化 每2分钟颠倒混匀一次 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱 置收集管中 9000g 30秒 倒掉收集管中的液体 再将吸附柱放入同一收集管中 在吸附柱中加入500 lW1溶液 9000g 15秒 倒掉收集管中的液体 再将吸附柱放入同一收集管中 重复一次洗柱 将吸附柱放入同一收集管中 9000g 1分钟 将吸附柱放入一新1 5ml离心管中 在吸附膜中央加入30 lddH2O 静置1分钟 9000g 1分钟 备用 重组子的筛选 耐药性基因外源质粒赋予宿主抗生素抗性蓝白斑筛选 互补现象 lacZ plasmid和M15 cellstrain 关于连接酶 定义 ATP存在下 在3 OH和5 P之间形成磷酸二酯键 特性 连接粘端的效率远高于平端 策略 首选不匹配粘端次选匹配粘端 载体脱磷平端连接 延长时间 提高酶量 平端连接图示 匹配粘端连接图示 不匹配粘端连接图示 连接反应的建立 连接反应的温度 粘性末端 按A T G C含量计算 5 如PstI CTGCA G 12 EcoRI G AATTC 8 平末端 如EcoR GAT ATC 可在室温进行 不超过30 酶的用量要比粘性末端加大10 100倍 DNA量 摩尔数之比载体 目的DNA 1 1 3 载体摩尔数目标基因片段碱基数 载体重量目标DNA摩尔数目标基因片段重量 载体碱基数 载体和目标基因的连接反应 如未定量可以按回收效率75 计算DNA浓度 按载体与目的基因摩尔数比1 3进行连接 连接反应在灭菌的0 5ml离心管中进行 15 l体积反应体系中 加ddH2O使终体积为15 lLinervector50 100ngTargetgenefragment15 30ng10 LigaseBuffer 已含有ATP 1 5 lT4DNALigase1 O l轻轻混匀 稍加离心 14 16 或4 O N 重组子转入受体细胞 体外重组的DNA引入受体细胞感受态 受体细胞处于易于接受外源DNA的状态原理 1 遗传物质的传递 2 受体菌的选择与改造 重组质粒的