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1 第一章蛋白质化学 2 3 第一节蛋白质概述第二节氨基酸的结构 分类和性质第三节蛋白质的结构第四节蛋白质分子结构和功能的关系第五节蛋白质的理化性质第六节蛋白质的分离纯化技术第七节氨基酸序列测定 4 第一节蛋白质概述 一 蛋白质的概念二 蛋白质的元素组成三 蛋白质的基本结构单位四 蛋白质的分类五 蛋白质在生命活动中的重要功能 5 一 蛋白质的概念 蛋白质 Protein 是氨基酸通过肽键按一定顺序连接而成的一条或几条肽链 经弯曲折叠形成的具有特定空间构象和生物学功能的生物大分子 Proteinsarelargebiologicalmoleculesconsistingofoneormorepolypeptidestypicallyfoldedintoaglobularorfibrousform facilitatingabiologicalfunction 6 二 元素组成 1 主要元素 C 50 55 H 6 7 O 19 24 N 13 19 S 0 4 其他元素 P I Se Fe Zn Mn Cu CoMo等 2 特点 N含量相对恒定 平均16 100克蛋白质中含16克N 1克N相当于6 25克蛋白质应用 凯氏定氮法 Kjeldahldetermination 测定样品中蛋白质的含量 7 三 蛋白质的基本组成单位 氨基酸 aminoacid AA 是蛋白质的基本组成单位22种 已知 AA参与蛋白质的合成 8 四 蛋白质的分类 根据组成分类 单纯蛋白质 simpleprotein 和结合蛋白质 conjugatedprotein 结合蛋白质 conjugatedprotein 糖蛋白 脂蛋白 核蛋白血红蛋白等 Asimpleproteinisaproteinthatyieldsonlyaminoacidsortheirderivativesuponhydrolysis Aconjugatedproteinisaproteinthatfunctionsininteractionwithotherchemicalgroupsattachedbycovalentbondsorbyweakinteractions 根据分子形状分类 纤维状蛋白质 fibrousprotein 球状蛋白质 globularprotein 和膜蛋白 membraneprotein 根据生物功能分类 结构蛋白 信息蛋白 受体蛋白 运输蛋白 通道蛋白 免疫蛋白 酶等 9 五 蛋白质在生命活动中的重要功能 1 是生物体的结构成分1 参与生物机体各组织和器官的构成 如胶原蛋白 角蛋白 2 参与收缩和运动功能 肌球蛋白和肌动蛋白 细菌的鞭毛和纤毛蛋白 3 保护和支持功能 结缔组织和骨骼中的胶原蛋白2 特殊生物学功能1 催化功能 生物催化剂2 运输功能 红细胞运输O2 CO2要靠Hb 脂类运输需要载脂蛋白 10 3 防御功能 抗体 溶菌酶 肠道等分泌的 粘蛋白等4 信息传递功能 起接受和传递信息作用的受体蛋白等5 调节和调控功能 激素 调节因子3 储存和营养功能蛋中的卵清蛋白 乳中的酪蛋白 小麦种子中的麦醇溶蛋白等4 氧化供能 11 第二节氨基酸的结构 分类和性质 一 氨基酸的结构通式二 20种普通氨基酸的结构式三 氨基酸的种类四 氨基酸的理化性质 12 Sidechain Aminogroup Carboxylicacid 一 氨基酸的结构通式 13 14 15 二 20种普通氨基酸 commonaminoacids 的结构 一 根据酸碱性分类 酸性氨基酸 2个 COOH 1个 NH2AspGlu碱性氨基酸 1个 COOH 2个碱性基团 氨基 胍基 咪唑基 LysArgHis中性氨基酸 1个 COOH 1个 NH2 15种 极性中性氨基酸和非极性中性氨基酸 16 非极性中性 脂肪族R基团 17 甘氨酸 Gly G 唯一无手性碳原子的氨基酸无镜象立体异构体直接和四个不相同的原子或原子团相连的碳原子 18 丙氨酸 Alanine Ala A R基团 甲基 accountingfor7 8 oftheprimarystructureinasampleof1 150proteins 19 脯氨酸 proline Pro P 亚氨基酸侧链R同时与Ca原子及氨基相连itisoftenfoundin turns ofproteins 吡咯烷基 a 羧酸 20 缬氨酸 Valine Val V branched chainaminoacidessentialaminoacid 21 亮氨酸 Leucine Leu L 异丁基 isobutyl branched chainaminoacidessentialaminoacid 22 异亮氨酸 Isoleucine Ile I 有两个手性碳原子branched chainaminoacidessentialaminoacid 23 蛋氨酸 甲硫氨酸 Methionine Met M 侧链含甲硫基 甲基硫醚基 essentialaminoacidanintermediateinthebiosynthesis 24 芳香族R基团氨基酸 25 芳香族R基团氨基酸 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F a 氨基 苯丙酸苯甲基 benzyl EAA 26 芳香族R基团氨基酸 酪氨酸tyrosineTyr Y EAAasareceiverofphosphategroupsa 氨基 对羟基苯丙酸 中性极性AA 羟基是活性基团 OH asareceiverofphosphategroups 27 芳香族R基团氨基酸 色氨酸 TryptophanTrp W 亚甲基与吲哚环相连EAA 28 极性中性R基团 29 极性中性R基团 丝氨酸 Serine Ser S 羟甲基 30 苏氨酸 Threonine Thr T 有两个手性碳原子EAAItissusceptibletonumerousposttranslationalmodifications 极性中性R基团 羟基为活性基团 31 半胱氨酸 Cysteine Cys C 极性中性R基团 亚甲基连接一个巯基强还原性 32 极性非带电R基团 天冬酰胺Asparagine Asn N 甲酰胺基 carboxamide 33 极性非带电R基团 谷氨酰胺 Glutamine Gln Q 34 碱性氨基酸 带正电R基团 35 赖氨酸 Lysine Lys K 侧链连接一个氨基 为碱性氨基酸EAA 碱性氨基酸 36 精氨酸 Arg R 含胍基 碱性氨基酸 碱性氨基酸 37 组氨酸 His H 含咪唑基 碱性氨基酸EAA 碱性氨基酸 38 酸性氨基酸 带负电R基团 天冬氨酸 Asp D 酸性氨基酸 谷氨酸 Glu E 酸性氨基酸 39 40 41 二 R侧链的特殊性及其作用 1 Tyr Ser Thr OH 蛋白质的活性部位 2 Leu Ile Val Met等 侧链是较大 疏水力 3 Pro 杂环 构象的灵活性差 4 Phe Trp Tyr 257nm 280nm 276nm 42 5 两Cys残基的巯基可以形成二硫键 对形成和稳定Protein的特定结构起着重要的作用 43 6 Tyr Cys Asp Glu His Lys和Arg带有离子化的侧链 可以接受或提供质子 7 Asn Gln Ser Thr Tyr 侧链可以参与形成氢键 44 三 氨基酸的种类 已发现500多种1 标准氨基酸 proteinogenicorstandardaminoacids 合成蛋白质的22 23 种AA20种通用密码子编码的氨基酸Selenocysteine 硒代半胱氨酸 密码子UGAPyrrolysine 吡咯赖氨酸 密码子UAGN Formylmethionine N 甲酰蛋氨酸 起始密码子AUG 45 硒代半胱氨酸 Selenocysteine Sec U R 2 胺基 3 氢硒基丙酸 46 吡咯赖氨酸 Pyrrolysine Pyl O 47 N 甲酰蛋氨酸 N Formylmethionine fMet 48 selenocysteineandpyrrolysine areincorporatedintoproteinsbyuniquesyntheticmechanisms SelenocysteineisincorporatedwhenthemRNAbeingtranslatedincludesaSECISelement whichcausestheUGAcodontoencodeselenocysteineinsteadofastopcodon Pyrrolysineisusedbysomemethanogenicarchaeainenzymesthattheyusetoproducemethane ItiscodedforwiththecodonUAG whichisnormallyastopcodoninotherorganisms ThisUAGcodonisfollowedbyaPYLISdownstreamsequence N Formylmethionine fMet isaproteinogenicaminoacid Itisaderivativeoftheaminoacidmethionineinwhichaformylgrouphasbeenaddedtotheaminogroup 49 2 修饰氨基酸 稀有氨基酸 蛋白质合成后 氨基酸残基的某些基团被修饰后形成的氨基酸 没有相应的密码子修饰方式 甲基化 乙酰化 羟基化 羧基化 磷酸化等 如 4 羟脯氨基酸 5 羟赖氨酸 50 胶原蛋白中 4 羟脯氨基酸 51 胶原蛋白中 5 羟赖氨酸 52 肌球蛋白 6 N 甲基赖氨酸 53 凝血酶原 54 3 非蛋白质氨基酸既不是合成氨基酸的原料 也不是蛋白质的水解产物 D 氨基酸 或 氨基酸瓜氨酸 鸟氨酸 同型半胱氨酸等 55 四 氨基酸的理化性质 一 兼性离子形式 二 两性性质和等电点 三 其他理化性质 56 一 两性解离和等电点 1 两性电解质 既能接受质子 碱 又能释放质子 酸 2 等电点 pI 使氨基酸离解成阳性离子和阴性离子的趋势和程度相等 总带电荷为零 呈电中性 时的溶液pH值 57 兼性离子形式 58 中性氨基酸的pI等于a 羧基和a 氨基解离常数负对数和的一半pI 1 2 pK 1 pK 2 59 酸性氨基酸的pI 60 碱性氨基酸的pI 61 62 3 氨基酸在不同pH溶液中的带电情况溶液pHpI 氨基酸带负电荷 在电泳时向正极运动 63 二 其他理化性质 1 旋光性 能使偏振光振动平面旋转2 构型 具有手性碳原子化合物的空间构象CAR走向 逆时针 L 64 65 66 3 紫外吸收性质三种氨基酸 Trp Tyr Phe 280nm 67 68 69 4 茚三酮反应 氨基酸 水合茚三酮氨 还原茚三酮 CO2氨 还原茚三酮 水合茚三酮蓝紫色物质 3H2OProline orange yellowcolour 弱酸 共热 70 第三节蛋白质的结构 71 一 肽键和肽链 一 肽键 二 肽链 72 一 肽键 1 肽键 peptidebond 合成肽链时 前一个氨基酸的 羧基与下一个氨基酸的 氨基通过脱水作用形成的酰胺键 73 74 2 肽键的刚性 肽键具有部分双键性质酰胺氮 含 孤对电子和羰基产生共振相互作用 形成共振杂化体 75 3 肽键平面 酰胺平面 参与肽键的六个原子位于同一平面 不能自由转动 称为肽平面 76 二 肽链 peptidechain 肽链 许多氨基酸通过肽键连接在一起形成的长链 即多肽链的主链 mainchain 77 方向性 N端 氨基端 和C端 羧基端 氨基酸残基 aminoacidresidue重复单位 N Ca C肽链有形成氢键的倾向 78 79 二 寡肽 多肽和蛋白质 一 相关概念肽 peptide 氨基酸通过肽键连接形成的产物1 寡肽 oligopeptide 10AA谷胱甘肽 3肽 还原剂促甲状腺释放激素 3肽血管加压素 催产素 垂体后叶 9肽脑啡肽 为神经肽 5肽 80 谷胱甘肽 glutathione GSH 结构 81 Glu Cys和Gly组成的三肽Glu的 羧基参与形成肽键 SH为活性基团 82 GSH过氧化物酶 GSH还原酶 NADPH H NADP 主要功能 是体内重要的还原剂 83 2 多肽 polypeptide 10AA50AA天然的多肽链一般在50 200AA27 000AA 肌联蛋白 84 三 蛋白质的结构 85 86 一 一级结构 Primarystructure 1概念是指多肽链从N端到C端的氨基残基种类 数量和顺序 2 主要的化学键 肽键 二硫键3 由遗传物质DNA分子上相应核苷酸序列即遗传密码决定的 87 6 10 7 7 19 20 88 二 二级结构 Secondarystructure 1 定义是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构 即蛋白质主链原子的局部空间排布 不涉及侧链原子的位置 89 2 二级结构的主要类型 螺旋 helix 片层 折叠 pleatedsheet 转角 turn 无规则卷曲 randomcoil 螺旋 helix 维持二级结构的化学键 氢键 90 91 1 螺旋 多肽链主链的一段 肽段 从N端到C端形成顺时针方向的右手螺旋结构 92 结构要点 多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋 侧链伸向螺旋外侧 每圈螺旋含3 6个氨基酸残基 13个原子 螺距为0 54nm每个肽键的亚氨氢 N H 和它前面 earlier 的第四个肽键的羰基氧 C O 形成氢键 氢键方向与螺旋长轴基本平行 93 94 氨基酸残基R侧链在螺旋外侧 95 Pro很少在该二级结构中出现 相邻氨基酸残基带有相同电荷时会影响 螺旋的稳定 多聚赖氨酸 pH7 0 pH12 0 常见于肌红蛋白 血红蛋白 胶原蛋白 跨膜蛋白 角蛋白中 96 2 片层 折叠 pleatedsheetstructure 常见于脂肪蛋白 丝心蛋白 无弹性 97 2 数个肽段平行或反向平行聚积在一起 肽段之间走向可以相同或相反 98 相邻肽段之间经C O与N H间形成的氢键来维系 氢键方向与肽链长轴方向相垂直 99 肽链充分伸展 相邻肽键平面略呈锯齿状侧链交错位于片层的上下两侧 100 每个肽段以C 为旋转点 101 3 转角 turn 指肽链出现180 左右转向回折形成的 U 形有规律的二级结构单元 含4个氨基酸残基 第一个氨基酸残基与第四个形成氢键 第二个AA多为Pro球状蛋白质 102 4 螺旋 helix 左手螺旋肽链以4 4个氨基酸残基 18原子 盘旋一圈氢键与螺旋长轴基本平行胶原蛋白 103 5 无规则卷曲 randomcoil 没有确定规律性的肽链结构 104 3 模体 motif 蛋白质分子中 二级结构单元有规则地聚集在一起形成混合或均有的空间构象 又称超二级结构 asupersecondarystructure 和 T 等 105 钙结合蛋白中的钙结合模体 106 锌指结构Twobetastrandswithanalphahelixendfoldedovertobindazincion ImportantinDNAbindingproteins 107 三 三级结构 tertiarystructure 定义 是指整条多肽链中所有氨基酸残基的相对空间位置 肽链上所有原子的相对空间位置 化学健 疏水键和氢键 离子键 范德华力等来维持其空间结构的相对稳定 108 109 8个 螺旋 75 aa 通过转角 Loop或随意卷曲连接 进一步卷曲形成三级结构 多数疏水性AA位于球形结构内部 肌红蛋白 110 111 结构域 domain 蛋白质三级结构中 折叠紧凑 可被分割成独立的球状或纤维状 具有特定功能的区域 称为结构域 结构域通常是几个超二级结构单元的组合 是构成蛋白质三级结构的基本单元 112 Aproteindomainisapartofproteinsequenceandstructurethatcanevolve function pactstructure function foldingautonomously individualhydrophobiccore pyruvatekinase anregulatorydomain an substratebindingdomainandan nucleotidebindingdomain 113 四 四级结构 Quarternarystructure 概念1 蛋白质分子中几条各具独立三级结构的多肽链间相互结集和相互作用 排列形成的更高层次的空间构象 概念2 是指蛋白质分子中各亚基的空间排布和相互作用 亚基 蛋白质分子含有两条或两条以上多肽链 且每一条多肽链都有完整的三级结构 称为亚基 subunit 作用力 亚基间以离子键 氢键 疏水力连接 此外 范德华力 二硫键 如抗体 114 115 亚基数多为偶数亚基为同种或不同种 等命名具四级结构的蛋白质分子 亚基单独存在不具有生物活性 116 117 四 参与蛋白质的正确折叠的几种物质 Proteinfoldingisaveryactiveareaofresearchandiscertainlynotcompletelyunderstood 分子伴侣折叠酶 118 一 分子伴侣 chaperone 定义 一类在序列上没有相关性但有共同功能 在细胞中能够帮助其他多肽链 或核酸 折叠或解折叠 组装或分解的蛋白称为分子伴侣 如热休克蛋白 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开 使新生肽链正确折叠 与错误聚集的肽段结合 诱导其正确折叠 对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用 作用 119 二 折叠酶 定义 催化与折叠直接有关的化学反应的酶 肽酰脯氨酰顺 反异构酶蛋白质二硫键异构酶 催化新生肽链中二硫键的相互转换 保证正确二硫键的形成 120 121 第四节蛋白质分子结构和功能的关系 一 一级结构和功能的关系 一 一级结构是形成高级结构的分子基础 122 例 镰刀形红细胞贫血 二 蛋白质一级结构的改变 可能引起其功能的异常或丧失 分子病 123 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病 称为 分子病 124 三 同功能蛋白质序列的种属差异与保守性 1 蛋白质的活性中心的以及维持构象的氨基酸在不同种属之间的保守性很高 2 同功能蛋白质在种属之间的氨基酸序列差异程度与这些种属在亲缘关系远近大体上平行 125 二 空间结构和功能的关系 一 蛋白质分子的空间结构是其发挥生物学活性的基础 血红蛋白 homoglobin 1 血红蛋白的构象变化与结合氧氧饱和度变构蛋白协同效应 126 肌红蛋白 Mb 和血红蛋白 Hb 的氧解离曲线 127 二 蛋白质分子构象的改变影响生物学功能或导致疾病的发生蛋白质构象病 折叠病 蛋白质一级结构不变 但由于折叠错误 导致蛋白质构象改变而引起的疾病 128 疯牛病朊病毒蛋白 prionprotein PrP 构象改变引起的神经退行性病变 正常的PrP PrPc 富含 螺旋 42 片层仅占3 疯牛病的PrP PrPsc 片层占45 螺旋30 PrPsc相互聚集 形成淀粉样纤维沉淀而致病 PrPc 螺旋 PrPsc 折叠 正常 疯牛病 129 Themajorprionproteinisexpressedinthebrainandseveralothertissues PrPCattachestotheoutersurfaceofthecellmembrane TheabnormalPrPScisoformhasadifferentsecondaryandtertiarystructurefromPrPC butidenticalprimarysequence andisgenerallyquiteresistanttoproteases heat radiation andformalintreatments althoughtheirinfectivitycanbereducedbysuchtreatments Mad cowdiseasecanbetransmittedtohumansbyingestionofbrain spinal ordigestivetracttissueofaninfectedcow 130 疯牛病牛的脑部切片 131 病羊神经组织的海绵状损伤 132 朊病毒的复制 朊病毒的复制模式 A 传染型和散发型的朊病毒复制模式 B 遗传型的朊病毒复制模式 133 第五节蛋白质的理化性质 一 蛋白质的两性电离及等电点二 大分子亲水胶体性质三 蛋白质的变性 denaturation 四 紫外吸收特征五 蛋白质的显色反应六 蛋白质的分子量大小 134 一 蛋白质的两性电离及等电点 1 两性电离 来自侧链 主要 末端 氨基和 羧基 2 等电点 多接近5 0 少数为碱性 胃蛋白酶为酸性 135 二 亲水胶体性质 胶体分子 直径在1 100nm亲水胶体的稳定因素 水化层 分子表面的亲水基团双电层 分子表面的可解离基团 136 三 蛋白质的变性 变性 denaturation 在某些理化因素的作用下 特定的空间结构被破坏而导致其理化性质改变及生物活性丧失的过程 因素 物理 高温 高压 紫外线 化学 强酸碱 有机溶剂 重金属盐 变性的本质 非共价键和二硫键断裂 137 蛋白质的复性 renaturation 在合适的条件下 变性蛋白质分子重新卷曲形成天然空间结构 并恢复其生物活性的过程 多数不可逆 138 应用举例消毒及灭菌 蛋白质制剂 如疫苗等 的有效地保存 139 四 紫外吸收280nm波长下有特征性吸收峰 定量分析五 显色反应茚三酮反应 水解产生的氨基酸双缩脲反应 是蛋白质肽键的特征反应 在稀碱中与硫酸铜共热 生成紫色或红色物质 140 六 蛋白质的分子量大小 变化范围很大 6X103 106通过凝胶过滤层析 凝胶电泳 超离心等方法分离蛋白质混合物 141 第六节蛋白质的分离纯化 一 原理利用不同蛋白质分子的溶解性 solubility 分子大小 size 带电情况 charge 亲和能力 affinityproperty 等的不同 二 原则提取分离过程中防止蛋白质降解或失活 蛋白酶 pH T 142 三 一般程序1 材料的选择 预处理 如匀浆 细胞裂解 2 粗提 crudeextract 透析 盐析 沉淀法等3 精提 层析 电泳 离心4 质量鉴定 酶活力测定 143 四 细胞裂解 Celllysis 细胞裂解是分离纯化蛋白质的第一步根据不同生物 cellwall 不同样品 cellsortissue 细胞类型 celltypes 亚细胞结构 subcellularstructures 或特殊蛋白 specificproteins 来选择合适的裂解方法 一 裂解方法1 物理方法 匀浆法或声波降解法缺点 需要较多的样品 不能很好提取膜蛋白2 试剂裂解法 reagent basedlysis usedifferentbuffers detergents saltsandreducingagents 即可裂解细胞 还可以提高蛋白质的溶解性 144 二 防止蛋白质降解和被修饰细胞中含内源性的蛋白酶和磷酸酶等 endogenousproteasesandphosphatases 加入酶抑制剂 proteaseand orphosphataseinhibitors 抑制酶活性 三 保护蛋白的稳定性和功能试剂成分 如detergent 可能破坏酶活 后续分析过程中除去 145 四 蛋白成分的去除和富集 DepletionandEnrichment 1 蛋白成分的去除目的 除去高含量的蛋白质或分离出目的蛋白high abundanceproteinscanmaskdetectionofthosefromlow abundanceproteins Depletionstrategiesutilizeimmunoaffinitytechniquessuchasimmunoprecipitationandco immunoprecipitation缺点 drawback 高含量蛋白可能和待研究的低含量蛋白结合在一起 2 富集亲和层析等分离特定细胞器 Separationofdistinctsubcellularfractions 来富集目的蛋白 146 五 蛋白质的分离纯化技术 一 粗提方法1 透析 Dialysis 透析袋去除小分子物质去除带电离子 盐分 钠盐和磷酸盐 2 盐析溶液中加入无机盐类而使蛋白质溶解度降低而析出的过程3 有机溶剂沉淀 丙酮 乙醇等 预冷 4 免疫沉淀法 抗原 抗体复合物 147 透析 148 二 精提方法 一 层析法1 凝胶过虑层析 2 离子交换层析 3 亲和层析 149 1 凝胶过滤层析 分子筛 原理 分子大小和形状不同固定相 多孔的凝胶珠 150 151 2 离子交换层析 原理 在一定pH条件下蛋白质分子所带电荷不同固定相 树脂颗粒 表面阳离子 阴离子交换树脂表面阴离子 阳离子交换树脂 152 表面阳离子 阴离子交换树脂 resin 表面阴离子 阳离子交换树脂 153 154 155 3 亲和层析 原理 蛋白质与配体间特异的相互作用固定相 共价连接有配体的惰性基质如 抗体 抗原激素 受体酶 底物 156 157 高压液相层析 基质株更小 孔径更均一 基质填充更致密 158 二 电泳法 蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒 在电场中能向正极或负极移动 薄膜电泳凝胶电泳 159 薄膜电泳 160 1 SDS PAGE电泳2 等电聚焦电泳3 双向电泳 161 1 SDS PAGE电泳 162 SDS PAGE SDS 十二烷基硫酸钠 阴离子去污剂PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤 破坏二硫键加入SDS上样电泳染色回收原理 多肽链的迁移率与其分子量的对数成反比作图 标准蛋白分子量对数 迁移率 线性 163 164 165 原理 基于蛋白质分子大小以及形状不同载体 聚丙烯酰胺凝胶 166 Themigrationofaproteininagelduringelectrophoresisisthereforeafunctionofitssizeanditsshape SDSbindstomostproteinsinamountsroughlyproportionaltothemolecularweightoftheprotein aboutonemoleculeofSDSforeverytwoaminoacidresidues TheboundSDScontributesalargenetnegativecharge renderingtheintrinsicchargeoftheproteininsignificantandconferringoneachproteinasimilarcharge to massratio Inaddition thenativeconformationofaproteinisalteredwhenSDSisbound andmostproteinsassumeasimilarshape ElectrophoresisinthepresenceofSDSthereforeseparatesproteinsalmostexclusivelyonthebasisofmass molecularweight withsmallerpolypeptidesmigratingmorerapidly 167 染色 Staining 银染蛋白质中各种基团 如琉基 碳基等 与银结合显色 检测极限是2 5 0ng 蛋白条带染料染色如考马斯亮蓝Coomassieblue 三苯甲烷类染料 可与蛋白质形成较强的非共价复合体 168 169 2 等电聚焦 Isoelectricfocusing 等电聚焦 根据两性电解质等电点的不同来分离不同物质的方法 170 171 172 3 双向电泳 two dimensionalgelelectrophoresis 等电聚焦 pI不同基质 pH不同的凝胶柱双向电泳 将等电聚焦技术和SDS PAGE技术结合起来 173 174 175 三 离心法 速率区带离心 密度梯度离心 原理 不同颗粒之间存在沉降系数差时 在一定离心力作用下 颗粒各自以一定速度沉降 在密度梯度不同区域上形成区带的方法 176 速率区带离心法 管口到管底密度逐步升高 177 178 第七节氨基酸顺序测定 Sanger法1953年测定胰岛素的氨基酸顺序 179 氨基酸序列测定步骤 1 确定蛋白质分子中多肽链的数目2 拆分并分离多肽链3 分析每条肽链的氨基酸组成测定4 每条肽链中氨基酸连接顺序 1 肽链末端氨基酸残基的测定 2 断裂多肽链并分离各肽段 3 测定各肽段的氨基酸顺序 4 确定每个肽段在多肽链中的位置 180 一 多肽链数目的确定 1 原理 确定N末端 或C末端 残基2 方法 二硝基氟苯法 DNP法 Sanger试剂 N末端 丹磺酰氯法 DNS 强荧光剂 N 端