试验原理乙醇沉淀ppt课件.ppt

1 碱裂解法小量提取质粒DNA 2 碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法 其优点是收获率高 适于多数的菌株 所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作 3 实验原理 溶液I GTE50mM葡萄糖 增加溶液的粘稠度 使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 25mMTris Cl pH8 0 10mMEDTA 是Ca2 和Mg2 等二价金属离子的螯合剂 可抑制DNase的活性 并抑制微生物生长 4 实验原理 溶液II NaOH SDS溶液0 2NNaOH 是最佳的溶解细胞的试剂 不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解 这是由于细胞膜发生了从bilayer 双层膜 结构向micelle 微囊 结构的相变化所导致 由于质粒和细菌染色体的拓扑结构不同 变性时前者虽然两条链分离 却仍然缠绕在一起不分开 但后者完全变性分甚至出现断裂 因此 在裂解细菌时要注意 第一 时间不能过长 因为在这样的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂 第二 混合必须轻柔 不然DNA也会断裂 1 SDS 十二烷基磺酸钠 是一种阴离子表面活性剂 它既能使细菌细胞裂解 又能使一些蛋白质变性 5 实验原理 溶液III 醋酸钾溶液 Ph4 8当加入pH4 8的酸性乙酸钾降低溶液pH值 使溶液pH值恢复较低的近中性水平时 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构 但是主染色体DNA则难以复性 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾 potassiumdodecylsulfate PDS 而PDS是不溶于水的 而高浓度的盐使得沉淀更完全 SDS极易和蛋白质结合 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子 钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 同时 尽管SDS并不与DNA分子结合 由于大肠杆菌的基因组DNA很长 很容易和变性的蛋白质缠绕在一起 在离心时 大部分主染色体与细胞碎片 变性蛋白质等缠绕一起被沉淀 而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中 6 实验原理 酚 氯仿抽提可以通过酚 氯仿抽提去除残留的蛋白质 酚和氯仿都是蛋白质的变性剂 但酚的变性作用要远大于氯仿 由于酚能溶解10 15 的水 因此在使用前要用Tris溶液饱和 以免减少抽提过程中DNA溶液的损失 水饱和酚的比重略比水重 碰到高浓度的盐溶液 离心后酚相会跑到上层 不利于含质粒的水相的回收 氯仿和酚可以互溶 加入氯仿后可以增加比重 使得酚 氯仿始终在下层 方便水相的回收 由于酚与水有很大的互溶性 用酚 氯仿抽提后会有少量的酚溶解到水相中 而酚会抑制很多酶反应 比如限制性酶切反应 用氯仿抽提一次将水相中的酚去除 7 实验原理 乙醇沉淀DNA回收后的水相含有足够多的盐 因此只要加入2倍体积的乙醇 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来 在pH为8左右的溶液中 DNA分子是带负电荷的 乙醇可以消除核酸的水化层 使带负电荷的磷酸基团暴露出来 Na离子能与这些带电基团结合 在沉淀形成的部位降低多核苷酸链之间的排斥作用 易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀 最常用的盐是醋酸铵 氯化锂 氯化钠 醋酸钠 沉淀体系如果盐浓度高 应在室温下沉淀 放到 20 时间一长反而会导致大量盐的沉淀 为了去除随DNA沉淀的盐 可用70 的乙醇洗涤沉淀 8 实验原理 DNA的溶解DNA沉淀经过70 的乙醇洗涤后 在实验台上敞口放置一定时间 使残余乙醇挥发掉 当DNA沉淀仍有些潮湿的时候 用适当缓冲液溶解便可溶得快速而且完全 完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且效率较低 得到的质粒样品一般用含RNase 20ug ml 的TE缓冲液进行溶解 不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的 9 实验步骤 取1 5ml过夜培养菌置于1 5ml离心管中 于微量离心机上以12000rpm离心1min 弃上清液 重复步骤1 2 短暂离心后 尽量吸干上清液 沉淀中加100 l溶液I 充分悬浮沉淀 用移液体器吹打悬浮或剧烈振荡 加入200 l溶液II 新鲜配置 加盖后缓慢颠倒离心管6次混匀 千万不要振荡 室温防置不超过5min 加入150 l预冷溶液III 缓慢颠倒6次混匀 置于冰浴15min 10 实验步骤 微量离心机上以4 12000rpm离心10min 将上清液转移到另一新的1 5ml离心管中 加入等体积酚 氯仿 1 1 震荡1min 12000rpm 离心5min 小心转移上层溶液至一新的离心管 弃去中层的蛋白质和下层的有机相 加入等体积氯仿 震荡1min 12000rpm 离心5min 11 实验步骤 小心转移上层溶液至一新的离心管 加入2倍体积100 乙醇 混匀 室温放置15min 12000g 10min 去上清 用0 5ml70 乙醇淋洗沉淀 不要把沉淀悬浮起来 12000g 30秒 尽量去上清 在室温下晾干沉淀 加入50 lTE缓冲液 PH8 0 含20 g mlRNaseA 溶解质粒DNA 80 温育20min 20 保存 12 一 请完成实验报告 报告内容 1 课件中的全部实验原理及实验步骤2