（发酵工程专业论文）微生物细胞非水相催化羰基化合物的不对称还原.pdf

江南大学博士学位论文中文摘要 摘要 在许多领域中，尤其是在药物工业领域，获得单一对映体纯的手性化合物是非常必 要的。具有光学活性的卤代d 一羟基酯和1 一苯乙醇衍生物是合成多种手性药物和其他生物 活性化合物的重要砌块。结合非水相生物催化的优势利用微生物细胞催化不对称还原羰 基化合物可以有效地制各这些手性醇。 建立了用气相色谱法测定手性醇对映体纯度的方法。用p 一环糊精( p c d ) 手性固 定相在气相色谱上分离了乙酰化的4 一氯一3 一羟基丁酸乙酯，考察了色谱条件对分离的影 响。然后拆分了各种外消旋醇，测定并计算热力学数据。结果表明，载气流速、柱温、 程序升温速率、起始温度维持时间和进样量对对映体在b c d 上的分离有明显影响；芳 基醇无需衍生化普遍能得到较好的分离，b c d 固定相对芳基醇的手性识别明显要优于 直链羟基酸酯。通过热力学数据的分析认为，色谱分离过程中存在焓一熵补偿，这些化 合物在b c d 固定相上的拆分机理是基本一致的。 考察了有机溶剂对微生物细胞的毒性。不同有机溶剂对出芽短梗霉g c m c c1 2 4 4 细胞的毒性各异，毒性大小与疏水性参数l o g 尸存在相关性，l o g 尸从3 到5 是有机溶剂 对出芽短梗霉细胞有毒到无毒的过渡区；海藻酸钙细胞固定化可以减少有机溶剂对其的 毒害作用；不同生长阶段的微生物细胞对有机溶剂的毒性反应不同，快速生长期( 1 2h ) 的细胞较敏感。同一有机溶剂对枯草芽孢杆菌的毒性比出芽短梗霉和酵母要小，后两种 微生物的毒性反应相近。 在水有机溶剂两相体系中用出芽短梗霉g c m c c1 2 4 4 细胞催化4 一氯乙酰乙酸乙酯 ( c o b e ) 制备一4 一氯一3 一羟基丁酸乙酯( c h b e ) 。c h b e 在水溶液中比较稳定，而c o b e 容易被分解：两者对微生物细胞都有毒害作用，其中c o b e 的毒性要大于c h b e ；邻苯 二甲酸二丁酯是组成水，有机溶剂两相体系的最适有机相，在两相体系中可获得较高的摩 尔转化率、光学纯度和产物在有机相中的浓度。通过考察各种影响因素如相体积比、振 摇速度、生物量底物量比、温度以及p h 发现，这些因素对反应的摩尔转化率和反应初 速度有明显影响，但对产物的光学纯度的影响很小。经过条件优化后，有机相产物浓度 可以达到5 8 2g ，l ，总摩尔转化率可以达到9 3 2 ，光学纯度大于9 7 e e ：固定化细胞 反复利用不理想，c o b e 还原酶活力的损失并不是最主要的原因，而主要是因为固定化 细胞经过反应后脱氢酶活力和还原酶的辅酶浓度大幅下降的缘故，影响了辅酶再生。 筛选得到一株能高立体选择地催化还原t f a a e 的菌株s 口c c _ 1 日m f ”y c e s 聊口r ms w 5 8 ，在水邻苯二甲酸二丁酯两相体系中可以得到较好的结果，优化条件下，摩尔转化率 和产物的光学纯度分别可达8 5 1 和8 5 4 e e ：添加合适的共底物、丙稀基溴处理细 胞和用冻干细胞可以改善反应的立体选择性，细胞热处理对反应不利。 用4 种微生物分别在水相体系和水，有机溶剂两相体系催化还原了1 0 种苯烷酮化合 江南大学博士学位论文 中文摘要 物。假丝酵母s w 0 4 0 1 表现出很强的还原活力，l o 个底物被还原均有相应的产物醇生成， 但立体选择性不高，酿酒酵母s w 5 7 对苯烷酮表现出普遍较高的立体选择性，这两种酵 母催化苯乙酮还原反应遵循了p r e l o g 规则。而在两相体系中出芽短梗霉s w 0 2 0 2 催化苯 乙酮衍生物的不对称还原反应遵循反p r e l o g 规则。朱红密孔菌c g m c c1 1 1 5 的还原能 力很低，仅能还原5 种苯烷酮。苯烷酮苯环上取代基的电负性和结构能影响还原反应难 易程度，取代基电负性强的容易被还原，取代基疏水性大不利于被还原：在水邻苯二甲 酸二丁酯两相体系中考察了酿酒酵母s w 5 7 催化还原2 一氯苯乙酮，乙醇是较理想的辅助 底物，其水相浓度以3 0g ，l 为宜。还原反应的最适p h 、温度和机相初始底物浓度分别 为7o 、3 0 和1 2 0m m o l ；在上述最优条件下还原反应3 2h 得到6 8 6 的摩尔转化率和 9 2 2 e 息产物的光学纯度。 关键词：非水相生物催化，整细胞催化，羰基化合物，不对称还原，手性醇 水有机溶剂两相体系。 江南大学博士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t i ti sn e c e s s a r yt oo b t a i ne n a n t i o m e r i cp u r i t yc o m p o u n d si nm a n yf i e l d s ，e s p e c i a l l yi n p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y t h eo p t i c a l l y a c t i v e h a l o p h y d r o x y e s t e r s a n d 1 一p h e n y l e t h a n o l d e r i v a t i v e sa r ev e r yi m p o r t a l l t b u i l d i n gb l o c k sf o ru s ei ns y n t h e s i so fm a n yc h i r a ld r u g sa n d o t h e rb j o a c t i v ec o m p o u n d s c o m b i n j n gm ea d v a j l t a g e so fb j o c a t a j y s j si nn o n a q u e o u sm e d j a ， a s y m m e m cr e d u c t i o no fc o r r e s p o n d i n gc a r b o n y lc o m p o u n d su s i n gm i c r o b i a lc e l l si sa n e 衔c i e n tm e m o dt op r o d u c et h e s ec h i r a la l c o h o l s t h ea 1 1 a l ”i cm e t l l o d sf o rd e t e r m i n i n ge n a j l t i o m e “cp u r i t yo fc h i r a l a l c 0 1 0 l sw e r e e s t a b l i s h e da c e t y l a t e de t i y l4 一c h l o r o - 3 - h y d r o x y b u t a n o a t ew a ss e p a r a t e do np c y c l o d e x t r i n ( p c d ) c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ei ng a sc h r o m a t o g r a p h y e f f e c t so fd i 丘 e r e n tc o n d i t i o n so nt 1 1 e r e s o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h e nv 撕o u sr a c e m i ca l c o h o l sw e r es e p a r a t e da i l d 血e i r t h e m o d y n 锄i cd a t aw e r ed e t e r n l i n e d 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef a c t o r ss u c ha sv e l o c i t yo f c 枷e rg a s ，c o l u 舢t e m p e r a t u r e ，m t eo fp m g r a m m e dt e m p e r a t u r e ，t i m eo fi n i t i a l l ym a i n t a i n e d t e m p e r a t u r ea n di n j e c t e ds 锄p l e 锄o u n t 、v e r er e m 玳d b l yi n n u e n c e d 血er e 0 1 u t i o n t h ea r y l a l c o h 0 1 s 撕t h o u td e r i v a t i z a t i o nh a v ee x c e l l e n tr e s 0 1 u t i o no nt h ep c dc m r a js t a t i o n a r yp h a s e ， a j l dt 1 1 er e c o g n i t i o no fp c dt om ea r y la l c o h o l sw a ss t r o n g e rt 1 1 a nt 1 a tt ot l l ea l i p h a t i c h y d r o x y e s t e r s a n a l y s i s o ft l e r m o d y n 锄i cd a 诅i n d i c a t e dt h a ta n e n m a l p y e n t r o p y c o m p e n s a t i o ne 丘宅c te x i s t sw i t h i l lt 1 1 e s ea l c o h o l s a c c o r d i n 9 1y t h em e c h a l l i s mo fr e s 0 1 u t i o n t h ea l c o h 0 1 so nb c dw a si d e n t i c a l t o x i c i t yo fv a r i o u so 唱a 1 1 i cs o l v e n t st om i c r o b i a lc e l l sw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tm e r ee x i s t sac o r r e l a t i o nb e t w e e nt o x i c 时t o4 舭0 6 娜胁“mp “f f “抽mg c m c c 12 4 4c e l l sa i l dl o g po fo r g a l l i cs o l v e n ta n dt h et r a j l s i t i o nb e t 、v e e nt o x i ca j l dn o n t o x i cs o l v e n t s w a so b s e r v e di nt 1 1 el o g pm g e 打o m3t o5 t h et o x i c i t yo fo r g a i l i cs o l v e n td e c r e a s e da f t e rt l l e c e l l sw e r ei m m o b i l i z e di nc a l c i u ma l g i n a t e m i c r o b i a lc e l l si nd i 行色r e m 掣o w t hp h a s eh a v e d i f i e r e m l yt o x i cr e s p o n s et oo 唱a 1 1 i cs o l v e ma i l dm et o x i c i t yo fo r g a n i cs 0 1 v e n tt om e c e l l si n r a p i dg r o w mp h a s e ( i n c u b a t e df o r1 2h ) w a sm o r eo b v i o u s 也a n 也a tt o 也ec e l l si no 也e r 酽o w t hp h a s e i tw a sf o u n dm a tt l e r ew a ss i m i l a rt o x i c i t ) ，o fa no r g a n i cs o l v e n tt ob a k e r s y e a s ta i l d 爿舢d 6 珊f 旃“聊p “”肠埘，b u tl e s st o x i c i t yt ob 口c f f 船s “6 r f ，括 a p r o c e s so fa s y m m e t r i cr e d u c t i o no fe t h y l4 一c h l o r o o x o b u t a n o a t e ( c o b e ) t oe t l l y l ( 回一4 一c h l o m 一3 _ h y d r o x y b u t a i l oa _ t e ( c h b e ) c a t a l y z e db y4 “陀0 6 傩击“mp 甜盯甜肠船g c m c c 1 2 4 4m a i la q u e o u s o r g a l l i cs 0 1 v e mb i p h a s i cs y s t e mw a se s t a b l i s h e d i tw a sf o u n d 廿1 a tc h b e w a ss t e a d i e rt 1 1 a i lc o b et 1 1 a tw a se a s yt od e f a d ei nw a t e rc o m a i n i n gm i c r o b i a lc e l l s b o t l l c h b ea i l dc o b ew e r et o x i ct ot h ec e l l s ，a i l dm el a t e rw a sm o r et o x i ct l l a l lt h ef o m e lb y s c r e e n i n go 唱枷cs o l v e n t s ，b u t y l p h t l l a l a t ew a s f o u n dt ob et l em o s ts u i t a b l es o l v e mt ou s ei 1 1 i 江南大学博十学位论文英文摘要 t h eb i p h a s i cs y s t e m h i 曲e rm 0 1 a rc o n v e r s i o n ，o p t i c a lp u r i t ya n dc h b ec o n c e m r a t i o ni n o r g a n i cp h a s ew e r eo b t a i n e di nt h eb i p h a s i cs y s t e m b yi n v e s t i g a t i n ge h e c t so fs e v e 豫lf a c t o r s s u c ha sv o l u m er a t i oo ft h ea q u e o u sp h a s et ot 1 1 eo 唱a n j cp h a s e ，s h a k i n gs p e e d ，r a t i oo f b i o m a s s s u b s t r a t e ，r e a c t i o nt e m p e m t u r ea | l dp ho nt h er e d u c t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h e s e p a r a r n e t e r sc o n s i d e m b l yj n 日u e n c e dt h em o l a rc o n v e r s j o na n dt h ej n “j a jr e a c t i o nr a t e ，b u th a d n os i g n j f i c a n te 丘 e c to nm eo p t i c a lp u t yo ft h ep r o d u c t _ u n d e rm eo p t i m u mc o n d i t i o n st h e m a x i m u mc o n c e n t r a t i o no f ( 固一c h b ei nt h eo 唱a n i cl a y e lt h et o t a lm o l a rc o n v e r s i o na n dt h e o p t i c a lp u r i t yr e a c h e d5 8 2g ，l ，9 3 2 a j l d9 7 7 e e ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t o fr e u s i n gi m m o b i l i z e dc e l l st oc a t a l y z et 量l er e d u c t i o nw e r eu n d e s i r a b l e f o rt h i s ，t h em a i n r e a s o n sw e r en o ti n a c t i v a t i o no fc o b er e d u c t a s e sb u t1 0 s so fd e h y d r o g e n a s ea c t i v i t ya n d c o e n z y m e si n t h er e a c t i o ns y s t e ma r e r r e u s i n gt h ec e l l s ， w h i c hl e a dt o d i 币c u l t l y r e g e n e r a t i n gc o e m 7 m e s am i c r o o r g 撕s m ，曲c c 矗d ，0 f 幔y c 船“v 口r 甜ms w 5 8 ，w a ss c r e e n e dt o c a t a l y z eh i g h l y s t e r e o s e l e c t i v er e d u c t i o no fe t h y l4 ，4 ，4 一t r i n u o 卜3 一o x o b u t a n o a t et oe t h y l ( r ) 一4 ，4 ，4 一t r i f l u o r o - 3 一 h y d r o x y b u t a l l o a t e t h ee x c e l i e n tr e s u i t sw e r eo b t a i n e di na na q u e o u s ，b u t y l p h t h a l a t eb i p h a s i c s y s t e m b yo p t i m i z i n gr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h em o l a rc o n v e r s i o na j l do p t i c a lp u r i t yo ft 1 1 e p r o d u c tr e a c h e d8 5 1 a n d8 5 4 e e ，r e s p e c t i v e l ys t e r e o s e l e c t i v i t yo ft h er e d u c t i o nc o u l d b ei m p r o v e db ya d d i n gs u i t a b l ec o s u b s a t e ，t r e a t i n gm ec e l l sw i t la 1 1 y lb r o m i d eo ru s i n g 1 y o p h i l i z e dc e l l s h o w e v e r ，i t sd i s a d v a j l t a g e o u st o 血er e d u c t i o nw h e nt h ec e l l sw e r eh e a t e d f o u rm i c r o o 唱a n i s m sw e r ee m p l o y e dt oc a t a l y z et 1 1 er e d u c t i o no ft e na r y l a l k a j l o n e si na n a q u e o u sm o n o p h a s ea i l da i la q u e o u s o r g a n i cs o l v e n tb i p h a s i cs y s t e m i tw a sf o u n dm a t c 台蒯砌s p s w 0 4 0 1c o u l dc a t a l y z e da 儿o f t 1 es u b s 打a t e sw i t hh i g hr e d u c t a s ea c t j v 毋b u t 】o w s t e r e o s e i e c t i v i t ys 矗c c 向口m 慢弦p sc 已旭v 括f d es w 5 7w a sf o u n dt ob eh i 曲1 ys t e r e o s e l e c t i v ef o r r e d u c t i o no fp h e n y l a l k a j l o n e s b o t l lo n 击出s p s w 0 4 0 1a 1 1 d 勋c c 矗舢w c 8 5c p 阳v 插f d p s w 5 7g a v ep r o d u c t sf o l l o w i n gt h ep r e l o g sm l e h o w e v e lt 1 1 e r e d u c t i o nc a t a l y z e db y 爿甜旭d 6 哪f 讲“卅 p “f ，“，d ”5 g c m c c1 2 4 4i n a q u e o u s - b u t y l p h t h a l a t eb i p h a s i cs y s t e m a n t i p r e l o g sn 1 1 et h em o l d ，砂c 胛印d ，淞c f 玎门口施加搬c g m c c1 l15 ，c o u l do n l yr e d u c ef l v e s u b s t r a t e sa n ds h o w e dl o w e rr e d u c t a s ea c t i v i t y t h ee l e c 订o n e g a t i v i t i e sa n ds t n j c t u r e so f s u b s i t i j e n t si nt h ea r o m a t i cr i n gi n n u e n c e dt h er e d u c t i o n t h er e d u c t i o no ft h ea r y l a l k a n o n e w a sp r o m o t e db yt 1 1 eh i g h e re l e c t r o n e g a t i v i t i e so fs u b s i t u e n t sa 1 1 dw a sw e a k e nb yt 1 1 eh i g h e r h y d r o p h o b i c i t y a d d i t i o n a l l y ，t h e r e d u c t i o no f 2 一c h l o r o p h e n o n eu s i n g - c c 向口，。，砂c g s c e 陀v 括f 日已s w 5 7i na q u e o u s b u t y l p h t l l a l a t eb i p h a s i cs y s t e mw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s s h o w e d 山a tt h em o s ts u i t a b l ec o s u b s t r a t ew a se t h a n o la f l dt l eo p t i m a lp h ，t e m p e r a t l l r ea j l d i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ei no r g a j l i cp h a s ew e r e7o ，3 0 。ca n d12 0m m o lr e s p e c t i v e l y a r e rr e d u c t i o nf o r3 2u n d e rt 1 1 eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，6 8 6 o fm o l a rc o n v e r s i o na n d9 22 e e v j ! 堕查! ! ! 壁兰垡笙苎 茎苎塑蔓 o f o p t i c a lp u r i t yo f ( 月) 一2 一c h l o r o 一1 一p h e n y l e t h a 力o jw e r ea n a j n e d j r 叫h r 出? b i o c a t a l y s i si nn o n a q u e o u sm e d i a ，w h 0 1 e - c e l lb i o c a t a l y s i s ，c a r b o n y lc o m p o u n d s ， a s y m m e t r i cr e d u c t i o n ，c h i r a la l c o h o l ，a na q u e o u s o r g a n i cs o l v e n tb i p h a s i cs y s t e m v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：“年? 月乒日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：题墨邀签名：幽奎拯 导师签名： 日期：文印( 7 年? 月弘日 第一章绪论第l 3 0 页 1 1 关于不对称合成 第一章绪论 1 1 1 手性和手性的意义 术语“手性”( c h i r a j 时) 是根据人的左右手不能相互重叠而来的。手性是指物体的 一种不对性，如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称为手性物体。这两种互为镜 像的形态被称为对映体。 周围的世界是手性的，生物体的生命活动是与手性密切相关的。构成生命体系的生 物大分子如蛋白质、多糖、核酸和酶等几乎都是手性的。机体的代谢和功能调控过程所 涉及的物质酶和细胞表面受体均具有手性。在人和其他生物体的复杂手性环境中，分子 之间严格的手性匹配是分子识别的基础。如酶对底物、区域、位点和对映体的高度选择， 抗原和抗体的免疫识别，受体和给体的专一作用，药物手性与其生物的应答关系如药物 在体内的吸收、转运、组织分配、与靶点的作用以及代谢和消除都可能有重要影响，直 接关系到药物的药理作用、临床效果、毒副作用、发挥药效时间和药效持续时间等【1 1 。 目前所用的药物很大一部分也具有手性，其对映体在人体内药理活性、代谢过程和毒性 有着显著的差异。药物的手性问题己成为药物研究和开发的关键问题之一。 手性化合物除在药物中的应用外，在其他领域也有广泛的应用。在许多杀虫剂、杀 菌剂、昆虫信息素中，只有特定的对映体具有生物活性。在香料和食品添加剂中，对映 异构体之间表现出不同的性质，如l 一( 一) 一薄荷醇有薄荷的香味，而其对映体d 一( + ) 一薄荷 醇则有发霉味；( 一天冬酰胺是甜的，而其对映体( r ) 一天冬酰胺是苦的。此外在“靶”性 化和物、半导体有机材料、导电有机材料、液晶以及非线性光学材料中手性化合物有较 多的应用j 。 因此，研究单一对映体手性化合物具有重要意义。 1 1 2 不对称合成制备手性化合物 手性化合物的制各方法主要包括手性源合成法、外消旋体的拆分和不对称合成。其 中，手性源合成法是以天然的手性化合物为原料，经过构型保留、构型转化或手性转换 等反应，可以获得新的目的手性化合物。氨基酸、糖类、羟基酸、萜烯以及生物碱等天 然手性原料来源丰富，光学纯度高，是最常用的手性源。此法在手性合成应用中颇具吸 引力。然而，由于作为手性源的物质种类有限，要合成各种目的手性化合物有一定难度， 而且往往合成步骤繁多，合成收率低，制备成本高。外消旋体的拆分是最传统、应用和 研究广泛的制备手性化合物的方法，但是，如果仅是一种光学对映体是有用的，而另一 对映体往往因无用或无法消旋化回收再利用而被丢弃，从制备的角度来看，也是一项费 l 江南大学博士学位论文 微生物细胞非水相催化羰基化合物的不对称还原 时费功的过程。而不对称合成方法也称为手性合成，是指在手性环境中，由潜手性化合 物( 或非手性前体) 出发，用化学方法、生物方法转化为手性产物的方法，包括化学不对 称合成和生物不对称合成。它可以在合成早期构建手性中心，排除非目的对映体，所用 的无手性或潜手性的原料几乎都能转变成单一的所需要的对映异构体。因此它是目前最 有效的、经济的、广泛使用的获得手性化合物的方法之一。近年来催化不对称合成越来 越受国内外研究者的重视，报道的研究成果逐年快速增长，如表1 1 为近十年发表的s c i 论文分布吐 表1 1 催化不对称合成领域s ci 论文的年代分布 t a b j el - lad e c a d ed j 5 t r i b u t j o no f s c ja 九j c j 郫j d v o j v e di dc a t a j y t j c 。s y m 册e t r j cs y n t h e s j s 数十年来有机化学中不对称化学合成方法的发展很快，促进了手性化合物合成工业 的发展。例如金属有机化合物的利用，同种异构体的均相金属催化( m e t a lc a t a l v z e d h o m o g e n o u s ) 、多相金属催化( h e t o r o g e n o u sc a t a l y z e d ) 和相转移催化( p h a s et r a n s f e r c a t a l y s i s ) 以及电化学和光化学技术的应用等。新的手性技术研究，例如“不对称放大” ( a s y i r l r l l e t r i ca r n p i i f i c a t i o n ) 、“手性合成子”( c 1 1 i r a ls y f l t i o n s ) 、“手性助剂”( c h i r “a u x i i i a r i e s ) 等近年也取得了卓著成就。早在上世纪7 0 年代，美国孟山都( m o n s a n t o ) 公司首先采 用不对称催化氢化工业生产l 一多巴。后来，e m e r c k 和a n j ce n i c h e n 等公司分别用不对 称环氧化反应和氢化反应生产抗高血压药物c r o m a k a l i m 、c a r b a p e n e m 及新型甜味剂 a s p a r t 蚴e 的原料l 苯丙氨酸。2 0 0 1 年的诺贝尔化学奖授予了美国孟山都( m o n s a j l t o ) 公司的w s 诺尔斯、斯克里普斯( l aj o l l as c r i p p s ) 研究所的k b 夏普利斯和日本名古 屋大学( n a g o y au n i v e r s i t y ) 的野依良治三位化学家，以表彰诺尔斯、野依良治在手性 催化氢化合成反应和夏普利斯在手性催化氧化合成反应方面作出的卓越贡献【4j 。 在过去的近3 0 年中，手性金属配合物催化取得了长足的进步，成千上万个手性配体 及催化剂己被合成和报道，发展了众多的不对称催化反应和方法，并应用到工业生产手 性药物或其重要的手性中间体。表1 2 中列出了一些已用于工业化生产的化学催化不对称 合成反应【5 】o 但总的来看不对称化学合成方法也有一定难度，反应步数较多，要使用价昂的对映 体试剂( 二磷配体与铱、铑、钌的络化物等) 【6 j 。2 0 世纪末生物技术的飞跃发展，也为手性 化合物的工业生产提供了新的途径。利用纯酶或微生物细胞作为催化剂能催化无手性、 第一章绪论第1 3 0 页 表l 一2 一些工业化生产的化学催化不对称合成反应 t a b i el - 2s o m ea s y m m e t r i cs y n t h e t i cr e a c t i o n sc a t a l y z e db yc h e m i c a lc a t a l y s t sf o rp n p a r a t i o no f c h i n lp r o d u c t si ni n d u s t r y 潜手性化合物转变为手性产物，此过程称为生物催化不对称合成。生物催化剂具有优良 的化学选择性、区域选择性和立体选择性，生物催化反应的催化效率高、反应条件温和、 操作简便、成本较低，且能完成一些化学合成难以进行的反应。选择性生物催化不对称 合成已成为合成手性化合物最有意义的方法之一。传统发酵、固定化细胞、固定化酶以 及非水相转化等技术，使选择性生物催化能适用于各种规模的工业生产。从另一角度看， 应用选择性生物催化方法不会产生有毒的副产物，在环境污染问题方面比传统化学合成 方法要小得多，甚至不存在污染问题，对环境是友好的。因此生物催化不对称合成被认 为是合成手性化合物最有前景的方法之一。 生物不对称合成所涉及的生物催化剂主要有裂解酶类、连接酶类、水解酶类、氧化 还原酶类和转移酶等。这些生物催化剂所催化的反应类型有c c 形成反应【7 】、脱羧反 应8 1 、重排反应【9 1 、水( 醇) 解反应【1 0 ，1 、氧化反应【1 2 】、还原反应【1 3 】、酮醇基转移反应【1 4 】 等。可以将化学合成的前体转化为结构复杂的手性醇、酮、醛、胺、酸、酯、酰胺等衍 生物，也可以将含硫、磷、氮、卤素及金属的前体转化为手性化合物。 生物催化不对称合成法与传统化学不对称合成法具有各自的优点和缺陷，两者应相 互取长补短。目前，生物催化的手性合成中一般采用化学酶合成法，即在涉及手性中 心的生成或转化步骤时采用生物催化法，对一般合成步骤则采用有机化学合成法，这样 可以优势互补，以加速手性化合物的合成【l ”。 1 2 关于非水相生物催化 随着现代生物催化技术、特别是非水相酶催化技术突飞猛进的发展，作为生物催化 江南大学博士学位论文 微生物细胞非水相催化羰基化合物的不对称还原 剂的酶已在化工、医药、食品、材料等各个领域获得了越来越广泛的应用，为国民经济 的发展和人民生活的改善发挥了巨大的作用。可以预言，在新的世纪里，面对矿石资源 日益桔竭、环境污染不断加剧的形势，反应条件温和( 常温、常压、中性p h ) 和专一 性强的生物催化过程势必将逐渐取代一些高温高压、强酸强碱、高消耗、重污染以及无 选择性的传统化学工艺，或者替代其中的一个步骤，此可谓“化工过程生物化”或“化 学一生物一体化”。也就是说一个目标产品的合成过程将由化学转化和生物转化两种方法 优化组合而成。由于酶固有的立体专一性，生物催化与生物转化技术特别适用于解决化 学合成的医药和农药中普遍存在的无效、甚至有害对映体的手性转换问题，非水相生物 催化技术的突破则为许多水不溶性底物的生物转化、尤其是人工合成外消旋混合物的对 映选择性反应提供了广阔前景。 1 2 1 非水相酶催化 酶是一种高效的生物催化剂，由酶催化的反应具有高度的选择性、催化效率高、操 作条件温和，对环境友好等优点。但过去长期以来人们一直错误地认为只能在水溶液中 发挥其催化作用，在有机溶剂中酶蛋白会发生构型变化而失活，从而忽略了对高度专一 性生物催化剂的开发和应用；另一方面，大多数有机化合物在水中很难溶解，有些还不 稳定，许多合成反应在水溶液种难以进行，因此化学合成大多使用有机溶剂作为反应介 质，这导致酶催化在有机合成中的应用与发展受到了限制。不过，2 0 世纪8 0 年代初美 国m i t 的科学家z a k s 和i b a l l o v 报道了关于酶在有相介质中催化条件和特点【1 6 ，1 7 j ，他 们的研究表明，酶可以在含有各种有机溶剂和微量水分的非水介质系统中发挥催化作 用，并且所表现出的催化性能( 如活力、选择性、稳定性) 与在常规水溶液介质中的性能 截然不同。这标志着在非水相酶催化领域中的研究取得了突破性进展，极大地拓宽了酶 作为催化剂的应用范围。于是在此后的二十年里，非水相酶催化逐渐被人们重视并进行 了大量卓有成效的研究，使该领域无论在理论上还是实际应用上的研究都得到了蓬勃发 展。 与在水相中相比较，在有机相中酶催化反应具有明显的特点和优势8 ，拇j ：( 1 ) 可进 行水不溶性化合物催化转化，扩大了用于酶催化反应底物的范围：( 2 ) 可改变反应的平 衡点，使水溶液中难以发生的反应向反应所期望的方向进行；( 3 ) 由于酶在有机溶剂中 结构上“刚性”的增加，对底物的专一性，包括区域专一性和对映体专一性均大大提高， 从而有可能对酶催化反应的选择性作有目的调控；( 4 ) 有机溶剂中酶的热力学稳定性和 操作稳定高；( 5 ) 机相酶反应中无微生物污染；( 6 ) 可减少在水相中极易发生的副反应； ( 7 ) 在有机相中对酶的固定化要求不高；( 8 ) 反应后的分离过程能耗降低；( 9 ) 有可 能使酶直接应用于某些化学反应中。 但是，酶在有机相( 微水有机溶剂) 中催化反应的最明显的缺点是其活性要比在水 相中的低，且由于蛋白质易于变性而失活，这已是不争的事实。因此，在设计、优化工 业生物催化的反应介质系统时，我们不应简单地从一个极端( 1 0 0 水) 走向另一个极 d 第一章绪论第l 3 0 页 端( 1 0 0 有机溶剂) ，必须根据反应底物产物和生物催化剂的特性，具体情况具体分析， 不仅可以考虑单纯的水或有机溶剂，也可以考虑水一有机溶剂( 均相或非均相) 或有机 溶剂一有机溶剂的混合溶剂系统( o 1 0 0 ) ，还可以考虑添加表面活性剂或其他助剂的 乳状液( e m u l s i o n ) 或微乳液( m i c m e m u l s i o n ) 系统、超临界流体或气体系统以及最近 兴起研究热潮的离子液体系统，以适应多样性的底物和多样性的生物催化剂对生物转化 介质多样化的必然要求1 2 。 1 2 2 非水相中的微生物整细胞催化 1 2 2 1 概述 许多具有商业应用价值的化合物能通过酶或微生物转化得到，但是大多数化合物的 水溶性差，影响了在水相中的转化效率。而在有机介质中的生物催化已发展成为解决此 类问题的一个有效手段i 2 “。与酶催化相比，微生物活细胞催化有定的优势，它可以避 免酶的分离和提纯，对于需要辅酶参与的反应，微生物细胞所具有的多酶体系能通过代 谢产生与之相匹配的辅酶，从而使催化反应能够顺利完成。与水相中的生物催化相比， 有机溶剂体系中的生物催化具有明显的优势：可以提高水不溶化合物的溶解度；对生物 催化剂有毒害作用或抑制作用的化合物，水一有机溶剂两相体系可以使其在水相中保持 低浓度；原位分离回收转化产物，减少产物抑制，并且能改变反应热力学平衡，使反应 向期望方向移动，提高转化效率；简化了产物和催化剂的分离和回收步骤j 2 2 1 。 水一有机溶剂两相反应体系在应用于微生物细胞转化之前，最初是应用于酶催化。 后来，人们发现有些细菌能在有机溶剂存在条件下生长盼2 ”，这使得在有机介质中的微 生物细胞催化展示了良好的应用前景，同时对进一步了解微生物细胞对有机溶剂的耐受 机制和有机溶剂对微生物细胞毒害机制成为可能。在有机介质中的微生物细胞转化成功 的关键之一是溶剂的选择，溶剂选择的两个最重要标准是生物相容性和对产物的高萃取 能力，其他还需要求溶剂的热稳定性和化学稳定性好、与水相不容易形成乳化液、不生 物降解、对环境毒害小和廉价易得【2 5 】。 1 2 2 2 有机溶剂的物性参数与生物相容性的关系 有机溶剂的物性参数是需要考虑的选择因素，但是其生物相容性是有机溶剂应用于 生物催化首要考虑的一个重要标准。因此，许多研究者在这方面做了大量的工作，试图 将不同有机溶剂的一些物性参数与溶剂对酶或细胞的毒性相关联，这些物性参数包括 h i l d e b r a i l d t 溶解度参数( 6 ) 、介电常数( e ) 、偶极矩( u ) 和极化度( o ) 等，它们 都与溶