实验酶学性质研究.doc

实验四 酶学性质研究一、 实验目的1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理；2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。二、 实验原理酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=VmaxS/Km+S，Vmax指该酶促反应的最大速度，S为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1V=KmVmax.1S+1Vmax，可知，1/V对1/S的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值三、实验器材与试剂1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计四、 操作步骤1、 配置缓冲溶液按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。管号0.2mol/L磷酸氢二钠（ml）0.1mol/L柠檬酸钠(ml)缓冲液pH120.5579.453228.571.53.5338.5561.454.0444.1055.904.5551.5048.505.0655.7544.255.5763.1536.856.02、酶活测定：用上述缓冲液代替测酶活的缓冲液，然后测出酶活，进行比较。3、温度设置：在冰箱中4保温，室温，用恒温摇床调不同的温度,35,40,45,50。将反应液放置在不同的温度下静置15分钟。然后快速测定其酶活，进行比较。4、km值测定：加入不同的比例的ABTS溶液，0.03ml，0.06，0.09，0.12ml，0.15ml，0.18ml，0.21ml，0.24ml，测出其酶活力。5、酶对底物酸性靛蓝的反应动力学常数测定配置不同浓度的酸性靛蓝（610nm），20mg/l, 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l, 100 mg/l。加入相同量的酶，在pH4.5的反应液中反应，记录下不同时间的610nm的吸光值。五、 结果与分析1、以酶活为纵坐标，以pH为横坐标，绘制下酶活性与pH的关系曲线。分析曲线并确定酶的最适pH值。2、以酶活为纵坐标，以温度为横坐标，绘制下酶活性与温度的关系曲线。分析曲线并确定酶的最适温度。3、不同金属离子对酶活性的影响，计算出相对活力、抑制分数、激活分数4、以酶活力对底物浓度的倒数作图，即用1/V对1/S作图，计算出表观K m、Vmax5、通过数据拟合求出酶对酸性靛蓝的Kapp值和反应级数。六、注意事项1研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。2本实验采