神经解剖学研究方法PPT课件.ppt

神经解剖学常用研究方法 第一节传统的研究方法 一 大体研究方法 一 脑和脊髓的移取与保存1 固定尸体的移取剥离软组织锯切颅骨切开硬膜移取脑和脊髓 2 未固定尸体的移取剥离软组织锯切颅骨切开硬膜移取脑和脊髓纱布包裹脑和脊髓10 福尔马林固定 同前 二 脑血管的显示1 经股动脉灌注有颜色的乳胶填充剂来显示 2 经颈内动脉 椎动脉灌注红色填充剂显示经颈内静脉 椎静脉灌注蓝色填充剂显示 三 脑的解剖剥离标本显示神经核群和相互交错神经纤维束标本1 显示神经纤维束2 显示主要神经核团 上纵束 下纵束 钩束 豆状核 锥体束 小脑上脚 齿状核 3 脑纤维束剥离标本的制作 福尔马林固定的脑 1 冰冻法原理 利用脑组织细胞群与纤维束所含水分不同 经过冰冻后 体积膨胀系数不一致 使间隙变宽 易于剥离 2 热水浸煮法 原理 加热使纤维韧性增强 脑组织轻度收缩 皮质与髓质发生剥离 易于剥离显示纤维束 3 药物浸煮法朱氏液 酒精 浓盐酸 食盐 胃蛋白酶特点 灰 白质分明 纤维束弹性较大 四 脑室的显示方法 解剖法和铸型法 五 脑厚片染色标本选择性地浸染灰质和白质原理 根据灰质和白质所含髓磷脂量不同 六 脑和脊髓常用切面 七 塑化标本原理 通过固定 脱水 强制渗透和硬化四个步骤在真空中去除尸体液体和脂肪 然后用硅 环氧树脂等聚合物代替 处理后的标本不再腐化或有异味 二 组织学研究方法 一 利用光学和电子显微镜观察 1 普通光学显微镜2 电子显微镜3 荧光显微镜4 相差显微镜5 倒置显微镜 二 标本制作方法1 固定固定液 甲醛 酒精 醋酸 苦味酸 铬酸 氯化汞和四氯化饿2 切片石蜡切片 冰冻切片 振动切片和超薄切片 3 神经解剖学传统染色方法1 苏木精 伊红染色法 H E染色法 苏木精 将细胞核内的嗜碱物质染成蓝紫色伊红 将细胞质和胶原纤维染成粉红色 猫脊髓前角运动元 H E H E染色 2 Golgi法CamelloGolgi 1843 1926 意大利人 1873年创建了用硝酸银镀染整个神经元的Golgi法用硝酸银镀染整个神经元的方法可显示完整神经元轮廓及突起的行向 Golgi法 3 Cajal 卡哈尔 法 RamonyCajal 1852 1943 西班牙人 1903年创建了镀染神经元内的神经原纤维的Cajal法 可显示轴突末梢和其它胞体间的联系情况Golgi和Cajal于1906年共同获得诺贝尔生理学和医学奖 Cajal法 4 Nissl法1892年德国人创建 以发现Nissl小体和Nissl变性而闻名 变性神经元细胞质内有Nissl小体用Nissl法逆行追踪细胞变性和Marchi法顺行追踪纤维或髓鞘变性 追踪神经元纤维联系主要手段 Nissl法 Nissl法 4 Weigert法 KarlWeigert 1843 1904 德国人 1884年创建了髓鞘染色的Weigert法 Weigert法 Weigert法 5 Marchi法 VittarioMarchi 1851 1908 意大利人 1890年创建了用锇酸显示变性髓鞘的Marchi法 Marchi法 6 Glees法 Nauta法 Fink Heimer法 用镀银染色的原理 显示正常的无髓或薄髓纤维以及变性纤维 乃至其终末前节段的染色方法 Fink Heimer法 7 髓鞘染色法 髓鞘染色 甲苯胺蓝染色 第二节近代研究方法 20世纪70年代出现的标记技术导致了神经解剖学研究方法的革命性变革 一 辣根过氧化物酶法 HRP法 HorseradishPerosidasemethod 定义 HRP是从辣根中提取的一种过氧化物酶 是利用HRP追踪神经通路的方法 HRP用于神经通路及功能研究具划时代的意义1971年 Kristenson和Olsson首次报道HRP可被神经末梢摄取 经逆行轴浆运输至神经元胞体后 可用组织化学方法显示胞体经的定位 利用轴浆运输原理标记神经纤维联系的方式A 顺行标记B 逆行标记C 跨节标记 逆行标记 HRP逆行示踪法 跨神经节标记 结合HRP如麦芽凝集素 HRP WGA HRP 霍乱毒素 HRP CT HRP 结合HRP比单纯HRP更灵敏 HRP跨节示踪法 二 荧光追踪法1977年 由荷兰神经解剖学家Kuypers创立原理 神经末梢摄取荧光化合物 通过轴突逆行运输到胞体内 在荧光显微镜下观察胞体定位 逆行追踪优点 1 方法简便 可靠和灵敏2 利用不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系 不同的逆行荧光化合物在荧光显微镜下它们的激发光波长和发射光波长不同 因此显示荧光颜色各异 加之荧光剂标记细胞的特征不同 有的标记细胞质 有的标记细胞核 因此 选择一种 两种或三种荧光剂分别对神经元进行单标记 双标记或多标记 常用荧光追踪剂主要参数 染料名称激发光波长 nm 标记部位荧光颜色 伊文思蓝 EB 550细胞质红 双苯甲亚胺 Bb 360细胞核蓝 真蓝 TB 360细胞质蓝 核黄 NY 360细胞核黄 碘化丙啶 PI 550细胞质桔红 快蓝 FB 360细胞质蓝 常用双标选择 Fb TB 细胞质 蓝 NY 细胞核 黄 PI 细胞质 桔红 Bb 细胞核 蓝 若选择脑内不同神经末梢分别注射两种或三种不同荧光追踪剂后 在同一胞体内能观察到两种或三种不同颜色的荧光 说明该神经之的轴突分支分别投射到事先选择注射该荧光剂的两个或三个脑区 Bb PI FB DY双标的结果 三 放射自显影神经追踪法 AutoradiographicNerveTracingMethod ARNT 定义 将放射自显影术应用于神经投射通路的研究 1968年 Lasek等创立 顺行追踪原理 神经元胞体可选择性摄取氨基酸并合成蛋白质 顺行运输至神经末梢 用放射性示踪剂标记氨基酸 在胞体内合成蛋白质后运输至神经末梢 四 PHA L顺行轴突追踪法 PhaseolusvulgarisLeukoagglutinin PHA L PHA为菜豆凝集素定义 将放射自显影术应用于神经投射通路的研究 1984和1985年 由Gerfen和Sawchenko创立原理 神经元胞体可选择性摄取氨基酸并合成蛋白质 顺行运输至神经末梢 用放射性示踪剂标记氨基酸 在胞体内合成蛋白质后运输至神经末梢 第三节 免疫学与组织化学原理结合的结晶 化学神经解剖学 1 免疫组织化学染色法 1 直接法 2 间接法A PAP peroxidaseanti peroxidase 法B ABC avidin biotin complex 法 免疫组织化学染色方法的比较A 直接法B 间接法