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基因编辑技术和原理 1 什么是基因编辑技术 基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术 利用该技术 可以精确地定位到基因组的某一位点上 在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段 此过程既模拟了基因的自然突变 又修改并编辑了原有的基因组 真正达成了 编辑基因 2 基因编辑的研究背景 传统的动物育种方法受到种源的限制 其程需要耗费大量的人力 物力和财力 经历漫长的培育过程 而且不同种间的杂交很困难 育种成果很难取得突破性进展 3 基因编辑原理 现代基因组编辑技术的基本原理是相同的 即借助特异性DNA双链断裂激活细胞天然的修复机制 包括非同源末端连接和同源重组修复两条途径 4 1 非同源末端连接 NHEJ 是一种低保真度的修复过程 断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失 造成移码突变使基因失活 实现目的基因敲除 如果一个外源性供体基因序列存在 NHEJ机制会将其连入双链断裂DSB位点 从而实现定点的基因敲入 移码突变 在正常DNA分子中 碱基缺失或增加3的倍数 造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变 这种现象称移码突变 5 2 同源重组修复 HR 是一种相对高保真度的修复过程 在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下 供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点 不会出现随机的碱基插入或丢失 如果在一个基因两侧同时产生DSB 在一个同源供体存在的情况下 可以进行原基因的替换 6 基因编辑原理 7 基因编辑技术的种类 目前主要有3种基因编辑技术 分别为 人工核酸酶介导的锌指核酸酶 zinc fingernucleases ZFN 技术 转录激活因子样效应物核酸酶 transcriptionactivator likeeffectornucleases TALEN 技术 RNA引导的CRISPR Cas核酸酶技术 CRISPR Cas9 8 1 ZFN基因组编辑技术 ZFN技术是第一代基因组编辑技术 其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的 1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2 His2锌指模块 到1996年 Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶 2005年 Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24bp的特异性序列 由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用 9 ZFN由锌指蛋白 ZFP 和Fok 核酸内切酶组成 其中 由ZFP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合 而由Fok 构成的切割域能执行剪切功能 两者结合可使靶位点的双链DNA断裂 DSB 于是 细胞可以通过同源重组 HR 修复机制和非同源末端连接 NHEJ 修复机制来修复DNA HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰 而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变 两者都可造成移码突变 因此达到基因敲除的目的 10 ZFN诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点 具有较好的发展潜力 但是目前有3个方面的缺陷制约了该技术的推广 1 以现有的策略设计高亲和性的ZFN 需要投入大量的工作和时间 2 在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性 3 虽然三联体设计具有一定特异性 但仍然存在不同程度的脱靶效应 11 2 TALEN基因组编辑技术 2009年 研究者在植物病原体黄单胞菌 Xanthomonas 中发现一种转录激活子样效应因子 它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系 随后 TALE特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白 它可设计性更强 不受上下游序列影响 具备比ZFN更广阔的应用潜力 12 TALENs包含两个TALEN蛋白 每个TALEN都是由TALEarray与Fok 融合而成 其中一个TALEN靶向正义链上靶标位点 另一个则靶向反义链上的靶标位点 然后Fok 形成二聚体 在靶向序列中间的spacer处切割DNA 造成双链DNA断裂 随后细胞启动DNA损伤修复机制 针对不同的TALEN骨架 其最适宜的spacer长度不同 其长度范围一般为12 20bp 实验结果表明 TALENs在靶向DNA时 第一个碱基为T时其结合效果更佳 13 目前 TALEN已经成功应用于酵母 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势 但仍然有些问题需要解决 例如 脱靶效应 TALEN与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等 3 CRISPR Cas9基因组编辑技术 14 1987年 Ishino等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列 随后发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中 经过几十年的研究 在2007年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系 15 CRISPR Cas系统由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成 转录的sgRNA折叠成特定的三维结构后与Cas9蛋白形成复合体 指导Cas9核酸内切酶识别特定靶标位点 在PAM序列上游处切割DNA造成双链DNA断裂 并启动DNA损伤修复机制 从不同菌种中分离的CRISPR Cas系统 其CrRNA 或者是人工构建的sgRNA 靶向序列的长度不同 PAM序列也可能不同 16 在这个系统中 只凭借一段RNA便能识别外来基因并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣 直到2012年 Jinek等第一次在体外系统中CRISPR Cas9为一种可编辑的短RNA介导的DNA核酸内切酶 标志着CRISPR Cas9基因组编辑技术成功问世 17 三种不同技术的比较 18 19 基因编辑的优势 与传统的以同源重组和胚胎干细胞技术为基础的