（发酵工程专业论文）碱性脂肪酶催化合成生物柴油的研究.pdf

摘要 中文摘要 研究了扩展青霉f s 1 8 8 4 1 碱性脂肪酶的酶学性质，最适温度和最适p h 分别为 3 6 。c 和9 0 。碱性脂肪酶固定化的最佳条件为：以异辛烷作为溶剂，载体为a b 8 ， 载体酶( 质量比) = 1 ：1 7 ，在体系中吸附2 h ，然后进行冻干6 h 得到固定化酶。用 固定化脂肪酶催化酯化和酯交换反应，利用气相色谱对物质进行检测。油酸甲酯合 成的最佳工艺是：以石油醚作为溶剂，每1 r e t o o l 油酸所加的脂肪酶的酶活为9 1 8 9 u ； 甲醇与油酸的摩尔比为1 2 ：1 ；甲醇应分三次加入，每隔8 小时加入甲醇总量的1 3 ； 在3 6 恒温摇床中反应时间2 8 h ；摇床转速为1 5 0 r r a i n ，反应转化率达到8 7 2 。 催化合成生物柴油的最佳工艺条件为：以叔丁醇作为溶剂；醇油摩尔比4 ：1 ；甲醇 的加入方法为在反应时间t = 0 ，4 ，1 2 ，2 8 h 分别加入甲醇总量的1 4 ；每l m m o l 大 豆油中加入酶活为11 4 8 7 u ；反应温度为3 2 。c ；在摇床中以1 5 0 r m i n 的转速旋转振 荡；反应4 8 h 后，转化率达到9 0 1 。 关键词：脂肪酶，固定化，油酸甲酯，气相色谱，生物柴油，酯化，酯交换 中文文摘 中文文摘 随着石油资源的枯竭和环境的恶化，迫使我们寻找一种可再生、对环境友好的 替代品。生物柴油作为生物燃料可以作为柴油机燃料的添加剂，而且可再生、对环 境友好，生物柴油的出现正好可以替代石油。生物柴油是动植物油脂( 主要成分甘 油三酸酯t 和各种短链醇( 甲醇或乙醇) ，在催化剂存在或者超临界条件下发生 酯交换反应( t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ) ，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，经过洗涤干燥之 后即得生物柴油。工业上一般利用强酸、强碱催化动植物油脂与甲醇合成生物柴油， 但此方法对反应设备要求高、产物难分离、废液污染环境。酶法合成生物柴油对反 应条件温和、醇用量少、转化率高、生物柴油易分离、废液无污染等优点，故本文 研究碱性脂肪酶作为催化剂，在温和的条件下，利用植物油脂与甲醇发生酯交换合 成生物柴油。碱性脂肪酶作为一种新型的酶制剂，经过多年的努力我国碱性脂肪酶 已接近国际水平，现已广泛用于食品、医药、洗涤剂、油脂水解、皮革生产、纸浆 和造纸等行业。 酶法合成油酸甲酯和生物柴油的反应条件温和、对设备要求低、醇用量小无需 附加设备回收甲醇、无污染物排放、产物容易从有机溶剂体系中分离和纯化等优点， 但反应过程中过量的甲醇和副产物会使脂肪酶失活，影响催化效果。为了解决这些 瓶颈主要采取方法有：利用固定化提高碱性脂肪酶的稳定性和重复性使用次数、分 步法加入甲醇降低甲醇对碱性脂肪酶的负面影响、预处理提高脂肪酶的稳定性、间 歇式丙酮去除表面的甘油。本文主要研究了：大孔树脂a b 8 固定脂肪酶，提高了脂 肪酶的稳定性；分步法加入甲醇在有机溶剂体系中合成油酸甲酯和生物柴油。 主要研究结果： 探讨了异辛烷体系中，不同载体、载体与酶质量比、固定化时间及冻干时间对 固定化酶活的影响。以异辛烷作为溶剂，选用a b 一8 为载体，载体酶( 质量比) = 1 ： 1 7 ，在室温摇床中固定化2 h ，取出固定化酶进行冻干6 h ，得到的固定化酶酶活达 到6 1 6 6 u g 。甲醇对固定化酶的影响，加入4 0 t l 甲醇固定化脂肪酶还能够保持5 0 以上的活力，当加入6 0 i t l 时固定化酶活力还不到3 0 ，所以不管在合成油酸甲 酯和生物柴油反应体系中，为了避免脂肪酶失活尽量使甲醇保持在一个相对较低的 浓度水平。 i i i 中文文摘 油酸甲酯合成反应体系：在1 0 0 m l 具塞三角瓶中加入3 4 5 山油酸( 即0 0 0 1 m 0 1 ) 、 甲醇和5 m l 选定的溶剂组成非水相酯化反应体系，加入一定量的固定化酶，混合均 匀。于一定的温度条件下，在恒温摇床中以1 5 0 r r a i n 的速度旋转振荡，加入3 a 分 子筛进行除水，定时取样分析。在固定化脂肪酶合成油酸甲酯中，探讨了正己烷、 环己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、石油醚、叔丁醇等不同反应体系，从实验结果 得到在石油醚和叔丁醇反应体系油酸甲酯转化率较高，但是原料价格叔丁醇偏贵， 故选作石油醚作为反应体系。还探讨了酶活、醇油摩尔比、甲醇加入次数、反应温 度和时间对酯化率的影响。以石油醚作为溶剂，每o 0 0 1 m o l 油酸所加的碱性脂肪酶 酶活为9 1 8 9 u ；甲醇与油酸的摩尔比为1 2 ：1 ；甲醇应分三批加入，每隔8 小时加入 甲醇总量的1 3 ；在3 6 恒温摇床中反应时间2 8 h ；摇床转速为1 5 0 r m i n ，反应转化 率达到8 7 2 。 生物柴油反应体系：在1 0 0 m l 具塞三角瓶中加入8 5 0 1 x l 大豆油( 即o 0 0 1 m 0 1 ) 、甲 醇和5 m l 叔丁醇组成非水相酯化反应体系，加入一定量的固定化酶，混合均匀。于一 定的温度条件下，在一定温度恒温摇床中以一定的速度旋转振荡，定时取样分析。 物柴油气相色谱的色谱条件：柱温采用程序升温：第一阶段，初始温度1 7 0 ，保持 0 5 m i n ；第二阶段以升温速率4 。c m i n ，升至2 0 0 ，保持l m i m 第三阶段以升温速 率3 c m i n 升至2 5 0 ，保持2 0 r a i n ，进样器温度2 8 0 ，检测器温度2 8 0 。c 。在叔丁醇 体系中，使用固定化脂肪酶催化大豆油与甲醇酯交换反应合成生物柴油。与传用的 酶法相比，叔丁醇支链化程度很高，具有3 个甲基，且本身毒性小，能够形成较大的 空间位阻，在酯交换过程中不参与反应，作为一种相对亲水的有机溶剂能够促进甲 醇和副产物甘油在反应体系中溶解，降低了甲醇和甘油对反应转化率的影响。催化 合成生物柴油的最佳工艺条件为：以叔丁醇作为溶剂；醇油摩尔比4 ：1 ；甲醇的加入 方法为在反应时间t = 0 ，4 ，1 2 ，2 8 时分别加入甲醇总量的1 4 ；每l m m o l 大豆油中加 入酶活为1 1 4 8 7 u ；反应温度为3 2 。c ；在摇床中以1 5 0 r m i n 的转速旋转振荡；反应4 8 h 后，转化率达到9 0 1 。 i v a b s t r a c t a b s t r a c t i tw a sr e s e a r c h e dt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho fp e n i c i l l i u me x p a n s u m f s 一18 8 4 1a l k a l i n el i p a s ew e r e3 6 a n d9 0 t h eb e s tc o n d i t i o n so fa l k a l i n el i p a s e i m m o b i l i z e da r ea sf o l l o w s ：w i mi s o o c t a n ea s s o l v e n t ，t h ev e c t o r i s a b - 8 ， v e c t o r e n z y m e ( q u a l i t yr a t i o ) = l ：1 7 ，m e d i u ma b s o r p t i o nt w oh o u r s ，f r e e z e d r i e ds i xh o u r s t h a tc a ng e ti m m o b i l i z e dl i p a s e i m m o b i l i z e dl i p a s ec a t a l y z e ds y n t h e s i so fe s t e r i f i c a t i o n a n dt r a n s e s t e r i f i c a t i o nw h i c hd e t e c t e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y t h eb e s tt e c h n o l o g yo f s y n t h e s i z i n gm e t h y lo l e a t ei s ：w i t hp e t r o l e u me t h e ra ss o l v e n t ，b ya d d i n g9 1 8 9 uo ft h e a l k a l i n el i p a s ea c t i v i t yp e ri m m o lo l e i ca c i d ；m e t h a n o l o l e i ca c i dm o l a rr a t i o1 2 ：1 ； m e t h a n o la d d e dt h r e es t e p s ，e v e r y8h o u r sa d d1 3o ft h et o t a l ；t e m p e r a t u r ea n ds h a k i n g r a t ew e r e ，3 6 a n d15 0 r m i n ，s y n t h e s i z e2 8h o u r s ，t h er e a c t i o nc o n v e r s i o nr a t eo f8 7 2 t h eb e s tc o n d i t i o n ss y n t h e s i so fb i o d i e s e lw e r ea sf o l l o w s ：w i t ht e r t - b u t y la l c o h o la s s o l v e n t ；m e t h a n o la n ds o y b e a no i lm o l a rr a t i oo f4 ：1 ；t h ew a y so fa d d i n gm e t h a n o li s ： a d d1 4o ft o t a lm e t h a n o la tr e a c t i o nt i m et = 0 , 4 ，12 ，2 8r e s p e c t i v e l y ；p e ri m m o ls o y b e a n o i la d da c t i v i t yf o r11 4 8 7 u ；r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s3 2 ；i nt h es h a k e rw i t ht h es p e e do f r o t a t i o no s c i l l a t i o n15 0 r m i n ；a f t e r4 8 hr e a c t i o nt h ec o n v e r s i o nr a t er e a c ha t9 0 1 k e y w o r d s ：l i p a s e ，i m m o b i l i z e d , g a sc h r o m a t o g r a p h y , m e t h y lo l e a t e ，b i o d i e s e l ，e s t e r i f i c a t i o n ， t r a n s e s t e r i f i c a t i o n i i 福建师范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名)崔建基学号 2 q q 委! q 2 圣 专 业 筮醛王猩所呈交的论文( 论文题目：碱性脂肪酶催化合成生物柴 油的研究) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查 阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名焦吏生指导教师签名隍查至 签名日期硼d 6 、p 驴 绪论 绪论 1 、课题背景 石油作为一种丰富的天然矿物资源，极大的改变了现代文明的发展，为人类社 会的进步做出了突出的贡献。由于世界各国对石油需求量的增加及石油不可再生且 燃烧后污染环境，随着石油储备量的日益减少，全世界正面临着能源危机。这样就 逼迫我们寻找一种可再生的、易降解、对环境友好的石油燃料替代品【l 刁】。 伴随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，人们深刻认识到石油燃烧后排 放物对环境会造成严重的影响。c o 、n o 主要来自汽油、柴油不完全燃烧产生的尾 气，会造成人体缺氧、头痛、胸闷等不良症状。碳氢化合物尽管在汽车尾气中含量 很少，但其致癌。二氧化硫也是汽车尾气之一，其具有强烈的刺激性，达到一定浓 度时易导致“酸雨 的发生，造成水源和土壤酸化，影响农作物的生长。因此，国 际能源机构认为开发一种新的环保、可再生能源替代石油原料已迫在眉睫，生物柴 油正好符合这些条件。 生物柴油是由动植物油脂与短链醇经转酯化反应得到的一种可供内燃机使用的 燃料，可再生的、易降解、对环境友好等性能。所以发展生物柴油对缓解环境污染 和石油能源短缺状况、优化生态能源、保障能源安全、实现国民经济持续稳定发展 具有重大战略意义和现实意义。 2 、生物柴油的概述 随着世界经济的迅猛发展、全球环境的恶化和石油资源的枯竭，生物柴油作为 生物燃料，又可以作为柴油机燃料的添加剂，而且是可再生能源，受到科学家的广 泛的关注。生物柴油是由动植物油脂与短链醇( 甲醇或乙醇) 经转酯化反应得到的脂 肪酸酯( 甲酯或乙酯) 降9 】。 生物柴油一般由不饱和脂肪酸甲酯( 如油酸甲酯、亚麻酸甲酯、亚油酸甲酯等) 和饱和脂肪酸甲酯( 如棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯等) 组成。对大多数以柴油为燃料的 发动机的公共汽车、内燃机车及农用汽车等而言，燃料酒精并不适合。而且柴油燃 烧排放的尾气会造成环境污染，因此人们寻找了柴油的代用品一一生物柴油。生物 柴油是一种洁净能源，与常规柴油相比具有以下无法比拟的性能1 0 】：1 、洁净环保。 主要由于生物柴油中含量硫低，燃烧产物硫化物和二氧化硫的排放低，与柴油相 比减少约3 0 ；生物柴油中不含芳香族烷烃，燃烧过后废气对人体损害低。检测表 明，与传统柴油相比，使用生物柴油作为燃料，可大大降低空气毒性和患癌率，一 福建师范大学x x x 硕士学位论文 氧化碳的排放量与传统柴油相比减少约1 0 ；生物柴油的生物降解性高；2 、润滑性 能好。喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，延长了使用寿命；3 、安全性能好。 由于生物柴油的闪点高、不易挥发、生物降解率高，其降解速率是柴油的2 倍。因此 在运输、储存和使用方面的安全性高；4 、燃烧性能好。十六烷值高，故其燃烧性能 优于柴油，燃烧残留物呈微酸性，促使催化剂和发动机机油的使用寿命延长；5 、可 再生。与石油储量不同生物柴油是一种可再生能源，通过农业和生物科学家的研究 成果，其供应量不会枯竭；6 、可直接使用。生物柴油质量完全符合石化柴油的标准， 可与石化柴油任意比例混合使用，并且柴油机无需改造，不像其他替代燃料如c n g 、 l n g 和乙醇调合油则需要改造发动机。生物柴油可直接添加使用，无需储运设备、 加油设备及人员的特殊技术训练。生物柴油与柴油相溶性极佳，完全可作为柴油的 替代燃料单独使用或与柴油以任意比例混合使用；7 、低温发动机启动性能，适合 汽车和船只使用，可达到国家环保标准；8 、生物柴油的生物降解性高。生物柴油没 有怪味，排放气体不含硫和铅的有毒物质，不会对环境造成破坏。 综上可见，生物柴油是一种可再生、易生物降解的绿色能源，燃烧后无毒，属 环境友好型燃料，从长远上看有很大的发展潜力。当然生物柴油也有缺点，例如热 值较低，生物反应过程的随意性、严格性会造成低碳醇转化率较低、生产后期醇的 回收处理较为复杂、直接使用时会产生的n o 、c o 等有毒气体，还有酶成本高，稳 定性差、寿命短等问题，还亟待深入研列1 1 以5 1 。在能源日益短缺和发动机技术日新 月异的今天，是有很大的研发价值【l 7 1 。 2 1 国内外生物柴油的研究及生产现状 2 1 1 国外 美国是最早研究生物柴油的国家之一，大多数以大豆油作为原材料。生物柴油 在2 0 世纪9 0 年代初已形成产业化，并已成为替代燃油的最快燃料。考虑到生物柴 油的发展能够促进农业生产和增加就业机会等好处，美国政府采取立法和经费补贴 措施，加速推广生物柴油的使用。在研制过程中，尽量选择适宜的原料，使得生产成 本合理化。1 9 9 0 年美国正式修正了空气洁净法，禁止在公共运输车辆使用石化柴油 燃料，生物柴油是对人体健康无害的石油替代品。同时美国还制定了国家生物能源 与替代能源计划( n s e a p ) 和国家生物燃油计划( n b p ) 可再生柴油替代品项目 ( g d a p ) ，大力推进生物柴油的研究与应用【1 引。生物柴油使用最多的是欧洲，份额已 占到成品油的5 ，2 0 0 1 年生物柴油产量已超过1 0 0 万吨，主要以油菜为原料。以 2 绪论 前通常被用来做饲料的废食用油脂，现在也正转向生产生物柴油。德国和奥地利首 次在柴油机引擎中使用菜籽油甲酯，之后奥地利在常温、常压下，新工艺以菜籽油 为原料工业化生产生物柴油建立了生产菜籽油甲酯的中试装置。生物柴油在拖拉机 中首次试用得到了一致的好评，成为生物柴油成功走向市场的里程碑。近年来，欧 盟国家大力推进生物柴油产业，给予巨额财政补贴和优惠税收政策支持对生物柴油 免征增值税，使生物柴油价格与石油柴油相差无几，从而使之具有较强的市场竞争 力【1 9 】。日本生物柴油生产能力也达到4 0 万吨年。菲律宾正与美国合作开展用椰子 油生产生物柴油，将成为世界上第一个使用椰子油作为动力的国家。韩国在建1 0 吨年生物柴油生产装置的基础上，巴西东北部塞阿拉联邦大学经过2 年的研究，以 蓖麻油为原料，以氢氧化钠为催化剂，对蓖麻油进行酯交换，生产生物柴油。在新 西兰，人们利用肉联厂的副产品油脂来生产生物柴油。此外，印度、澳大利亚、马 来西亚、泰国、加拿大等国家也在大力发展生物柴油【2 0 l 。 z 1 2 国内 我国生物柴油的研究起步比较晚，但已成功利用菜籽油、大豆油、米糠油脚料、 工业猪油、牛油及野生小桐籽油等作为原料，经过甲醇酯化合成生物柴油的技术， 其产品不仅可以替代燃料直接使用，而且还可以作为清洁柴油的添加剂，部分科研 成果已接近国际先进水平。由于我国有丰富的动植物油脂资源，而且餐饮业产生大 量的煎炸油，如能够充分利用，有很大的发展空间。中国科技大学、中科院武汉油 料所、清华大学、北京化工大学等学府都已突破技术瓶颈，成功摸索出一套生物柴 油的合成方法。现拥有生物柴油自主知识产权的技术并投入生产的公司有海南正和 生物能源公司、四川古杉油脂化工公司和福建卓越新能源发展公司【2 。 发展生物柴油可以促进我国国民经济的发展，以植物油脂生产生物柴油可以走 出一条农林产品向工业产品转化的强国之路，有利于增加农民收入，调整农业结构 和保护生态环境。利用废食用油、垃圾油、泔水油生产生物柴油【2 2 】可大大减少一氧 化碳、多环苯类致癌物和“黑烟”等污染物的排放。 2 2 生物柴油酯交换的合成方法 当前生产生物柴油的方法有直接混合法、高温热解法、微乳法、酯交换法，但 是工业上生产主要以酯交换合成为主。酯交换是指在催化剂存在或者超临界条件下， 动植物油脂( 主要成分甘油三酸酯t g ) ：i 各种短链醇( 甲醇或乙醇) 发生酯交换反 应( t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ) ，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，经过洗涤干燥之后即得生 福建师范大学x x x 硕士学位论文 物柴油。酯交换反应催化方法主要包括酸碱催化法、超临界法、工程藻法、生物酶 催化法等。 酯交换过程也称为醇解，即用低碳醇( 一般用甲醇或乙醇) 来取代甘油三酸酯 的甘油基，形成脂肪酸低碳醇酯。反应的一般步骤如下： c h ，c o o r lr 1c o o r c h ，o h l 1 催化剂 1 。 c h 2 c o o r 2 + 3 r o h = r 2 c o o r + c h 2 0 h e h 2 c o o r 3 r 3 c o o r亡h 2 0 h 但实际上其反应过程缓慢且不是一步完成的，而是分三步进行，每一步反应都 会生产一种脂肪酸低碳醇酯： 催化剂c i h 一2 0 h = r 1 c o o r + c l h 2 c o o r 2 c h 2 c o o r 3 c h 2 0 hc h 2 0 h 1 催化剂 i c l h 2 c o o r 2 + r o h=r 2 c o o r + 午h 2 0 h c h 2 c o o r 3c h 2 c o o r 3 c h 2 0 hc h 2 0 h i 催化剂 1 一 c h 2 0 h + r o h = = = 兰 r 3 c o o r 。+s h 2 0 h c h 2 c o o r 3c h 2 0 h 2 2 1 化学法 目前生产生物柴油的主要方法是化学法，化学法一般用酸碱催化剂，在高温情 况下发生酯交换合成生物柴油【2 3 2 4 1 。 常用酸性催化剂的有硫酸、盐酸、磷酸、苯磺酸等。e d w a r dc r a b b c 2 5 1 等以h 2 s 0 4 为催化剂，以棕桐油为原料生产生物柴油，得到的最优条件是：反应温度为9 5 。c 、 反应时间9 d x 时、甲醇与油的摩尔比为4 0 ：1 、h 2 s 0 4 为5 ( 质量比) ，在此条件下 的转化率为9 7 。酸催化的优点是受游离脂肪酸和水分的影响较小，当使用废餐饮 油时，可以免去油脂的预处理步骤；缺点是需要较高的温度，能耗高。 碱性催化剂主要包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾及钠和钾的醇盐。 g c m m a v i c c n t c 【2 6 】等用葵花子油做原料、醇油摩尔比6 ：1 、反应温度6 5 、催化剂用 量1 ，分别用n a o h 、k o h 、n a o c h 3 、k o c h 3 做催化剂，得产率分别为8 6 7 1 、 4 讲r + 1 2 3 r r r o o q o o o c c c h h hc i c i c 绪论 9 1 6 7 、9 9 3 3 、9 8 4 6 。碱催化剂法存在副反应多、乳化现象严重、反应残液 多等问题；优点是催化速率快，转化率高。 总体来说化学法合成生物柴油有以下缺点：反应过程需要温度较高、工艺复杂； 反应中需要过量短链醇，后续工艺要有相应装置回收醇类；反应生成的副产物难于 去除，后处理过程都包括中和工序，会排出一定量的污水，造成环境污染；反应液 纯化复杂，酯化产物难于回收；处理过程繁杂、能耗高、成本昂贵。因此，人们致 力于研制新型酯合成催化剂，如杂多酸、固体超强酸、金属氧化物及无机盐类、离 子型有机金属化合物、相转移催化剂、生物酶【2 7 】等。化学法生产还有一个不容忽视 的成本问题：酸碱催化剂在生产过程中要求原料必须是毛油，比如未经提炼的菜籽 油和豆油，原料成本就占总成本的7 5 。 2 2 2 超临界法 所谓超临界法，是由s a k a c - 和k u s d i a n a 提出的一种新颖的生物柴油生产方法，就 是指当温度超过其临界温度时，促使醇和油成为均相，使得均相反应常数增大，在 无催化剂存在的条件下与油菜籽油发生快速酯交换反应，其产率高于普通的催化过 程，同时还可以避免使用催化剂所必须的分离纯化过程。s a k a 2 8 】等人研究了无催化 剂作用下以菜籽油为原料制备生物柴油的方法，结果表明植物油与甲醇在3 5 0 、醇 油摩尔比为4 2 ：1 、压力为4 3 m p a 条件下，反应3 0 s 后菜籽油的转化率可达4 0 以上， 2 4 0 s 后菜籽油转化可达9 5 。 超临界法的特点是无需催化剂、反应速率快、反应时间短、环境友好、产物分 离简单、甲酯转化率高；但反应需在高温、高压下进行，对设备要求高，能耗大、 费用高。为了克服超临界法合成生物柴油的缺点，在未来有催化剂或助溶剂存在的 超临界酯交换成为一个新的探索领域。 2 2 3 工程微藻法 工程微藻法【2 9 】是利用细胞工程技术获得大量异养藻油，然后利用异养藻油脂通 过酸催化发生酯交换获得与传统相当的生物柴油，为生物柴油的生产开辟了一条新 的途径。藻类具有光合作用效率高、生长周期短、生物产量高等优点，而且异养生 长利于藻细胞内某些代谢产物的积累，可获得高脂肪含量的微藻，从而可以降低成 本，因此工程微藻法制备生物柴油具有很大的潜力。首先从收集微藻样本开始，通 过筛选、表征，再进行统计分析，得出制约微藻产量和产油量的关键因素，总结微 藻细胞的生理和生化特性，最终采用分子生物学和基因工程技术，改变微藻细胞的 福建师范大学x x x 硕士学位论文 生理结构，制备出高产量、高含油量的工程微藻，并实现了工业放大。但是现微藻 的基因改造技术并不成熟，还需要投入大量的努力。 2 2 4 酶催化法 酶是作为生物高效催化剂，它能够将低碳醇( 甲醇或乙醇) 与动植物油脂进行 酯交换反应生成脂肪酸酯( 甲酯或乙酯) 的过程。酶法合成生物柴油反应条件温和、 醇用量少、转化率高、生物柴油易分离、废液无污染等优点，所以近些年受到了科 学家的高度重视。0 z n u r ( 3 0 】等人研究了在无溶剂的体系中利用已固定化的脂肪酶 n o v o z y m 4 3 5 催化棉籽油的醇解合成生物柴油，在温度为5 0 c 时，酶的用量为油重的 3 0 ，油与醇的摩尔比为1 ：4 的条件下，反应7 h 后，反应液中甲酯质量分数最大达9 1 5 。之后科学家又发现以亲脂性有机溶剂作为反应体系，能够对反应起到很好的促 进作用，提高转化率，且亲脂性有机溶剂对油脂原料适用广泛和产品分离纯化简便。 盛梅【3 1 】等采用固定化脂肪酶n o v o z y n 4 3 5 ，催化菜籽油和甲醇的酯交换反应，并研究 了甲醇分三步加入( 总的醇油比为3 ：1 ) 对产率的影响，实现了9 9 以上的收率。由 于利用生物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、能耗低、受游离脂肪 酸和水的影响小、产物容易分离纯化、无污染物排放等优点，具有环境友好性，因 而日益受到人们的重视。 酶法制备生物柴油优点很多，但目前生物酶法制备生物柴油存在着一些急需解 决的问题【3 2 4 4 】：1 、脂肪酶在亲脂性有机溶剂中存在着聚集作用，不易分散，从而影 响催化效率；2 、甲醇在油脂中的溶解性能差，体系中存在过多的甲醇极易导致脂肪 酶失活，降低脂肪酶的使用寿命，导致脂肪酶的使用成本过高；3 、副产物甘油极易 粘附在固定化酶的表面，影响传质效果，导致酶的催化活性及稳定性降低。为解决 这些瓶颈主要采取办法有：1 ) 对于聚集作用可通过酶的固定化、酶晶体的交联、酶 的修饰、酶分子的生物印迹、酶的纯化方式与预处理过程等途径对脂肪酶进行改性， 提高酶的稳定性从而使酶充分分散于有机溶剂中；2 ) 对于短链醇对脂肪酶的毒性， 采取分步加入短链醇，使短链醇的浓度保持较低的水平，降低短链醇对脂肪酶的毒 害作用，或者寻找其他的酰基体对酶伤害小且溶解性好；3 ) 对于副产物甘油对反映 体系的副作用，可以采用多级酶反应器，定期用有机溶剂冲洗固定化脂肪酶以除去 附着表面上的甘油，这些措施可在一定程度上改善脂肪酶的催化活性和操作稳定性。 酶催化法的不足是脂肪酶稳定性不高，价格昂贵，反应速率慢，这些不足在一定程 度上影响了酶催化法的推广应用。 6 绪论 3 、脂肪酶的研究 3 1 脂肪酶的概述 脂肪酶( 1 i p a s ee c 3 1 1 3 ) 亦称酰基甘油水解酶( a c y l g l y c e r o lh y d r o l a s e s ) ，它是油 脂改良的关键酶，能够在油一水界面催化天然油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油 单酯或二酯，在水相或有机相中进行酯化反应和酯交换反应。脂肪酶主要通过微生 物发酵得来，研究表明约6 5 个属的真菌、细菌及酵母能够产生脂肪酶。脂肪酶组成 基本单位是氨基酸，它的催化活性取决于蛋白质的结构【3 5 1 。由于天然油脂结构的差 异，造成理化性质和营养价值的不同，利用脂肪酶的多种催化类型和催化专一性， 在适当的条件下，能够催化甘油酯类化合物酯水解、酯合成、酯交换、功能高分子、 多肽合成、聚合物的合成和药物的合成，利用脂肪酶的立体专一性催化光学活性化 合物和手性药物的合成，作为生物高效催化剂脂肪酶受到了越来越多的关注。脂肪 酶及其改性制剂在食品与营养、医药、药物合成、轻纺、油脂化学品工业、日用化 学工业、农业化学工业、精细化工、洗涤和生物表面活性剂的合成等领域得到广泛 应用。虽然脂肪酶应用前景广泛，但天然的脂肪酶还不能满足催化反应的需求，科 学家通过酶进行化学修饰、生物印迹、定点诱变或利用克隆技、一级结构氨基酸侧 链的修饰等方法对脂肪酶进行改造。 碱性脂肪酶的研究始于1 9 8 1 年施巧琴发表的扩展青霉碱性脂肪酶产生菌变株 u n - 5 0 3 的选育，1 9 8 6 年施巧琴【3 6 】采用脂肪酶作用脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚 蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性脂肪酶的扩展青霉。为了进一步提高脂 肪酶的酶活，在国家级专家吴松刚、施巧琴教授经过了多年的努力，选育出p f 8 6 8 变株，酶活达2 8 6 0 u g ，经抗阻遏突变选育f s 1 8 8 4 1 变株，经过基因工程技术酶 活达7 7 4 4 u g 。我国碱性脂肪酶研究技术已达到国际水平，应国内的需求我国先后 很多企业开始投产生产脂肪酶，实现了碱性脂肪酶的工业化。碱性脂肪酶作为一种 新型的酶制剂，有高新技术含量，在食品工业、医药和化妆品、洗涤剂工业、手性 化合物制备、油脂水解、皮革生产、纸浆和造纸等行业已经广泛的被应用，具有广 阔的市场前景。龚福生【3 7 】等研究了国产扩展青霉碱性脂肪酶对猪油、豆油、菜籽油、 花生油的水解能力比国外脂肪酶强。鉴于碱性脂肪酶应用前景及产业化成本降低， 本文采用我院提供的碱性脂肪酶作为合成生物柴油的催化剂。 3 2 脂肪酶的结构特征和催化机理 科学家为了深入研究脂肪酶的结构，用基因工程技术对脂肪酶进行克隆和表达， 福建师范大学x x x 硕士学位论文 并利用x 衍射和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、等电点、晶体结构等参数， 根据这三个参数构建脂肪酶的三元组( t l j a d ) 活性中心，尽管组成脂肪酶的氨基酸序列 不同，但活性中心的结构都相同或相似，即h 1 一s 1 2 一g ( g 代表甘氨酸，x 1 代 表组氨酸，s 代表丝氨酸，x 2 代表谷氨酸或天冬氨酸) 。它们的活性中心为丝氨酸、 天冬氨酸和组氨酸，在反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物成催 化过程如图1 1 所示，脂肪酶空间结构具有高度相似性，研究表明，脂肪酶活性位点 有一个一螺旋盖，当没有配体的情况下，a 一螺旋盖把活性中心和分子表面隔离， 使得脂肪酶没有活性；当配体存在下，a 一螺旋盖被打开，活性中心暴露与底物结 合发生催化反应【3 8 1 。 0 。k n 一 p 图1 脂肪酶催化甘三酯水解过程中形成的四面体中间态 f i 9 1 t h ep r o c e s so fl i p a s ec a t a l y z e de s t e rh y d r o l y s i s f o r m e dt e t r a h e d r a li n t e r m e d i a t es t a t e 3 3 有机相中酶的催化反应 3 3 1 水对有机相中脂肪酶催化的影响 严格意义上讲，酶在非水的条件下成惰性，因为水分子直接或间接地通过范德 华力、静电作用、氢键、疏水键等分子力维持着酶分子的活性构象。酶需要少量的 水维持其活性的三维构象，即使是共价键合到一个支持物上的酶也不例外。水影响 蛋白质结构的完整性，活性位点的极性和稳定性。水的存在，能降低酶分子的极性 8 绪论 氨基酸的相互作用，以防改变酶分子的构象结构。无水条件下，酶分子的带电基团 和非极性基团相互作用，把酶活性中心封闭起来，使之不表现活性；当加入少量的 水时，会产生静电作用，有利于酶分子活性中心打开和催化功能的维系；但体系中 过多的水会使活性位点形成水束，通过介电屏蔽作用，掩盖了活性位点的极性，另 一个原因太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起传 质阻力。有机溶剂中酶含水量低于最适含水量时酶构象过于“刚性 ，而失去催化 活性；含水量高于最适水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力 稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活。只有在最适水量时蛋白质结构的动力 学刚性( k i n e t i cr i g i d i t y ) 和热力学稳定性( t h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t y ) 之间达到最佳 的平衡点，酶才能表现出最大活力【3 9 1 。 3 3 2 有机溶剂对酶催化的影响 有机溶剂不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能构改变酶的特异 性( 包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等) 。通常有机溶剂通过对水、 酶、底物和产物的相互作用来影响酶的以下性质【3 9 1 。 1 、有机溶剂对酶的结合水的影响，虽然一些有机溶剂对酶的结合水影响较小，但一 些相对亲水性的有机溶剂却能够夺取酶表面的必需水，从而导致酶的失活。 2 、有机溶剂对酶的影响，有机溶剂可以通过改变蛋白分子的动态移动性( d y n a m i c m o t i o n ) 及构象来影响酶的活力，也可以通过改变酶分子本身的动态结构及表面结 构。 3 、溶剂对酶活性中心的影响，酶的活性中心是酶发挥催化功能的主要部位，任何对 活性中心的微扰都将导致酶的催化活性的改变。 l a a n e 等通过实验得出酶活性与溶剂的极性参数l o g p 的关系，而张念湘啪】等在脂 肪酶催化酯合成的实验中发现，酶在2 o 弋 一+ 3 r ，o h ；! ! ! ! 窒生矗，一0 0 【 一r 。+ 2 = h o h fll 亡h 2 一嘎) c r i 袅j 一( x ) c 一c 一o h 探讨对酶活、醇油摩尔比、甲醇加入次数、反应温度、反应时间、甲醇加入间 隔时间等因素对酯交换转化率的影响。 4 2 3 2 气相色谱法测定转化率 产物气相色谱分析条件：柱温采用程序升温：第一阶段，初始温度1 7 0 ( 2 ，保持 o 5 m i n ；第二阶段以升温速率4 c l m i n ，升至2 0 0 。c ，保持l m i n ；第三阶段以升温速 率3 m i n 升至2 5 0 c ，保持2 0 m i n ，进样器温度2 8 0 ( 2 ，检测器温度2 8 0 。 脂肪酸甲酯转化率= 菇藤毒萋曼嘉誊善雾磊毳筹，。 4 2 3 3 生物柴油标准曲线 用化学方法制备生物柴油，待反应完全后，冷却、分层，取上层液加酸、中和、 洗涤，再加入固体干燥剂进行干燥，经过滤后得到黄色澄清透明的产品，即生物柴 油【2 3 1 。离心，取一定量生物柴油用正己烷稀释一定倍数，然后用细菌过滤膜过滤， 进行进样。柱温采用程序升温：第一阶段，初始温度1 7 0 c ，保持0 5 m i n ；第二阶 段以升温速率4 c m i n ，升至2 0 0 ，保持l m i m 第三阶段以升温速率3 c m i n 升至 2 5 0 。c ，保持2 0 m i n ，进样器温度2 8 0 * ( 2 ，检测器温度2 8 0 。c 。进样梯度生物柴油浓 度分别为0 4 m g m l 、1 2 m g m l 、2 m g m l 、2 8 m g m l 、3 6 m g m l ，得到棕榈酸甲酯( c 1 6 ：o ) 、 硬脂酸甲酯( c 1 8 ：o ) 、油酸甲酯( c 1 8 ：1 9 ) 、亚油酸甲酯( c 1 8 ：2 a g , 1 2 ) 和亚麻酸甲酯 ( c 1 8 ：3 以1 2 ，1 5 ) 的峰面积，进行数据分析，根据归一法： 4 2 第4 章叔丁醇体系中脂肪酶催化合成生物柴油 o ：善1 0 0 ：罢1 0 0 ：1 0 0 形 主珊羔缈 由于脂肪酸甲酯各组分的厂值相近，所以可以把公式简化为： g ：1 0 0 a i = 1 彤为i 组分的量，g ； 形为各组分含量的总和，g ； g 为组分i 的百分含量； 7 ；为重量校正因子； 么，为信号峰面积，m v 。 从归一法中可以得到各组分的百分含量即浓度，然后利用定量进样一标准曲线 法作出各组分的标准曲线( 见附录2 ) 。 4 2 3 4 生物柴油的分离 将反应液与固定化脂肪酶分离后，静至于分液漏斗中，经沉降，很快分为两层， 让层为粗生物柴油，然后将粗生物柴油蒸发去除有机溶剂，得到生物柴油。 4 3 结果与分析 4 3 1 酶活对酯交换转化率的影响 在1 0 0 m l 具塞三角瓶中加入5 m l 叔丁醇，醇油摩尔比3 ：1 ，大豆油8 5 0 1 l l l ，甲 醇1 3 5 9 l ( 分三次加入) ，在2 8 c 恒温摇床中反应，振荡频率为1 5 0 r r a i n ，脂肪酶 的酶活分别为2 2 9 4 、4 5 9 5 、6 8 9 2 、9 1 8 9 、1 1 4 8 7 、1 3 7 8 4 u ，反应2 4 小时，取样 l m l 反应液进行离心，取2 0 0 1 上1 上清液用正己烷稀释2 0 倍，用细菌过滤膜过滤到进 样瓶中，然后气相色谱分析，探讨酶活对酯交换转化率的影响。 从图4 1 中看出，从每l m m o l 的大豆油中加入的酶活由2 2 9 4 u 到11 4 8 7 u 时 酯交换转化率变换比较明显，增加到1 3 7 8 4 u 时反而有下降的趋势，这是因为过大 的酶量可能造成酶的团聚，从而增大反应过程中的传质阻力，所以最佳脂肪酶活 1 1 4 8 7 u 。合成生物柴油最适合酶活与合成油酸甲酯最适酶活相接近，但由于甘油三 精结构的特殊性，合成生物柴油与油酸甲酯又不尽相同。 4 3 福建师范大学x x x 硕士学位论文 零翻 萝臻 黪囔网 “ ； ， 照 霸 。0 哆 $ 4 蓬 to ： 譬l 蠢i 每 壮 爱r ； 秘+ ：毋 婺锺 l 麓 ? $ ? 铲 “；： 豹，4 t ， 一： ，4 囊臻 妒 每，雾 务驾 ”+ l 鲈a 0 4 或鼍，：f ：团 g 万 9 茹t j 台。 勉。荔貔。：鬈；孝i 臻羧羹凌蕊 2 2 9 4 4 5 9 56 8 9 29 1 8 91 1 4 8 71 3 7 8 4 每m m o l 大豆油加入酶活u 图4 - i 酶活对酯交换的影响 f i 醴一i e f f e c to f t h ea d d i t i o ne n z y m el i v e so i lt r a n s e s t e r i f i c a t i o n 4 3 2 醇油摩尔比对酯交换转化率的影响 在l o o m l 具塞三角瓶中加入5 m l 叔丁醇，8 5 0 9 l 大豆油，甲醇大豆油( 摩尔比) = 2 ，3 ，4 ，5 ，6 ( 分三次加入) ，脂肪酶的酶活1 1 4 8 7 u ，在2 8 * ( 2 恒温摇床中反应， 振荡频率为15 0 r m i n ，反应2 4 d , 时，取样lm l 反应液进行离心，取2 0 0 9 l 上清液用正己 烷稀释2 0 倍，用细菌过滤膜过滤到进样瓶中，然后气相色谱分析，探讨油醇摩尔比 对酯交换转化率的影响。 从图4 2 看出，醇油摩尔比为4 ：1 时，酯交换转化率相对较高，再增加摩尔比转 化率反而下降。这主要是由于随甲醇浓度的增加，甲醇对脂肪酶起到蛋白质变性的 作用，从而导致反应转化率降低。因此甲醇和大豆油的摩尔比取4 ：1 为最好。 钙们；弱加竭加5 o 褥晕辩 第4 章叔丁醇体系中脂肪酶催化合成生物柴油 23456 醇油摩尔比 图4 2 醇油摩尔比对酯交换转化率的影响 f i 9 4 - 2 e f f e c to fs u b s t r a t em o l a rr a t i oo i lt r a n s e s t e r i f i c a t i o n 4 3 3 甲醇加入次数对酯交换转化率的影响 在l o o m l 具塞三角瓶中加入5 m l 叔丁醇，醇油摩尔比4 ：l ，8 5 0 p 1 大豆油，甲醇为 1 7 8 肛1 ，分2 ，3 ，4 ，5 次加入( 二次：t = o ，1 2 h 分别加入总量的1 2 ，三次：t = o ，8 ， 1 6 h 分别加入总量的1 3 ，四次t = o ，6 ，1 2 ，1 8 h 分别加入总量的1 4 ，五次：t - - - - o ，5 ， 1 0 ，1 5 ，2 0 h 分别加入总量的1 5 ) ，脂肪酶的酶活1 1 4 8 7 u ，在2 8 恒温摇床中反应， 温振荡频率为1 5 0 r m i n ，反应2 4 d x 时，取样l m l 反应液进行离心，取2 0 0 p l 上清液用正 己烷稀释2 0 倍，用细菌过滤膜过滤到进样瓶中，然后气相色谱分析，探讨甲醇加入 次数比对酯交换转化率的影响。 从图4 3 中看出甲醇分四次加入转化率相对较高，第二章探讨了甲醇对脂肪酶的 影响，当在反应体系中超过6 0 1 t l 时，酶活不到3 0 ，四次加入可以避免过多的甲醇 对脂肪酶