高中生物 血红蛋白的分离和提取.ppt

课题3血红蛋白的提取和分离 一 基础知识 一 蛋白质提取和分离原理 二 蛋白质提取和分离的方法1 凝胶色谱法 又称分配色谱法2 电泳法 三 缓冲液的作用 二 实验操作 实验步骤 蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异 1 分子的形状 大小2 电荷性质和多少3 溶解度4 吸附性质5 对其他分子亲和力 1 凝胶色谱法 1 原理 2 材料 凝胶 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙 路程短 流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部 路程长 流动慢 凝胶是微小的多孔性球体 如葡聚糖或琼脂糖 内部有许多贯穿的通道 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法 概念 2 凝胶电泳法 1 原理 不同蛋白质的带电性质 正电荷或负电荷 电量 形状和大小不同 在电场中受到的作用力大小 方向 阻力不同 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同 2 影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 思考 蛋白质为什么带有电荷 在一定的ph下 蛋白质可解离的基团会带上电荷 3 常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳加入带负电荷多的sds 形成 蛋白质 sds复合物 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小 影响蛋白质分子运动速度的因素 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中 如h2co3 nahco3 nah2po4 na2hpo4等 4 缓冲溶液 洗脱剂作用 配制 调节酸和盐的用量 可配制不同ph的缓冲液 抵制外界酸碱对溶液ph的干扰而保持ph稳定 模拟生物体内的过程 思考 如何配制不同ph值不同的缓冲液 血液组成成分 阅读思考 血液由 和 两部分组成 血细胞中 细胞数量最多 细胞的含量最高的化合物是 该化合物是由 和 构成的 其中每个亚基中都含有一个能与o2和co2结合的 基团 1 洗涤红细胞 阅读思考 洗涤的目的是什么 洗涤的方法是什么 洗涤干净的标志是什么 血液100ml 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 2 释放血红蛋白 阅读思考 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 为了加速释放过程 采取了什么措施 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 烧杯 有机溶剂血红蛋白 4 透析血红蛋白 透析的目的是什么 去除血红蛋白中的小分子杂质 纯化 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 教材图5 19 3 样品的加入和洗脱 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入 轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒 蒸馏水 充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 材料 交联葡聚糖凝胶g 7520mmol l磷酸缓冲液 g 表示什么 75代表什么 注意 色谱柱不能内不能有气泡 装完后 立即用缓冲液洗涤 平衡凝胶是凝胶装填紧密 3 样品的加入和洗脱 1 调液面 2 加样3 再调液面 4 洗脱 5 收集 注意事项 1 红细胞的洗涤 洗涤次数不能过少 低速 短时离心 2 色谱柱的装填 装填尽量紧密 降低颗粒间隙 无气泡 洗脱液不能断