（环境科学专业论文）应用生物柴油修复原油污染海滩的模拟研究.pdf

青岛理工大学工学硕士学位论文 a b s tr a c t b i o d i e s e li sag o o ds o l v e n t ，w i t ht h ea d v a n t a g e so fc h e a p ，b i o d e g r a d a b l e a n d r e n e w a b l e i ti sm e a n i n g f u lt od ot h er e s e a r c ho fc l e a n i n go i l e ds h o r e sw i t hb i o d i e s e l i nt h i s p a p e r , as e r i e so fl a b o r a t o r ye x p e r i m e n t sw e r e c a r r i e do u tt ot e s tt h ep o t e n t i a lo fb i o d i e s e lf o r t h ec l e a n i n go fo i l e ds h o r e l i n e s f i r s t ，b i o d i e s e lw a ss h o w nt oh a v ea c o n s i d e r a b l ec a p a c i t yt o r e l e a s ec r u d eo i lo nt h es a n dw i t hd i f f e r e n to r i g i n ，d o s a g ea n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s s e c o n d l y , t h ee f f e c to fs t i m u l a t i n gt h eb i o d e g r a d a t i o no fc r u d eo i l w i t hd i f f e r e n tk i n d so f b i o d i e s e lw a st e s t e du n d e rd i f f e r e n td o s a g ea n dn i t r o g e ns o u r c e f i n a l l y , c r u d eo i lp o l l u t a n t s o nt h ec o a s t a ls t r u c t u r e sa r eb e e nc l e a n e db yt h eb i o d i e s e l t h ec o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) d i f f e r e n tk i n d so fb i o d i e s e lh a v ed i f f e r e n tc a p a c i t yt or e l e a s ec r u d eo i l f r o mt h e s a n d s u n d e rt h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n ，t h er e l e a s ee f f i c i e n tf r o mh i g ht ol o wi sr a p e s e e d b i o d i e s e l ( 7 2 7 4 ) ，p a l mb i o d i e s e l ( 6 9 6 0 ) ，s o y b e a nb i o d i e s e l ( 5 9 0 8 ) a n dw a s t eo i l b i o d i e s e l ( 5 2 2 5 1 ( 2 ) t h e r e l e a s ee f f i c i e n to fo i lf r o mt h es a n d si n c r e a s ew i t ht h ed o s a g e o f b i o d i e s e l h o w e v e r , w h e nt h ed o s a g ew a sm o r et h a n5 ，t h ep r o m o t i n ge f f e c to fb i o d i e s e l w a sn ol o n g e ro b v i o u su n d e rt h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n ( 3 ) t h ep r o m o t i n ge f f e c tw h i c ht h eb i o d i e s e lr e l e a s et h eo i lf r o mt h es a n d s i si n f l u e n c e b ye n v i r o n m e n t h i g h e rt e m p e r a t u r e ，s m a l l e rd i a m e t e r , 3 0 os a l i n t i t y , p h = 7 5 a n df a s t e r v i b r a t i o nf r e q u e n c ya r eb e n i f i tf a c t o r sf o ri m p r o v et h ep r o m o t i n ge f f e c to ft h eb i o d i e s e l ( 4 ) b i o d i e s e lc a r l s t i m u l a t et h eb i o d e g r a d a t i o no fc r u d eo i lo nb e a c h ，b u tt o om u c h b i o d i e s e lw i l ll e a dt on e g a t i v ei m p a c to fb i o r e m e d i a t i o n a c c o r d i n gt o t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t s 2 5 i st h em o s ts u i t a b l ed o s a g ew h i c hr e m o v e d7 2 c r u d eo i li n2 4d a y s t h e h i g h e s tr e m o v a le f f i c i e n c yi s r e a c h e db yp a l mb i o d i e s e l ( 7 6 ) w h i l et h el o w e s ts o y b e a n b i o d i e s e l ( 6 8 ) ( 5 ) t h eb i o d e g r a d a t i o ne 仃e c to no fc r u d eo i lb ya d d i n gm i x e dn i t r o g e n i sm o r e e f f e c t i v et h a na d d i n gn i t r o g e na l o n e t h ef o r m e rc a l lr e m o v e8 0 o ft h ec r u d eo i li n2 4 d a y s ( 6 ) a d d i n gb i o d i e s e lh a so b v i o u se 能c to nr e m o v i n g h e a v yo i l o na r t i f i c i a ls t r u c t u r e s n e a rt h ec o a s ta n dh a sp r o m o t i n ge 腩c to nb i o d e g r a d i n gh e a v yo i l t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f l i 青岛理工大学工学硕士学位论文 c r u d eo i lw i l la t t a i nt o3 7 5 w h e n2 m lb i o d i e s e li sa d d e d i ti s3 5 h i g h e rt h a nt h a t w i t h o u tb i o d i e s e l k e y w o r d s ：b i o d i e s e l ；b i o r e m e d i a t i o n ；p e t r o l e u mc o n t a m i n a t i o n ；s h o r e l i n e i i i 青岛理工大学工学硕士学位论文 1 1 海洋石油污染概述 第l 章绪论 1 1 1 海洋石油污染的来源 石油是当今社会生产发展必不可少的能源和材料。随着石油工业和交通运输业的发展， 石油的水上运输量逐年增加，每年都有相当数量的石油由于突发事件进入海洋、河流和其它 水域，造成极其严重的石油污染。据统计我国每年发生的海上溢油事故约有5 0 0 起，对海洋 生态平衡构成了严重威胁【l 】。此外，近海采油平台及输油管的石油泄漏事故，也是造成海洋 石油污染的重要原因。 石油污染物可以经过多种途径进入海洋环境，按其来源可分为天然来源( 约占8 ) 和 人类活动来源( 约占9 2 ) 1 2 1 。天然来源包括海底活动、大陆架和含油沉积岩的渗漏，人类 活动来源包括海上石油丌采的泄漏与井喷事故、油轮事故、含油废气沉降和工业民用含油废 水排放。其中造成海洋石油污染的主要途径是工业民用含油废水的排放、油轮事故和石油开 采过程的泄露等。据统计【3 j ，每年通过各种途径进入海洋的石油和石油产品约为2 0 0 1 0 0 0 万 吨，约占世界石油总产量的0 5 1 4 5 】。全球主要污染源入海量估算见表l 一1 。 表1 1 全球主要污染源石油烃入海量估算i b i来源：n r c 修订数据 我国是石油生产和消费的大国，根据2 0 0 8 年国家海洋局公布的中国海洋环境质量公报显 1 青岛理工大学工学硕士学位论又 示，2 0 0 8 年我国通过排污口和主要河流排入海洋的石油污染物分别为0 9 万吨和7 4 9 万吨， 这与2 0 0 6 年和2 0 0 7 年的数据相比略有下降。然而海洋运输过程中发生的石油污染事故的情 况却不容乐观。我国拥有各种机动船只1 0 多万艘，每年进入我国港v i 和航经我国管辖海域的 外轮几万艘次。据不完全统计，1 9 7 3 2 0 0 3 的3 0 年间，我国沿海共发生溢油事故2 0 0 0 多起， 平均每4 天就发生一起，其中危害较大的溢油事故5 0 多起f 7 1 。2 0 0 4 年1 2 月7 日巴拿马籍集 装箱船和德国籍集装箱船在珠江口发生碰撞。德国籍船燃油油舱破损1 2 3 0 吨燃油泄漏，溢油 在海上形成了长9 海里、宽2 0 0 米的油带，造成我国近年来较大的一次海洋石油污染事故。 1 1 2 海洋石油污染的危害 。 石油污染会对海洋环境、生态、经济和人类生产生活等造成了巨大的危害，石油进入海 洋后造成的污染对海洋环境和海洋生物资源的危害是相当严重的，一起大规模的溢油污染事 故能引起大面积海域严重缺氧，造成局部“海洋沙漠”化，致使大量龟虾和海鸟等生物死亡； 浮油被海浪冲到海岸，造成海滩沾污，致使海滩荒芜，且破坏海产养殖和盐田生产，污染、 毁坏滨海旅游区；若清理不及时，还易发生爆炸和火灾，酿成更严重的经济损失和人员伤亡 1 8 - 1 2 】。海洋石油污染的危害按其受害对象可分为对生态环境的危害以及对人类社会的危害。 1 生态环境危害 影响海洋与大气环境：石油进入海洋后会迅速扩散成一层闪闪发亮的油膜，一般情况 下，1 吨石油所形成的油膜可以覆盖1 2 平方公里范围的海面1 3 】。油膜可以阻断水体与空气中 0 2 与c 0 2 的交换，造成水体中消耗的0 2 无法得到及时的补充。并且破坏了水体中c 0 2 的平 衡，影响海水的缓冲p h 作用。同时油膜破坏了c 0 2 的交换平衡，必将加剧全球的温室效应。 并且两极地区海域冰面上的油膜，能增加对太阳能的吸收而加速冰层的融化，使海平面上升。 全球气候受到恶劣的影响。 对食物链的影响：海面的油膜能够降低表层海水的目光辐射量，抑制浮游植物的光合 作用，引起靠光合作用生长的浮游植物数量减少；而石油烃的降解需要大量的0 2 ，而海水中 0 2 的主要来源又被油膜阻隔，直接导致海水严重缺氧，微生物数量下降【1 4 j ，从而破坏了海洋 食物链的完整性。 对动物的影响：石油烃中的有毒物质能杀死大量的鱼类。石油会粘在鱼鳃上，使鱼类 在短时问内窒息而死。同时油块能粘住鱼卵和幼鱼，影响其生长发生畸变【1 5 一们。海洋石油污 染对海鸟的危害也很明显，常常造成海鸟的大量死亡。石油对海鸟的主要影响在于它可以渗 2 青岛理工大学工学硕士学位论文 入或粘住其羽毛，破坏羽毛的组织结构。在海鸟中，石油污染对无飞翔能力的企鹅和飞翔能 力弱的海鸭、潜水鸟等鸟类的危害最大。 2 人类社会危害 对水产业的影响：石油污染无不但可以杀死鱼类，同时还会改变某些鱼类的洄游路线； 沾污渔网、养殖器材和渔获物；受污染的鱼、贝等海产品难以销售或不能食用1 1 7 】。 对经济的影响：石油污染物尤其是重油极易粘附在海边的礁石和沙滩上，使海岸景观 遭到严重的破坏，直接影响到靠海滨浴场、沙滩发展的旅游业，影响滨海城市的形象。溢油 对岸线沙，同时会产生高额的清污费用。 1 1 3 石油污染物的性质及其在海洋中的转化 石油又称原油，是从地下深处开采的棕黑色可燃粘稠液体，是地球在形成的不同历史时 期，由植物或动物等有机物残骸生成的。由于生成条件不同，其物理、化学性质存在很大的 差异。 烷烃是组成石油的主要成分，随相对分子质量的增加，烷烃分别以气、液、固三态存在 于石油中。在常温下，c 5 c 1 5 的烷烃为液态，含5 1 2 个碳原子的烷烃为汽油，沸点在 1 0 0 1 8 0 ；9 2 2 个碳原子为煤油、柴油和机油，其中煤油沸点在2 3 5 2 8 5 ，柴油沸点在 2 7 0 2 8 0 ，机油沸点在4 1 0 4 8 0 ，c 1 6 以上烃为固态，一般多以溶解状态存在于石油中， 当温度降低时出现结晶，这种烃类为蜡。机油、重燃油、润滑油和润滑脂含碳原子在2 9 3 6 之间。石油中正构烷烃的碳数一般达到4 0 ，除主要含直链烷烃以外，还含有支链烷烃。支链 烷烃中最重要的是异戊二烯类化合物，它以姥鱿烷和植烷为代表。支烷烃无毒，可被多数微 生物降解，但分支越多越难于降解 1 8 a 9 】。 石油中环烷烃带5 6 个碳原子，环状排列，占石油含量的3 0 6 0 。除环戊烷和环己烷 外，还有二环和多环烷烃。很重要的小量组分为淄烷，萜烷类。环烷烃含量高时，油品粘度 大。环烷烃是润滑油的主要成分，微生物很难降解环烷烃。 芳香烃占石油含量的2 4 ，有单环类( 如苯、甲苯、二甲苯) ，还含有双环( 主要是蔡) 、 三环芳烃( 如葱和菲) 和三环以上多环烃( 如苯并花、苯并葱多核芳烃) 。芳烃对生物的毒性最大， 特别是多环芳烃。石油中的非烃组分可分为6 类：含硫化合物硫化物，含氮化合物，硫醚， 含氧化合物，沥青烯和痕量金属。在痕量金属中，钒和镍的含量有时每升可达几毫克【2 0 1 。 溢油污染发生后，石油烃在海面迅速扩散成为一层油膜。在海浪和风力的作用下，油膜 3 青岛理工大学工学硕士学位论文 越来越薄，面积越来越大，这将有利于石油烃形态的转化1 2 。 石油污染物在海水中的迁移转化过程如图1 1 所示。石油中一般有3 0 4 0 的可挥发物 质【2 2 】，不同种类的石油烃组分不同，蒸发过程也有差异。一般认为沸点低于3 7 。c 的石油烃类 几天之内就可以全部蒸发掉，并在大气中发生一系列的光氧化分解。而石油中不易蒸发的高 沸点组分则残留于海面上，并且相互凝集，最后形成焦油。残留于海面的油膜，在阳光的照 射下，也能发生氧化分解。在强光的照射下有 1 0 的烃类被氧化为可溶性物质溶于水中。 关于烃类的风化速度洋见表1 2 。 表1 2 烃类的风化速度【2 3 1 化合物风化速率( d ) n c 2 8 4 0 3 0 2 0 l o 5 o 另外海洋生物对石油的转化作用也是巨大的。这主要包括两方面的作用：海洋生物摄 取石油烃的代谢作用：有些海洋动物、植物体内含有转化烃类的酶，能主动或被动吸收或富 集石油烃类1 2 4 j 。海洋微生物对石油的降解作用f 2 5 1 。微生物对石油烃的降解方式与石油颗粒 的形态、运动和分布有关。溢油污染发生后，土著石油降解菌倾向于降解易降解组分( 如饱 和烃及小分子的芳香烃) 。如果仅仅依赖土著石油降解菌的消耗，溢油的消除可能需要很长的 时间【2 6 j 4 青岛理工大学工学硕士学位论文 图1 1 石油在海洋环境中的风化过程 经过上述转化过程，石油烃类污染物在海水中的存在形式有3 种：漂浮在海面的油膜 ( 浮油) ：溶解分散态的石油烃类( 包括溶解和乳化状态) ；凝聚态残余物( 包括漂浮在 海面的焦油球和沉积物中残留物) 1 2 7 l 。石油污染物不同于其他的可溶性溶质，它具有很强的 疏水性，在海水中的溶解度非常小。因此，石油在海水中的存在形态主要是浮油和乳化态的 油。其中，浮油占总溢油量的6 0 8 0 ，其在海水中的分散颗粒较大，是海洋石油污染物的 主要组成部分，并且易于和水分离；乳化态的油在水中的分散颗粒较小，存在形态比较稳定， 不易于和海水分离，乳化油的溶解度为5 1 5 m g l t 2 引。 1 1 4 海洋石油污染的处理方法 5 青岛理工大学工学硕士学位论文 目前对于处理海洋石油污染的方法可以大致分为三种，分别是物理法，化学法以及生物 法。 1 物理处理法 物理法是利用收油船、围油栏、抽油机等机械装置对海面浮油进行收集。目前利用物理 方法和机械装置消除海面及海岸带油污的效率最高，但对于厚度小于0 3c m 的薄油层和乳化 油效果较差，在潮间带与沙滩环境中不便操作。 2 化学处理法 化学处理法有传统化学处理法和现代化学处理法。传统化学处理法为燃烧法，即通过燃 烧将大量浮油在短时间内彻底烧净，费用低廉，效果好。但该法也存在不利的一面：不完全 燃烧会放出浓烟，其中包括大量芳烃，它们也会污染海洋、大气，且在近岸使用危险甚大。 该法多用于外海。现代化学处理法指用化学处理剂改变海中油的存在形成，使其凝为油块为 机械装置回收或乳化分散到海水中让其自然消除。本法多用于恶劣海况、气象条件下大面积 除油，化学处理剂包括4 类：乳化分散剂( 又称消油剂) 、凝油剂、集油剂、沉降剂。但是这 些化学药剂本身多为难以降解的物质，也具有一定的毒性，易造成二次污染，并且不能从根 本上消除污染物2 9 】。 3 生物修复法 在天然环境中存在一些具有降解石油烃类的噬油微生物，它们也是石油烃类的自然归宿 之一。在自然环境中细菌、真菌、酵母菌、霉菌都能参与烃类降解。生物法就是通过各种手 段刺激微生物对石油烃类的代谢，从而达到除油的目的。此的优点在于迅速、无残毒、低成 本、占用资源少、便于在海滩环境操作因此在近年来受到广泛的关注和应用。 1 2 生物修复研究进展 1 2 1 生物修复的原理与方法 生物修复技术是近年来新兴的- - f 环境生物技术，具有工程简单，处理费用相对较低、 清洁水平较高等优点。某些西方国家早在2 0 世纪8 0 年代中期就开展了生物修复技术的初步 研究工作，并完成了一些实用的处理工程。目前生物修复技术在清除或减少土壤、地表水、 地下水、废水、污泥、工业废弃物及气体中的化学物质方面的应用已获得成功3 0 1 。 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 技术是利用微生物、植物及其他生物，将环境中的危险性污染 6 青岛理工大学工学硕士学位论文 物降解为二氧化碳和水或转化为其他无害物质的工程技术系统f 3 1 1 。生物修复的概念最初应来 源于微生物对污染环境的治理，至今许多文献仍沿用b i o r e m e d i a t i o n 一词，专指微生物修复。 大多数环境中都存在着自然的微生物降解转化有毒有机污染物和石油的过程。细菌、真 菌和藻类等微生物能以这些有机物作为碳源和能源，一方面满足自身生长繁殖的需要，同时 将这些有机污染物降解转化为低毒或无毒的有机物和无机物，如c 0 2 、h 2 0 、简单的醇或酸 等，达到净化环境的目的。a p r i lt m 等【3 2 】从石油污染土壤中分离出4 株能够降解石油，其中 3 株菌能够降解线形脂肪族石油烃，另一株菌能降解挥发性的链烷烃，如乙烷、丙烷、丁烷 等。陈亚丽等【3 3 】从湖北沙市地区农药污染土样中分离出l 株有机磷农药降解细菌w b c 2 3 ， 该菌在单纯无机盐培养基中能耐受8 0 0 m g l 的甲基对硫磷，并能以甲基对硫磷作为唯一碳源、 氮源，将其作为生长基质彻底降解。崔中利等【3 4 】分离到1 株假单胞菌p 3 ，该菌能够以对硝基 苯酚为唯一的碳源和氮源进行生长，通过接合转移的手段将甲基对硫磷水解酶基因m p d 克隆 至p 3 菌后，获得的基因工程菌p m 能够以甲基对硫磷为唯一碳源进行生长。 1 2 2 微生物降解石油烃的机理 石油烃进入降解微生物的细胞膜后，可通过三种同化途径被降解：好氧呼吸、厌氧呼吸 和发酵作用。一般情况下，生物降解石油类物质主要是通过好氧生物的降解作用产生细胞体 和c 0 2 来完成的。石油类物质的降解并不能简单看作某一同化作用，而是一个非常复杂的过 程。简单来说，这一过程可用下面的式子表示： 石油类物质+ 生物+ 0 2 + n 源- c 0 2 + h 2 0 + 副产物+ 细胞体 对于烷烃类，生物降解过程可由下式表达： 烷烃一醇类一脂肪酸一乙酸盐类- - c 0 2 + h 2 0 + 细胞体 大量研究发现，石油类物质的可降解性是由其化学组成决定的f 3 5 。7 1 。例如，c 1 0 c 2 4 的 中等长度的链烃降解速度相当快；而更长链的烷烃则不易降解，当分子量超过5 0 0 - 6 0 0 ，一 般不作为微生物的碳源。石油所含各种烃类多达上千种，所以其降解速率难以有效预测。很 多研究人员对石油类污染物的降解与其化学结构的关系作了较为详细的分析研究【3 8 】。总的来 说，烷烃、芳香烃中的c 1 0 c 2 2 最易降解；c 1 c 6 一般挥发较快，在环境中主要以气体形式 存在，而且短链烃由于其结构比较稳定，只有少量的微生物对其有降解作用；c 2 2 以上的烃 类水溶性很差，一般情况下是固体，微生物对其降解作用非常有限。 含有支链结构和芳香结构的烃类降解速度慢于相同个数碳的直链烃，这可能是支链i 二的 7 青岛理工大学工学硕士学位论文 叔碳或季碳影响了其生物降解过程。研究还发现，降解环烷烃需要更多微生物的联合作用。 同时，c i o 以下的环烷烃对微生物膜表现出较强的毒性。含有4 个环以上的环烷烃和芳香烃， 或含有焦油、沥青质组份的生物降解速度更慢【3 9 1 。这些物质大量残留在生物降解的最终产物 中，形成了降解后的主要残留物质一矿化物”，这目前也是生物修复的重点研究方向之一。 1 2 3 生物修复的强化技术 有机污染物质的降解转化实际上是由微生物细胞内一系列活性酶催化进行的氧化、还原、 水解和异构化等过程【4 0 1 。但由于污染现场环境中经常存在溶解氧( 或其他电子受体) 不足，营 养盐缺乏和高效微生物生长缓慢等限制性因素，土著微生物自然净化速度很慢，需要采用各 种方法来强化，例如提供0 2 或其他电子受体，添加氮、磷营养盐，接种经驯化培养的高效微 生物等，以便能够迅速清除污染物。 目前所经常使用的生物修复强化方法为以下三种 4 0 , 4 1 】 ( 1 ) 接种石油降解菌 这种方法是通过富集分离驯化的外来微生物对污染物降级进行强化的手段，但是研究表 明接种效果并不明显，海洋中存在的土著微生物常常会影响接种微生物的活动。另外在实验 室中的基因工程菌可以迅速降解石油，但是，在开放环境中释放基因工程菌却一直引起争论 的问题。 ( 2 ) 使用分散剂 分散剂即表面活性剂，可以增加细菌对石油的利用性。但并不是所有的表面活性剂均有 促进作用，许多表面活性剂由于其毒性和持久性会造成环境污染，特别是沿岸地区的环境污 染；而生物表面活性剂价格相对较高，不利于大量应用。并且对于海滩环境来说表面活性剂 的作用要比海水中减弱许多。 ( 3 ) 使用氮磷营养盐 使用氮磷营养盐是最简单而有效的方法。在海洋溢油后，石油降解菌会大量繁殖，碳源 充足，限制降解的因素足氧和营养盐。使用的营养盐有三类：缓释肥料、亲油肥料和水溶性 肥料。 缓施肥料：要求具有合适的释放速率，通过海潮可以将营养物质缓慢的释放出来。 亲油肥料：可使营养盐“溶解”到油中，在油相中螯合的营养盐可以促进细菌在表面生 长。 8 青岛理工大学工学硕士学位论文 水溶性肥料：该方法一般使用硝酸铵及三聚磷酸盐与海水混合，处理海滩上的油墨。所 施用量为氮6 9 9 m 2 ，磷1 5 9 m 2 。 营养盐调控法的科学高效使之成为目前生物修复的主要手段，但对于海滩环境来说，原 油吸附于砂砾和岩石表面，当营养盐存在时微生物与石油的接触机会较少又成为此法的瓶颈， 影响了生物修复的效果。 1 2 4 生物修复技术的发展 生物修复的大规模应用首先是从治理海洋溢油开始的。对海洋溢油的生物修复研究工作 先后经历了“探索期 ( 1 9 8 9 之前) 、“繁荣期”( 1 9 8 9 1 9 9 1 ) 和“成熟期”( 1 9 9 2 之后) 3 个阶段 【4 2 j 。海洋环境中广泛分布着降解石油烃类的微生物，但是石油的理化性质和海水中氮、磷营 养盐缺乏等因素限制了土著微生物的活性，只有通过人为添加肥料、表面活性剂及接种高效 石油降解微生物等手段促进微生物对石油的降解。1 9 8 9 年在美国阿拉斯加e x x o nv a l d e z 溢 油事故中，美国环保局首次尝试利用生物修复技术来清除海滩溢油。在经过大量室内和现场 实验后，筛选出亲油性肥料e a p 2 2 t m 作为土著降解石油微生物的营养盐【4 3 1 ，在清除海滩溢 油的实际应用中发挥了重要作用，取得了很好的治理效果，开创了生物修复技术在海洋污染 环境中成功应用的先河。在1 9 9 0 年发生的四次海洋溢油事故中美国政府鼓励使用生物修复技 术，有的取得成功，有的效果不太明显。造成这种结果的原因是多方面的，其中数据资料不 足，实施方案本身不完善是主要的影响因素【4 2 1 。j o u d o t 等1 在对潮间带原油进行微生物降 解实验中发现，总油、脂肪烃、环烷烃和芳烃的降解率分别是( 4 0 4 - 7 ) 、( 8 3 4 - 6 ) 、( 4 9 4 - l o ) 和( 5 1 8 ) ，沥青质和胶质几乎没有降解。在加入了缓释肥料后，与对照区相比降解率无明 显区别，认为是由于本底氮、磷浓度较高的缘故，并提出当沉积物间隙水中氮本底浓度1 0 0 l m o l l 时，加入肥料对石油降解所起的作用是非常有限的。t o y o h a r th o z u m i 等1 4 5 】发现， n a k h o d k a 溢油事故使受污染海岸带微生物群落结构发生变化，具有降解能力的微生物成为优 势种，但是在自然条件下，只有饱和碳氢化合物及一些小分子芳烃最容易分解，其他成分如 稠环芳烃、胶质、沥青质等自然降解过程很慢，在加入菌种后，提高了重油的降解率。目前， 利用生物修复技术治理海洋溢油的焦点集中在如何提高生物修复的效率以及营养盐、表面活 性剂和外源微生物的使用是否会造成其他的海洋生态灾害等问题上1 4 引。 1 2 5 生物柴油在生物修复中的应用 9 青岛理工大学工学硕士学位论文 生物柴油作为一种新型绿色能源，具有低毒、绿色环保、可再生的优点，目前其价格也 显著低于其他增效剂。生物柴油促进生物修复的机理可分为两类，一方面生物柴油可以增强 石油污染物的流动性和分散度，使得微生物可以更多的接触到石油类物质；另一方面，生物 柴油作为碳源可以促进微生物对原油的共代谢作用。但是生物柴油作为石油污染生物修复的 增效剂尚未展开系统的研究。 有些有机污染物不能作为碳源和能源被微生物利用，但是在添加其他的基质提供碳源和 能源后也能被降解转化，这就是共代谢( c o m e t a b o l i s m ) 4 6 i 。研究表明，微生物的共代谢作用 对于难降解污染物的彻底分解起着重要作用。如甲烷氧化菌产生的单加氧酶足一种非特异性 酶，可以通过共代谢降解多种污染物，包括对人体健康有严重威胁的三氯乙烯( t c e ) 和多氯 联苯( p c bs ) 等【4 7 l 。分枝杆菌( my c o b a c t e r i u m ) 可以矿化芘，但是不能以芘为唯一的碳源和能 源，如果提供结构类似的基质，可以诱导分枝杆菌矿化几种p a h s l 4 6 l 。生物柴油的主要成分 水解后产生脂肪酸，对于大多数微生物来讲脂肪酸是便于利用的碳源，极易进入三羧酸循环 产生能量【1 8 i ，因此生物柴油可以作为一种共代谢底物。 国外学者对生物柴油修复石油污染的研究展开较早，m u d g e 及p e r e i r a l 4 s l 向原油污染的砂 中施加生物柴油刺激了油的溶出和降解。t a y l o r 及j o n e s l 4 9 1 向煤焦油污染的土壤中施加生物柴 油增加了焦油的溶解度和分散度，进而促进了焦油中p a h 的降解。j o r g e l i n a 等【5 0 j 的研究则表 明生物柴油与原油混合后可以明显的改善原油的密度和粘度，并促进微生物对原油的利用和 降解，缩短原油的降解周期。国内学者在此方面研究起步较晚，王晓光等【5 1 i 采用生物柴油淋 洗了含有多环芳烃的土壤，发现生物柴油对土壤中的多环芳烃有良好的去除效果。陈金思等 【5 2 】则对棉籽生物柴油和石油污染物的可降解性进行了测定，发现生物柴油的含量越高，混合 油的可降解性越好。但是以上研究均没有考虑海滩环境，对于营养盐和环境因素的影响也较 少研究。 1 3 生物柴油概述 1 3 1 生物柴油的发展 生物柴油( b i o d i e s e l ) 是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂，以 及动物油脂、废餐饮油等为原料通过酯交换工艺制成的甲酯或乙酯燃料，这种燃料可供内燃 机使用。与普通柴油相比，生物柴油覃有利环保，使用生物柴油作燃料油，尾气中有毒有机 1 0 青岛理工大学工学硕士学位论文 物排放量仅为石化柴油的1 1 0 ，颗粒物为2 0 ，c 0 2 和c o 排放量仅为1 0 。生物柴油因其环境 污染物质释放量少、使用安全( 相对核能) 、使用范围广( 相对风能、地热能) 和可进行生物 降解，是实施拯救地球环保系列技术的重要组成部分，已成为当今国际上新能源开发的热点。 国外生物柴油及其生产技术的研究，始于5 0 年代末6 0 年代初，发展于7 0 年代，8 0 年代以 后迅速发展。2 0 世纪8 0 年代中后期，美国、法国、意大利等相继成立了专门的生物柴油研究 机构，投入大量的人力物力，进行生物柴油的研究；政府也通过政策优惠手段，鼓励生物柴 油的研究、生产和应用【5 引。生物柴油迅速成为新经济产业的亮点。 我国的生物柴油产业是个新兴行业，尚处于发展初期。制约中国生物柴油产业发展的瓶 颈是缺乏油脂资源。中国的生物柴油产业将立足于以非食用油原料为主，市场潜力巨大。中 国政府重视生物柴油产业的发展，已经制定了一些相关的法律和法规，正从资源开发、技术 保证、质量标准和财税扶持等方面采取措施，促进该行业健康、有序和可持续发展【5 4 1 。生物 柴油在未来的中国将是一种廉价环保的新型资源。 1 3 2 生物柴油的成分和性质 不同的生物柴油原料所生产的生物柴油具有不同的成分，但只含有c 、h 、o - _ - - 种元素， 主要都是动植物脂肪酸的甲酯，常见的成分有棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸 甲酯和亚麻酸甲酯，各种甲酯含量视原料油的不同而具有差别【5 5 】。在我国目前的环境下，常 见易得的生物柴油原料有菜籽、大豆、棕榈、棉籽及废油脂等。 生产生物柴油的反应时酯化反应，通过投加催化剂和改变环境，游离脂肪酸和甘油三酯 与甲醇反应生成脂肪酸甲酯。 主要反应原理： 酯化反应 r i - c o o h + r i c o o c h 3 游离脂8 0 。( 2脂肪酸 酯交换反应 r j 。c o o - c ：h 2 o h - r 1 - c o o c h 3 q h 2 。o h r 2 c 0 0 1 h + 3c h 3 0 h r 2 一c o o c h 3 年c h - o h r 3 - c o o 量h 2 8 ，0 。c r 3 c o o c h 3d h ，o h 1 油三酯( 油脂)甲醇脂肪酸甲酯 甘油 青岛理工大学工学硕士学位论文 除此之外在碱性环境下生物柴油的另一个重要性质是皂化反应，其产物为脂肪酸盐。以 氢氧化钾为例表示的皂化反应： 皂化反应 r i c o o h + k r i c o o k + h 2 0 1 4 课题的研究内容和意义 1 4 1 研究的意义 利用传统的物理法和化学法处理海滩原油污染造价高效果差，而新兴的生物修复方法虽 然经济有效，但是在处理过程中遇到很多问题。一方面要增强原油与微生物的接触机会，另 一方面又不能使用有毒的或造价高的增效药剂。除此之外难以被微生物利用的矿化物也是生 物修复的一大难题。因此本研究着眼于解决以上问题，选择经济环保的生物柴油作为海滩石 油污染修复的增效剂，通过模拟实验研究生物柴油对海滩原油污染生物修复的影响，为以后 进行现场的修复实验提供重要依据。 本课题的创新点： ( 1 ) 首次提出生物柴油营养调控法联合修复原油污染海滩 与国内外现有的研究不同，本项目首次提出生物柴油营养调控法联合修复石油污染海滩： 通过生物柴油提高原油的生物可用性，通过补充氮磷营养解决降解石油过程中碳源过剩、氮 磷不足的问题，克服了单一修复方法的局限性，抓住了海滩石油污染生物修复中的关键问题， 迄今国内外未见相同报道。 ( 2 ) 采用具备环境友好性的再生材料 本课题以提高石油污染物生物可用性为核心，采用具备环境友好性的再生材料一生物 柴油，巧妙地利用生物柴油的无毒、易降解及对石油的增溶效应，既贯彻了资源再生的环保 理念，又克服了传统生物修复方法花费很高但修复效果欠佳的弊端，并可以通过共代谢作用 促进矿化物的降解。 1 4 2 研究的内容 本实验的主要研究内容有几下几部分： ( 1 ) 生物柴油对原油污染砂砾释放油的影响 1 2 青岛理工大学工学硕士学位论文 通过批量摇瓶实验考察不同种类和不同投加量的生物柴油对砂砾上原油释放的影响作用， 并采用动力学方程进行拟合；单独改变实验的温度、盐度、初始p h 值、粒径及振荡频率， 以研究不同环境条件下生物柴油对原油释放的影响。 ( 2 ) 生物柴油营养盐联合修复原油污染海滩的模拟研究 通过摇瓶模拟实验研究不同生物柴油种类和投加量对海滩油污砂砾生物修复的影响作用， 并考察不同形态的氮源与生物柴油联合修复的作用效果。 ( 3 ) 生物柴油清除海边构筑物上原油污染物的模拟研究 通过烧杯模拟实验研究生物柴油对人造砖片上原油污染物的去除效果。 1 3 青岛理工大学工学硕士学位论文 2 1 实验材料 第2 章实验材料与方法 2 1 1 仪器与药品 实验过程中使用的主要仪器和设备有： u v - 2 0 0 0 型紫外分光光度计：尤尼柯( 上海) 仪器有限公司； s h a 2 a 型水浴恒温振荡器：江苏亿通电子有限公司； y n 一4 型康氏振荡器：金坛神科仪器厂； k h 3 2 0 0 b 型超声波振荡器：昆山禾创超声仪器有限公司； s e n s i o n1 5 6 型便携式参数测量仪：美国哈希公司； f a 2 0 0 4 n 型电子天平：上海天平仪器厂； 8 0 2 型台式高速离心机：上海手术器械厂； 实验过程中使用的药品有： 正己烷( a r ) 、无水硫酸钠( a r ) 、氯化钠( a r ) 、氢氧化钠( a r ) 、硝酸铵( a r ) 、尿 素( a r ) 、磷酸氢二钾( a r ) 、氯化钠( a r ) 、氯化铁( a r ) 、硫酸镁( a r ) 、浓硫酸( g r ) 。 2 1 2 实验材料及性质 1 海水与砂砾：实验所用海水取自青岛市汇泉湾附近，使用前经过0 4 5 u m 滤膜过滤处理， 以消除微生物和杂质对实验的影响。海水的p h = 7 8 0 、盐度为3 0 0 。实验用砂砾取自青岛汇 泉湾砂质海岸，使用前用酸浸泡，并作灭菌处理。 2 油品：实验模拟污染用油为原油，取自青岛石化厂，为进i ：1 萨西原油与比利牛斯原油 混合后初步蒸馏所得轻质原油；实验所用稠油取自胜利油田，未经蒸馏处理。为更好的模拟 石油污染的现场，减小油品挥发对实验结果的影响，分别将原油和稠油倒入大烧杯中，在通 风、室温条仲下风化15 d 后装入试剂瓶中备用。其油品性质详见表2 1 。 1 4 青岛理工大学工学硕士学位论文 3 生物柴油：实验所用生物柴油分为植物性生物柴油和废油脂回收利用制作生物柴油。 植物性生物柴油为实验室自制，其原料为食用菜籽油、大豆油和棕榈油。废油脂生物柴油由 青岛福瑞斯生物能源科技开发有限公司提供。各种生物柴油的性质详见表2 。2 。 表2 2 生物柴油主要参数 4 实验用污染砂砾的制备：将从海边取回的天然砂砾洗净，将原砂依次过6 0 目( 0 2 8 m m ) 、 1 0 0 目( 0 1 5 4 m m ) 和1 4 0 目( 0 1 0 9 m m ) 网筛，将过筛后的砂灭菌烘干并按粒径大小分为三组。 称取一定粒径的砂砾l o o g 于干燥大烧杯中，在干燥小烧杯中加入原油约1 5 9 ，并用2 0 m l 石 油醚溶解后倒入装有砂砾的大烧杯中，用玻璃棒搅拌至没有液体出现为止，在通风条件下风 干3 d 后装入具塞玻璃瓶中备用( 注：需在干燥器内保存) 。其余两组砂砾的制备同上，经测 定所配置的各粒径污染砂砾的含油量均在1 5 m g g 左右。砂砾性质详见表2 3 。 表2 3 实验用砂砾主要参数 1 5 青岛理工大学工学硕士学位论文 2 1 3 微生物的培养和菌悬液的制备 1 实验菌种：本实验用于生物修复的菌种，是由青岛轮渡附近长期被石油污染的海水中 富集驯化后得到的混合菌。 2 实验用培养基： 无机盐培养液：按要求称取n h 4 n 0 3l g ，k 2 h p 0 40 7 9 ，k h 2 p 0 40 3 9 ，m g s 0 40 1 9 ，以 及痕量的c a c l 2 、f e p 0 4 、f e s 0 4 ，将上述药品加入到1 0 0 0 m l 灭菌的陈海水中，使用n a o h 调节p h 到7 5 7 8 ，摇匀后可得无机盐培养液。 液体培养基：在无机盐培养液中分另j j h 入0 。1 ( v v ) 的原油和0 群柴油，搅拌均匀后可 得石油降解菌的液体培养基。 固体培养基：在1 0 0 m l 无机盐培养液中加入1 5 9 的琼脂j 加热至琼脂完全溶解，冷却后 得实验用固体培养基，此培养基同时用于菌种保藏。 3 菌种的驯化和富集： 在1 0 0 0 m l 由轮渡附近海域采集的被污染的天然海水中加入n h a n 0 3l g ，k 2 h p 0 40 7 9 ， k h 2 p 0 40 3 9 ，m g s 0 4o 1 9 ，以及痕量的c a c l 2 、f e p 0 4 、f e s 0 4 ，混匀后取2 0 0 m l 样品海水加 入到3 0 0 m l 三角瓶中，在恒温振荡器上于2 8 。c ，1 5 0 r m i n 培养1 6 天，然后取少量培养液加 入到2 0 0 m l 新鲜的液体培养基中，于相同条件下培养1 6 天，得到简单驯化的混合菌液。 在无菌条件下，用接种环将混合液中的细菌接种到固体培养基中，在3 0 。c 下于培养箱中 培养3 天。将筛选出来可降解石油的细菌转接到固体培养基中进行斜面培养，在3 0 下于培 养箱中培养3 天。 4 菌悬液的制备：在制备好的混合菌液中依然含有部分营养盐和污染物，为了防止这些 物质对后续实验的影响，将菌液在4 0 0 0 r p m 的离心机中离心1 0 分钟。将上清液倒出再用生 理盐水反复清洗2 到3 次，之后将菌液倒入烧杯形成混合菌悬液。 2 2 实验方法 2 2 1 微生物量的测定： 本实验采用于重法对微生物的量进行测定，取培养液5 m l 于预先烘干称重的离心管中以 8 0 0 0r m i n 的速度离心l o m i n ，弃掉上清液，在鼓风干燥箱中7 0 烘干2 4 h ，冷却后称量计算 1 6 青岛理工大学工学硕士学位论文 微生物的量，以g , 1 表示【5 6 1 。 2 2 2 盐度与p h 的测量 对盐度与p h 值的测量采用便携式参数测量仪进行测量。 2 2 3 原油测定的方法及原理： 对于石油污染物的测量，通常使用的方法有重量法、红外分光光度法、紫外分光光度法 和荧光法等方法。根据实验条件和需要，依据中华人民共和国环境行业标准海洋监测规范 ( h y 0 0 3 - 4 9 1 1 0 4 ) ，本实验中油浓度的测定采用紫外分光光度法。 紫外法的原理是：原油成分中所含的具有共扼体系的有机物质或官能团在紫外光区有特 征吸收峰：带有苯环的芳香族化合物主要吸收波长为2 5 0 2 6 0 n m ，带有共扼双键的有机化合 物主要吸收波长为2 1 5 2 3 0 n m 。一般原油具有两个吸收峰，分别是2 2 5 n m 及2 5 6 n m ，部分分 流后油品( 如柴油、润滑油等) 的吸收波峰也与原油相近，而部分油品只有一个吸收峰，少 数的成品油( 汽油)