（发酵工程专业论文）从微藻中筛选抗肿瘤活性藻株及活性物质的分离纯化研究.pdf

摘要 海洋微藻是海洋蕴藏的丰富资源之一，微藻抗肿瘤活性物质已成为新的研究热点。本 文采用细胞毒活性筛选模型，筛出了对肿瘤细胞系h e l a 有细胞毒活性的微藻l o 株：等鞭 金藻h 2 9 ( i s o c h r y s i s g a l b a n a p a r k e h 2 9 ) 、等鞭会藻3 0 1 1 ( 1 s o c h r y s i s g a l b a n ap a r k e3 0 1 1 ) 、等 鞭会藻8 7 0 1 ( i s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k e8 7 0 1 ) 、扁藻( p l a t y m o n a ss u b c o r d i f o r m i s ) 、小球藻 ( c h l o r e l l as a c c h a r o p h i l a ) 、三角褐指藻( p h a e o d a c r y l u mt r i c o r m u t u m ) 、牟氏角毛藻 ( c h a e t o c o r e r o sm u e l l e r i ) 、盐藻( d u n a l i e l l a ) 、鱼腥藻似n a b a e n a ，淡水藻) 、栅藻( s c e n e d e s m u s ， 淡水藻) 。由实验结果表明等鞭会藻h 2 9 的7 种萃取液对h e l a 细胞均表现出了极强的抑制 作用，抑制率分别为：环己烷- - 9 0 3 2 、乙酸乙酯9 3 7 9 、乙醚- - 9 0 1 6 、甲苯- - 9 1 2 3 、正戊醇- - 9 5 9 1 、丙酮- - 9 6 4 5 、乙醇- - 9 0 8 3 。 优化培养等鞭会藻h 2 9 的试验中，确定了等鞭会藻h 2 9 最适生长温度为2 4 ，最适 生长光照强度为4 5 0 0l u x 。考察舵培养基中的各个主要成分，最后得到结果为：等鞭金藻 培养基中以n a n 0 3 为最佳n 源；f e c 6 h 5 0 7 5 h 2 0 为最佳f e 源：k h 2 p 0 4 为最佳p 源。 以等鞭金藻h 2 9 的丙酮萃取相为研究对象。采用薄层层析和柱层析等方法分离纯化等 鞭金藻h 2 9 的丙酮萃取相，利用细胞毒活性模型和酪氨酸激酶抑制剂筛选模型进行活性跟 踪，得到两个活性组分l 和2 。经过显色反应和紫外扫描定性实验，又经过薄层色谱及高 效液相色谱进行纯度测定，确定活性组分具有较高纯度，可能为醌类物质。 本实验首次发现等鞭金藻h 2 9 含有抗肿瘤活性物质，对该物质的深入研究和开发，极 有可能发现新型的抗肿瘤先导化合物。 关键词：微藻；抗肿瘤；筛选：培养；分离纯化 第一章前言 第一章前言 1 1引言 癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。2 0 世纪后期近3 0 年癌症发病一直呈上升的趋势，据世界卫生组织w h o 报告，1 9 9 0 年全球癌症 新发病例数约8 0 7 万，比1 9 7 5 年的5 1 7 力增加了3 7 4 ：1 9 9 7 年报告显示，1 9 9 6 年全球5 8 亿 人口中因癌症死亡约有6 3 0 万人，约占总死亡人数的1 2 ，按照该趋势预测，至2 0 2 0 年随 着世界人口达8 0 亿，将有2 ，0 0 0 h 新发癌症病例，其中死亡人数将达l ，2 0 0 力，且其中绝大 部分将发生在发展中国家。 流行病学研究提示，我国不仅肿瘤死亡率呈明显上升趋势，而且兼有发展中国家和发 达国家高发谱并存的特点。根据我国1 9 7 3 1 9 7 5 年及1 9 9 0 一1 9 9 2 年两次全国范围内的死因 调查，在这近2 0 年的时间内，恶性肿瘤在死因的构成比也自1 2 6 升至1 7 9 。世界卫生 组织调查表明癌症患者正在逐年增加，近年来我国每年新增肿瘤患者1 6 0 1 7 0 力| 人，总数估 计在4 5 0 万人左右，已成为仅次于心血管病的第二大杀手。目前，我国恶性肿瘤的死亡率 仍以每年1 8 递增，发病率则以每年2 5 的速度增加【”。 面对如此快速的发展趋势，寻找新型抗肿瘤药物来源，研发高效无毒的新型抗肿瘤药 物已成为各国专家瞩目的焦点。抗肿瘤药物是重要的医药大类品种，其销售份额约占世界 医药市场的1 5 ，如紫杉醇是1 9 9 2 年美国百时美施贵宝公司丌发的全新植物抗肿瘤药，在 上市短短几年内全球销售额 1 0 亿美元，是目前临床上广泛使用的首选抗肿瘤药物之一。 但是陆地资源正在枯竭，科学家预言，最有前途的抗肿瘤药物将来自海洋。 占地球表面积7 l 的广阔水域一一海洋中蕴涵着丰富的生物资源，其生物量巨大，种 类繁多，是人类食品、医药保健品和同用品来源的天然宝库。随着当代人口激增、耕地锐 减、陆地资源日渐减少乃至枯竭、环境污染f 1 益严重，在2 l 世纪，向海洋要食物、要材料、 要药品将是人类生存和发展的主要出路。海洋生物中含有丰富的天然活性物质，由于海洋 生物的多样性以及所处环境的特殊性，海洋生物中所含的天然活性成分的化学结构独特， 并且具有不同的生物活性和作用机制，是新药开发的重要来源。目前，许多国家对海洋天 然生物活性物质的开发和利用研究非常重视。 抗肿瘤海洋药物研究在海洋药物研究中一直起着主导作用，现己发现海洋生物提取物 中至少有1 0 具有抗肿瘤活性，从海洋植物获得的化合物中3 5 具有抗癌或细胞毒活性1 2 】。 第一章前言 1 2藻类活性产物研究进展 藻类包括微藻类和大型藻类，是水体中主要的初级生产者，是海洋天然活性物质的重 要来源之一，水体中藻类资源非常丰富，包括蓝藻、金藻、红藻、硅藻、甲藻、褐藻、隐 藻、裸藻、黄藻和绿藻十大门类。人类自古以来就有关于藻类药用的记载1 3 哪，过去的研究 表明，藻类中含有多糖类、酯类、肽类、萜类、酚类、生物碱、有机酸等多种生物活性物 质，其中许多物质具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、治疗心血管疾病以及增强人体免疫 功能等作用，因此，对藻类的药用功效及其活性成分的研究长期以来受到国内外学者的重 视 6 - 1 2 1 。总结前人的研究成果，藻类天然活性产物主要表现在如下几个方面： 1 2 1抗肿瘤活性物质 在天然药物研究中抗肿瘤活性一直是最为重要的研究领域，从藻类中发现这类活性物 质占有重要的地位，因为藻类多变的生活环境和原始的进化地位使其拥有许多结构新颖的 活性物质。国外对其研究始于上个世纪5 0 年代发现巨大鞘丝藻的脂溶性提取物具有抗白血 病活性，从而激起了对藻类抗肿瘤活性研究的兴趣。从黑海中发现许多有抗胂瘤潜力的藻 种，有钝形凹顶藻( l a u r e n c i a o b t u s a ) 、网地藻( d & t y o t a d i c h o t o m a ) 、囊叶藻( c y s t o s e i r a c r i n i t a c y s t o s e i r a b a r b a t a ) 、石莼( u l v a r i g i d a ) 、缘管浒苔( e n t e r o m o r p h a l i n z a ) 、刚毛藻 ( c l a d p h o r as p ) 、前沟藻口m p h i d i n i u m ) 、小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 、鳍藻( d i n o p h i s i s ) 、 裸甲藻( g y m n o d i n i u m ，g y r o d i n i u m ) 、原甲藻( p r o r o c e n t r u m ) 、颤藻( o s c i l l a t o r i a ) 、螺旋藻 ( 勋f ，“砌口) 等i ”】。g u v e n 等列出了1 4 种绿藻、2 3 种褐藻、2 3 种蓝藻和7 种红藻具有抗肿瘤活 性1 1 4 l 。8 0 年代初美日科学家开始系统的筛选蓝藻及其他藻类的抗肿瘤活性，发现了许多新 的活性化合物，如从蓝藻中提取的s c y t o p h y c i nb 已进入i 临床阶段；从松香藻中分离的 h a l o m o n 前也已进入临床前药理评估阶段；其他从藻类中分离出来抗肿瘤物质如 c r y p t o p h y c i n 等已完全清楚了其作用机理及药理药效；m a l y n g a m i d e 等已清楚了结构，完成 了毒理实验，正在进行深入的研究i 。 进入2 1 世纪，各国学者仍然专注予对藻类抗肿瘤活性物质的研究。徐秀丽等人的实验 结果表明：红藻门的细枝软骨藻( c h o n d r i at e n u i s s i m a ) 、松节藻( r h o d o m e l ac o n f e r v o i d e s ) 、 鸭毛藻( s y m p h y o c l a d i a l a t i u s c u l a ) ，褐藻门的小粘膜藻( l e a t h e s i a n a n a ) 、点叶藻( p u n c t a r i a t a a f o t 胁) 的甲醇提取物具有较好的对k b 细胞的选择性细胞毒活性；红藻门的松节藻 ( r h o d o m e l ac o n f e r v o i d e s ) 、鸭毛藻( s y m p h y o c l a d i al a t i u s c u l a ) ，褐藻门的小粘膜藻( l e a t h e s i a n o n a ) 、点叶藻( p u n c t a r i al a t i f o l i a ) 的甲醇提取物都具有较好的对h t 2 9 细胞的选择性细胞毒 活性i t 6 l 。g e f e iz h o u 等在以小鼠为肿瘤移植体的实验中，从红藻中分离出来的硫化半乳糖体 第一章前言 一b 角叉胶( 又称卡拉胶) 的低分子量活性成分提取物，在与化疗药物5 f u ( 5 氟尿嘧啶) 混合作用时，既能增强5 f u 的抗肿瘤活性，又能使5 f u 破坏的免疫调制功能得到修复【l 刀。 目前对微藻抗肿瘤活性成分研究还不是很多，微藻种抗肿瘤活性成分如表1 1 【6 1 所示： 表1 1微藻中的抗肿瘤活性成分 1 2 2 抗菌活性物质 抗生素是一种由微生物自然产生的，而对其它微藻，细菌、真菌、病毒或原生动物有 毒性作用的抗微生物化合物。目i j ，广泛应用于临床的各种抗生素，大部分来自于放线菌 ( 如链霉素、红霉素、金霉素等) 和真菌( 如青霉素、荻黄霉素等) 。然而，随着细菌耐药性的 增加，有些疾病单靠原来研究开发出来的抗生素已难以治愈，因而有必要广泛地从其它生 物中寻找新的抗菌物质。 六十年代以来，我国从大量海藻中筛选出了许多抗细菌和抗真菌的种类。一些有效成 分也逐渐被确定 1 8 - 2 1 】。然而，大多数的研究都集中在大型海藻中，对微藻的抗菌活性的研 究却进行得较少。从2 0 世纪6 0 年代起，有关微藻抗菌活性的研究，国内外学者都进行了一 定的研究。1 9 6 6 年a u b c r t 和g a u t h i e r 发现秘鲁角刺藻( c h a e t o c e r o sp e r a v i a n u s ) 、长菱形藻 ( n i t z s c h i a f r a u e n f e l d i t ) 等的提取物能抑制藤黄八叠球菌、奈氏球菌的生长；1 9 8 8 年英国的 r i c h a r d 等2 2 挪1 对4 0 0 种淡水微藻进行了大规模的筛选，发现其中有4 0 种具有抗菌活性； 3 第一章前言 s t e p h e n 等 2 4 】在1 9 8 9 年对1 3 2 种海洋微藻进行了筛选，发现有2 7 种微藻具有抗菌活性：8 0 年 代的这几位学者发现具有抗菌活性的化合物都是脂溶性化合物，而少数为水溶性化合物； 1 9 8 8 年同本的村上昌弘等2 5 1 对2 0 多种微藻进行了抗菌活性筛选，发现有1 0 种脂溶性组分都 或多或少的有抗菌活性，而水溶性组分均无活性。 近年来，对藻类抗菌活性物质的研究也有了长足的进步。江红霞等的实验结果表明： 在8 种微藻中，有2 种微藻( 铜绿聚球藻和塔胞藻) 的抗菌谱最广，分别对4 种菌的生长有抑制 作用。铜绿聚球藻的甲醇和甲苯( 3 ：1 ) j 是取物对枯草芽孢杆菌的抗性最强。在所有的菌中， 黑曲霉对微藻提取物最敏感。不同的微藻对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有不同的抑制作 用，而微藻对细菌的抑制作用大于对真菌的抑制作用 2 6 l 。 1 2 3 抗病毒活性物质 在六七十年代，藻类抗病毒物质就引起人们的广泛关注，并对一些藻类的抗病毒作用 进行了研究。g e r b e r 等人首先报道了一种从石花菜( g e l i 西u mc a r t i l a g i n i u m ) d p 提取的多糖类 和从c h o n d r u sc r i p s p u e p 提取的角叉菜聚糖具有抗流感病毒b 和流行性腮腺炎病毒的作用： t a k e m o t o 等人发现琼脂可阻抑疙疹病毒的增殖；s t a r 等人发现一种刚毛藻( c l a d o p h o v as p ) 、 网地藻属的( d i c t y o t aa c u t i l o b a ) 、巨大鞘丝藻( l y n g b y am a j u s c u l a ) 、穗状鱼栖苔 “c a n t h o p h o r a s p i c i f e r a ) 的提取物对流行性腮腺炎病毒( m p ) 有抑制活性；b e r t 等人发现刚毛 藻属的( c p r o l i f e r a ) , 囊链藻属的( c y s t o s e r i a ab r o t a n t f o l a ) ，墨角藻属的( f u c u s v i r s o i d e ) 对流感 病毒a 有抑制活性；d e i g e r e s m a n 等人发现隐丝藻目( c r y p t o n e m i a l e s ) 和仙菜目( g e r a m i d e s ) 一些种类的提取液对单纯疤疹病毒h s v 1 及h s v 2 有抑制活性 2 7 , 2 8 1 。 近年来，由于新病毒的不断出现，人们更加重视寻找新的抗病毒药物来源f 2 9 那i 。蓝藻 是是地球上最早出现的光合自养生物，在长期的演化过程种形成了广泛的适应性。蓝藻中 抗病毒活性物质有多糖类、糖脂合硫化糖脂及蓝藻多肽等，其中硫化糖脂含有很高抗h i v 活性，有些活性成分能有效抑$ 1 j h i v 1 和h i v 2 逆转录酶活性。由于蓝藻分布广，种类繁多， 存在多种结构新颖、功能独特的活性物质，有从中发现更有效的抗病毒活性物质的巨大潜 力f 3 1 - 3 2 1 。 1 2 4 免疫学效应 有些具有活性的藻类物质是通过免疫淋巴细胞起作用的，尤其是一些藻类多糖，如鹿 角菜的藻多糖，另外有报导羊栖菜( 勋r g 跚“m 加i f o 册p ) 中提取的多糖( p f p s ) 具有n a + 、k 一 一a t p a s e 作用，从而抑制肿瘤沿血路转移，这将有益于细胞免疫【”1 。1 9 9 5 年杨小林等的研 究发现，褐藻糖胶在体外可诱导白细胞介素i ( i l 1 ) 和丙型干扰素( i f n t ) 产生；体内给药可 增强t 细胞、b 细胞、巨噬细胞( m 4 ) 和自然杀伤细胞州k ) 的功能，促进绵羊红细胞( s r b c ) 4 第一章前言 的初次免疫应答1 。张尔贤等从马尾藻提取的多糖具有清除超氧阴离子自由基作用【3 ”。螺 旋藻多糖除具有提高机体免疫力和抗癌活性外，还具有抗衰老、抗疲劳、抗辐射损伤作用， 是癌症病人放、化疗过程中理想的辅助药物【蚓。 凝聚素是一类能凝聚细胞或糖结合物的蛋白质，动物凝聚素与细胞内吞作用、细胞迁 移、凝聚和吞噬等有关；植物凝聚素具有保护植物免受病原菌侵害的功能。研究表明，许 多藻类中含有凝聚素类似物，如h o r i 等人对微型藻类进行了调查，发现在微藻特别是蓝藻 中存在凝聚素，并对一些进行了初步鉴定，盐见一雄等从大型海藻江篱中分离了细胞凝聚 素g v a 1 ，并研究了理化性质l 翊。 还有些藻类活性物质具有抗凝血作用，如从掌状海带( l a m i n r i a d i g i t a t a ) d p 分离的多聚 葡糖菅，其硫酸酯的抗凝血效力相当于肝素的三分之一。褐藻酸具有止血作用，用褐藻酸 钙制成的止血纱布、止血绷带及止血海绵已用于临床。 1 2 5 抗虫作用 海人草( 鹧鸪菜) 自古以来就在中国被用作驱蛔虫药，并传到f 1 本：红藻凹l s i d i u m h e l m i n t h o c o r t o n ) 在欧洲作为民问药方用于烧虫和蛔虫的驱除。然而，关于海藻中抗虫物质 的研究直到上个世纪5 0 年代- a 开始。m u r a k a m i 等首先从海人草( d i g e n e a s i m p l e x ) 中分离提 取到抗虫物质，并确定了结构，这是一种脯氨酸衍生物，称为l 一海人草酸( l a k a i n i ca c i d ) 。 t a k e m o t o 和d i a g 又从树枝软骨藻( c h o n d r i aa r m a t a d o m 0 0 和栅状软骨藻( c b a i l e y a n a ) 两种红 藻中分离到结构与海人草酸类似的抗虫药物，称为软骨藻酸( d o m o i ca c i d ，简称d a ) ，其驱虫 效果是海人草酸的3 倍。8 0 年代后，有入相继从尖刺拟菱形藻多列交种( p s e u d o n i t z s c h i a p u n g e n sm u l t i s e r i e s ) 、伪优美拟菱形藻( p p s e u d o d e l i c a t i s s i m a ) 、澳洲拟菱形藻( p a u d t r a l i s ) 、 成列拟菱形藻( 尸s e r i a t a ) 以及人工培养的咖啡形双眉藻叫m p h o r a co f f a e i f o r 脚豇) 中发现d a ， 这些硅藻大量繁殖时形成赤潮因此d a 也是赤潮毒素之一。现在对软骨藻酸驱虫的毒理机 制有了一定的了解，研究表明，d a 是一种神经毒素、递质，当它进入中枢神经系统后，会 发生胞溶现象，还可降低蛔虫、鞭虫、绦虫类的脱氢酶活性，减弱呼吸，使之麻痹。现已 发现具有抗虫作用的藻类还有珊瑚藻、刺松藻、石花菜、鼠尾藻、凝菜、娱蛤藻、铁钉菜、 长松藻等，目j j i ，已利用这些抗虫活性物质制成生物渔药【弛i 。 1 2 6 其他作用 医学研究表明，许多疾病是由于体内酶水平过高或某种代谢失调所致，因此酶抑制剂 具有临床应用价值，例如糖苷酶的抑制剂可以用于治疗糖尿病和肥胖症等碳水化合物失调 症，蛋白酶抑制剂在治疗皮肤过敏、各种炎症、肿瘤等方面具有临床应用价值。c a n n e l l 等 检测了5 0 0 株淡水和海水微藻细胞培养液和提取物对a 一葡糖酶、淀粉酶、b 一半乳糖苷酶、 5 第一章前言 羧肽酶、糜蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶酶、亮氮酸氨肽酶、木瓜酶和胰蛋白酶的抑制效应， 他们的研究结果显示，微藻有可能成为新的酶抑制剂的来源。h o n k a n e n 等研究1 ，6 0 0 多个蓝 藻提取物对蛋白磷酸酶的抑制作用，g e r w i c k 等从蓝藻、隐藻、金藻等微藻中筛选对肿瘤发 育有关的蛋白激酶c ( p k c ) 、蛋白酪氨酸激酶( p t k ) 和肌苷单磷酸脱氢酶( i m p d h ) 的抑制活 性，结果显示，在5 0 1 个提取物中对i m p d h 、p k c 、p t k 有作用的提取物种数分别是2 3 ，9 和9 。除微藻外，有人在泡叶藻、齿缘墨角藻等中检测到能切割质粒d n a ，抑制淀粉酶、 脂酶、胰蛋白酶活性的物质，经分离鉴定为褐藻多酚类物质 2 3 1 。 藻类含有大量的不饱和脂肪酸，如e p a 、d h a 等，这些不饱和脂肪酸具有多种生物学 效应，其q 6 p u f a ( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ) 是人及动物生长发育所必需的脂肪酸【3 9 柏l ，吴 庆等入利用尿素包合法从藻种( n a n n o c h l o r o p s i ss p 冲得到了四种不饱和脂肪酸，含量高达 总脂肪的8 9 。藻类渐渐成为获得p u f a s 的原料，为人及动物生长发育提供了营养品。 己有实验证明，藻类中含有与高等植物相类似的植物激素，另外还发现其它一些对藻 类生长、发育起作用的物质。藻类中的生长调节物质有：a 、植物生长素类：如苯酚乙酸、 a 吲哚一3 乙酸、吲哚3 一丙酮酸、吲哚乙腈、吲哚乙酸乙酯、吲哚乙酸胺等结构的化学物 质：b 、细胞激动素类：在涡鞭毛藻、三角褐指藻、掌状海带、墨角藻等的藻体细胞或培 养液中存在类激动素的物质：c 、脱落酸类：d 、赤霉素类：在墨角藻( f v e s i c u l o s u s , f s p i r a l i s ) ， 昆布( e c k l o n i a ) 、浒苔( e n t e r o m o p h o r at e t r a s e l m i s ) ，红藻的钩沙菜( h y p r e am u s e r m i s ) 、巨藻 ( m a c r o c y s t i s p y r i f e r a ) 、多边膝沟藻( g o n y a u l a x p o l y e d r a ) 等藻中检测到赤霉素活性；e 、乙 烯类l ”】。 藻类还含有多种毒素，关于其毒素的报道也是屡见不鲜，特别是在微藻类甲藻、蓝藻 类的许多种类能够产生各种毒素，这些毒素通过食物链在鱼类、贝类等中富集，引起鱼类、 贝类中毒死亡。某些藻类大量繁殖时常常形成赤潮，因此这些藻类产生的毒素又称赤潮毒 素。现在藻类毒素已引起国内外学者的广泛关注，并对一些藻类毒素进行了分离鉴定和毒 理的研究。藻类毒素主要有麻痹性贝毒( p s p ) ，神经性贝毒洲s p ) ，腹泻性贝毒( d s p ) ，健忘 性贝毒( a s p ) 等几类，大多数分离鉴定的藻类毒素为小分子化合物，如涡鞭毛藻类产生的 石房蛤毒素及其衍生物，裸甲藻毒素，尖刺菱形藻产生的软骨藻酸，鞘丝藻毒素等，少数 为小分子的肤类，如铜锈微囊藻素。藻类毒素不仅在水域的生态环境中起重要作用，而且 具有潜在的药用丌发价值f 4 2 】。 6 第一章前言 1 3微藻的应用 微藻，如螺旋藻( s p i r u l i n as p ) ，其营养价值早被人类认识到，墨西哥的印第安人，阿 兹台克人和非洲乍得湖附近的居民食用此种藻类历史十分悠久，及至上个世纪5 0 年代，微 藻才被作为蛋白质、液体燃料和精细化工品的潜在资源而备受人类关注。迄今为止全球已 知藻类约3 e 余种，其中有2 万余种属于微藻。微藻具有很多优点，相对于其它生物来说， 具有明显的竞争优势，主要表现如下： ( 1 ) 微藻品种繁多。包括了从原核到真核数量巨大的一系列品种，而且新品种正在不 断的被发现，应用具有广泛的丌发潜力。 ( 2 ) 广泛适应性。微藻的生长模式包括自养型和异养型，生长范围包括淡水、海水和 超高盐度等险恶环境，因此，微藻可以适应不同的培养方式和培养环境，应用范围相当广 泛。 ( 3 ) 水生性。微藻主要生活在水中，而水面在地球上占大部分，因此在地球可耕种土地 闩益减少的情况下，微藻的应用开发具有特别重要的意义。利用广阔的海洋来解决未来的 粮食问题j 下是人们寄予海洋微藻的厚望。 ( 4 ) 光合特性。微藻一般都通过光合作用获取能源，这在能源丌发和环境保护上具有重 要意义。 ( 5 ) 广泛应用性。微藻细胞具有丰富的营养，可作食品、饵料和饲料；微藻可以生产 许多生化产品：微藻在污水处理、能源和生命的再循环系统等方面也大有作为。 ( 6 ) 生产的可控制性。微藻和其它大型植物相比，其生产具有可控制性、稳定性和持续 性。这对实现微藻生产的规模化和集约化意义重大。 微藻具有巨大的应用和开发潜力，目前的应用主要表现在以下几个方面： 1 3 1 药用保健 国内外的研究表明，海洋微藻及其微藻产品有增加人体免疫力、抗肿瘤和心血管系统 的保健作用- 4 6 1 ，对疾病有预防和治疗功能。当的，海洋微藻及微藻产品在医药工业中的 应用正逐步受到人们的重视，丌发利用前景广阔。已生产的部分药物及保健品如表1 2 所示： 第一章前言 表1 - 2 部分药物及保健品 1 3 2 食品工业 微藻含有丰富的蛋白质，这是最初引起研究人员和企业家浓厚兴趣的主要原因，其中 以1 9 8 0 年被联合国粮农组织誉为“2 l 世纪人类蛋白质的来源”的螺旋藻的研究最多。但除 此之外，微藻还含有丰富的维生素、矿物质、不饱和脂肪酸及生理活性物质，因此，微藻 食品既能保证人体营养要求，又能保持身体健康f 4 7 1 。 概括起来，微藻在食品工业中的应用如表1 - 3 t 4 8 1 所示。 表1 3 微藻在食品工业中的应用 第一章前言 1 3 3 水产养殖 ( 1 ) 作为水质改良剂 可利用微藻光合作用放出的大量氧气和吸收水中的富营养化成分来净化污水和保持 良好的水环境条件。因为微藻能有效地进行光合作用，将光能、h 2 0 、c 0 2 和无机盐如n h 4 + 一n 转化为体内有机化合物，产生氧气，提高溶氧水平，并使水体p h 值升高，从而促进细 菌的矿化作用，在细菌的作用下使h 2 s 变成无毒的硫酸盐。d u m a s 报道鲍氏席藻( p h o r m i d i u m b o h n e r 0 对养殖废水中氮去除率可达到8 0 4 9 1 。t h o m p s o n 在自动生成的生物膜中检测到硅 藻属和鞭毛藻( f l a g e l l a t e ) ，不仅可以去除氨氮，又可促迸虾生长：试验组虾体增重率为1 0 3 ，而对照组只有3 3 1 5 0 1 。因此微藻一定量的存在，对改善和稳定水体生态系统起重要 作用。 ( 2 ) 作为水产动物的饵料 微藻由于其营养价值，已被广泛用作水产动物的饵料。随着水产养殖业的发展，微藻 作为水产动物饵料的需求量越来越大。国外已开发出4 0 余种微藻应用于鱼、虾、贝类的育 苗生产中，如e m m a n u c l l e 等人将微藻制成微囊状物质喂养牡蛎【5 1 1 ，比等鞭金藻( i s o c h r y s i s g a l b a n a ) 生长快，细胞密度高，两且富含蛋白质，适寅北方3 、4 月份培养，可作为中国对 虾幼体和海湾扇贝幼虫的优良饵料，效果良好，在微藻培育系统中找不到弧菌，如同时以 微藻为饵科可有效控制弧菌的数量f 捌。小球藻干粉或提取物添加到鱼类的食物中，可改善 鱼的肉质，例如在饵料中添加小球藻干粉或提取物对黄尾鱼进行的实验，可增强鱼对疾病 的抵抗力，改善鱼肉的质量【5 3 1 。 ( 3 ) 增强养殖动物抗病能力 通过微藻生态调控，改善养殖环境来提高养殖对象的抗病力，是对水产生态调控防病 的重要组成部分。微藻所含有或产生的生物活性物质如抗生素，包岔抗细菌或真菌的物质， 可以杀死水中的致病菌。黄翔鹄等人工引入波吉卵囊藻( o o c y s t i s b o r g e is h o w ) 和微绿球藻 o v a n n o c h l o r 括o c u l a t a ) 于凡纳对虾( e e n a e u s m n m ) 养殖环境中，结果表明，引入波吉卵囊藻 和微绿球藻能改善养殖水体的水质，凡纳对虾的血细胞数目，血清蛋白的含量以及酚氧化 酶、超氧化物歧化酶，溶菌酶，抗菌酶的活性都较对照组显著提高唧1 。 l ，3 4 能源开发 能源是人类生存与发展的物质基础，人类所用的能源主要是石油、天然气和煤炭等化 石燃料。化石燃料是远古时期动植物遗体沉积在地层中经过亿万年的演变而来的，是不可 再生能源，其储量有限。此外，化石燃料的燃烧产物c 0 2 会造成温室效应，燃烧副产物氮 氧化物、硫氧化物等既可导致空气污染又可能形成酸雨，危害甚大。因此，寻找可再生 9 第一章前言 能源成为各国政府能源战略的主导政策。地球的能源均来源于太阳，每年入射到地球表面 的太阳能约为5 7 1 0 2 4j ，约为人类所用能源的1 0 ，o o o 倍t 5 5 】，因此可以说太阳能“取之不 尽，用之不竭”。利用光合细菌或微藻直接转化太阳能为氢能，特别是微藻制氢的底物是 水，来源丰富，是目前国际上生物制氢领域的研究热点我国一些科学家己取得了一定成果 1 5 6 , 5 7 1 。 另外，可以通过微藻热解获得生物质燃油，也是一种重要的可再生能源。热解是一种 热化学转化技术，是指生物质在隔绝氧化介质条件下受热分解产生焦炭、燃油和燃气的过 程，是获得生物质能的一种重要手段。微藻光合作用效率较树木高，具有生长周期短、生 物产量高的特点，而且由于微藻含有较高的脂类、可溶性多糖和蛋白质等易热解的化学成 分，因此所需热解条件相对树木等较低，降低了生产成本，且获得的生物质燃油热值高， 平均高达3 3m j & g ，是木材的1 6 倍【5 8 j 。 通过农业化学技术可从一些富含脂肪酸的微藻中提取油脂，用于制备食用油和生物柴 油。直接从微藻中提取的油脂成分与植物油相似，不仅可替代石油作为生物柴油直接用于 工业上，还可作为植物油的替代品，具有广泛的应用价值。 藻类还可用于污水处理。为了确定污染物的毒性，v a l s a m m a 等用小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 、卵球藻( o o c y s t i s p u s i l l a ) 和颤藻( o s c i l l a t o r i aq u a d r i p u n c t u l a t a ) 对油污染的废水 塘进行了为期一年的研究，以藻的生物量及叶绿体的含量为指标，认为藻能作为检测工业 废水稳定程度的有效工具1 5 9 1 。在d e l i a 的研究中，从冶金与纺织工业工厂的废水中取样，在 8 个月期间，进行了化学、生化与各种生物毒性参数的分析，将敏感生物检测与化学检测 相互补充，比较，认为藻是最具潜力的检测生物之一，可用来控制工业废水的排放指标【硎。 由于一种单独的生物检测种类难以全面，综合地反映污染情况，期望建立生物检测组分方 法得到可靠的结果，r e p e t t o a 等建立生物检测组包括水蚤( d m a g n a ) ，海洋弧菌( p 卵5 c h e r o ， 小球藻( c v u l g a r i s ) ，洋葱似c e p a ) 与从猴肾及鲑鱼性腺中获得细胞进行体外实验，对五氯苯 酚进行生态毒性的评价，研究表明可以全面地反应化合物对生物及生态的影响1 6 ”。 1 3 5 基因工程应用 随着科技的发展，微藻也逐渐在基因工程领域有了一定的应用。转基因微藻在生物工 程上具有广阔的应用前景，可用来生产如：重组疫苗、哺乳动物的抗体及有附加值的化合 物( 类胡萝卜素、不饱和脂肪酸、氢气或生物燃料等) 。 目前，利用转基因微藻进行生产的有：c y a l l o t e c h 公司用转基因微藻来生产食品添加剂 ( 类胡萝h 素、食用色素) ；s u b i t e c 公司用转基因微藻柬生产多聚不饱和脂肪酸：p h a r m a m a r 1 0 第一章前言 公司用转基因微藻来生产具有生物活性的化合物( 如抗肿瘤药物、疫苗) 【6 2 1 。 d u n a h a y 和其同事通过基因工程用微藻来生产类脂，并报道了通过转基因硅藻生产生 物柴油【6 3 j 。美国国家可更新实验室( n r e ) 通过现代生物技术生产出“工程微藻”，即硅藻 类的一种“工程小环藻”。在实验室条件下可使该藻脂质含量增加到6 0 以上，户外生产 也可增加到4 0 以上，而一般自然状态下微藻的脂质含量仅为5 一2 0 ，该技术主要实 现是由于乙酰辅酶a 羧化酶( a c c ) 基因在微藻细胞中的高效表达，在控制脂质积累水平方面 起到了重要作用。 s a y r e 和其同事报道了通过表达外源会属硫蛋白来增加与重会属的结合能力，用于在衣 藻中积累脯氨酸m j 。m e l i s 和其同事通过修饰衣藻基因来研究生物制品一氢。衣藻中插入反 义c r c p s u l p 序列修饰基因来调节叶绿体硫酸盐透性酶，叶绿体在缺失硫酸盐透性酶或者限 制硫酸盐透性酶的量时，产生的氧气少于j 下常光合作用时产生的氧气，藻类在无氧的环境 下进行光照，通过可选择的细胞途径进行光合作用来生产氢气【6 5 1 。 目前国际上的微藻应用已进入商业化生产阶段。东亚和东欧地区以及我国台湾省等以 生产栅藻和小球藻为主，年产量藻粉1 0 0 0 吨以上；墨西哥、乍得等国家相继建立起螺旋藻 生产线，年产量达数百吨。1 9 6 8 年，国际上成立了微型藻类国际联盟( m i u ) ，开展有关学 术科研活动。我国的微藻应用也有了长足的发展，从1 9 5 8 年丌始培养作为食品和饲料的微 型藻类，在国际上首先完成了钝顶螺旋藻( s p f r u h n a p l a t e n s i s ) 的海水驯化和养殖，选育出了 作为高蛋白藻种的土生席藻( p h o r m i n mm u c i c o l n ) 1 酌1 等等。 1 4 微藻抗肿瘤活性物质研究 微藻多变的生活环境和原始的进化地位使其拥有许多结构新颖的活性物质，多年来对 微藻的研究获得了大量的新型生物活性物质，其中抗肿瘤活性物质也多种多样，主要包括 了以下几种： 1 4 1 多糖类 近年来有关海藻多糖抗肿瘤方面的作用越来越受到人们的关注。海藻多糖是一类海藻 提取物，属于植物多糖中的一种，是由多个相同或不相同的单糖基通过糖苷键相连形成的 高分子碳水化合物，具有多种生物活性，主要包括海藻多糖，甲壳多糖，硫酸软骨素，海 参糖多糖，刺参粘多糖等。大量药理及临床研究表明，海藻多糖能激活免疫受体，提高机 体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优 点【6 饥。例如海带多糖( b s p ) 、螺旋藻多糖( p s p ) 等具有抗肿瘤作用，并且已投入临床应用1 6 8 】。 第一章前言 f p s 是褐藻中的一种水溶性杂聚多糖，属褐藻多糖硫酸酯( f u c o i d a n ) ，是褐藻特有的一种化 学组分。具有抗肿瘤作用，此外还具有抗凝血，降血脂、防血栓、改善微循环、解毒、抑 制白细胞和抗h i v 等作用l 。用红藻多糖对牛免疫缺陷病毒的生长进行研究，发现其具有 明显的抑制作用，其抑制率分别为8 5 9 6 和8 8 6 5 ，与临床批准使用的抗a i d s 药物叠 氮脱氧胸腺嘧啶( 8 9 5 2 ) 近似，证实了其作为抗a i d s 药物的可行性【7 0 i 。国外亦有学者报 道，m i s h i m a 等研究发现绿藻多糖的c a 螫合物能抑制黑色素瘤b 1 6 b l 6 的侵袭与转移【7 ”。 1 4 2 多肽类 海洋抗肿瘤肽多为小分子肽，含有丰富的d 氨基酸、羟基酸、新型c t 氨基酸以及噻吩 和恶唑环，有的还含有烯键和炔键。这些活性肽的抗肿瘤活性很高，稳定性很好。 c r y p t o p h y c i n s 是从念珠藻( n o s - t o cs p s t r a i ng s v 2 2 4 ) 中提取的多肽，对小鼠异种移植的乳 癌、卵巢癌、克隆癌、胰腺癌具有强的活性，其作用机理是通过引起微丝的解聚作用而阻 碍细胞周期的g 2 m 期。从念珠藻( n o s t o cs p ) 体内分离得到7 个c r y p t o p h y c i n s ，其中 c r y p t o p h c y c i nl 具有主要的细胞毒活性，它拥有一氯l 一0 一甲基酪氨酸单元，c r y p t o p h y c i n 2 7 有较弱的活性。体内研究表明天然的c r y p t o p h y c i n s l 和半合成的c r y p t o p h y c i n s8 对许多 移植瘤包括多药物抗性( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ，m d r ) 细胞系具有活性，并且有较好的水溶 性和治疗效果，而m d r 是影响肿瘤化疗效果的一个非常重要的因素，它预示c r y p t o p h y c i n s 很有可能成为临床药物【7 2 1 。n s c6 3 0 1 6 7 是一种从蓝藻( c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m ) 分离 到的环肽化合物，能降低致癌基因c m y cm r n a 的表达水平，能够使一些肿瘤细胞的细 胞周期停留在g o g 2 期，是一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂。n s c6 3 0 1 6 7 对不同的人实体瘤细 胞都表现出良好的细胞毒活性【7 3 1 。 i 4 3 大环内酯类 海洋生物体内的大环内酯化合物，具有特殊结构和强烈的生理活性，因而引起人们广 泛注意。例如：m i c h i on a m i k o s h i 等从绿藻( c y o m b a c t e r i u m ) 中分离得到3 种全新的绿藻代 谢物，这类化合物具有特殊取代结构，细胞毒性都较强。m o o r e 等人从小头颤藻( o a c u l i s s i m a ) 中分离出一种大环内酯化合物a c u t i p h y c i n ，具有细胞毒和抗肿瘤活性，体外试验当剂量大 于5 0 “g k g 时显示抗肿瘤作用【7 4 1 。k o b a y a s h i 等从培养的| j 沟藻中分离出4 种具有抗肿瘤 活性的大环内酯：a m p h i d i n o l i d e - - a ，b ，c ，d ，它们对l 一2 1 1 0 细胞的i c 5 0 分别为2 4 x1 0 、1 4 xl o 一、5 8 x1 0 、1 9 1 0 3l g m l 。在蓝藻中也发现该大环内酯类似物。 1 4 4 多不饱和脂肪酸类 多不饱和脂肪酸又称高度不饱和脂肪酸( h u f a ) ，主要来源于海洋生物，如3 系的廿 碳五烯酸( e i c o s a p e n t e n o i c a e i d e p a ) 、廿二碳六烯酸( d o c o s a h e x e n o i c a c i d ，d h a ) ，其特有的生 1 2 第一章前言 物活性远大于u - 6 型的脂肪酸，如d h a 主要有抗衰老、提高大脑记忆，舫止大脑衰退， 降血脂、降血压、抗栓、降血粘度、预防动脉粥样硬化，并有抗癌作用。以鱼类，藻类为 原料的鱼油制剂种类很多，一些鱼油中还有少量十八碳三烯酸( o c t a d ec a t r i e n o i c a c i d ；又 名亚麻酸l i n o l e n i c a c i d ) 为合成前列腺素的的体，并可在体内转换成d h a ，又称维生素f ， 可用生物发酵法大量生产以供药用。 1 4 5 萜类 萜类化合物是广泛分布于海洋生物中的一大类有机化合物。由于其碳架结构多种多 样，长期以来化学家们都对它产生浓厚的兴趣。其结构特点是分子中含倍半萜以上的萜为 主，同时不少萜类化合物含有卤素。这些化合物的某些特性类似于不饱和脂肪酸，其化合 物中含有一个到多个异戊二烯分子，这类化合物大都有毒性，各国科学家正在研究其利用 价值，其中最有应用价值的是6 胡萝h 素。 从绿藻中陆续分离到的几十个倍半萜和二萜中，大多数含有1 ，4 二乙酰氧基丁二烯 结构片段。这种共轭的双烯醇乙酸酯代表着“隐蔽”的二醛，故有很强的生物活性。 从钝形凹顶藻( l o b t u s a ) 分离的三萜类化合物t h y r s i f e r o l 对p 3 8 8 细胞的e d 5 0 为o 1 8 “g m l 。t a k e d a 等从该藻中分离到具有细胞毒活性的双萜类l a m o u r o u x 和卤化烯二醇，其 中l a m o u r o u x 对体外培养的b 1 6 细胞的i c 5 0 为o 7 8l a g m l ，而卤化烯二醇对体外培养的 k b 和p - 3 8 8 细胞的分别为4 5i , t g m l 和1 0i t g m l 。p e c 等从( l a u r e n c i av i r i d i ss p n o v ) 分离到 一种新的萜类( d h t ) ，对t 4 7 d ，z r - 7 5 一l 和h s 5 7 8 t 等癌细胞均有毒性；用p g p 过表达的 人表皮样癌细胞系证明，该化合物不调节由p g p 介导的药物转运， 表明该化合物可用于 治疗p g p 表达的癌细胞而不受干扰【7 5 l 。 1 5研究目的 随着提取分离、分析测试技术的进步，从海洋生物中发现新化合物已变得比较容易， 但开发海洋药物仍有许多困难，其关键在于药源难以解决。运用生物技术手段( 基因工程、 细胞工程、发酵工程或生物反应器等技术) 来培植新的海洋药源生物，以获得大量海洋天然 产物，这是在海洋药物的研究与丌发过程中，解决药源问题的一个可行的现实途径。目前 美国、t q 本等在此领域内集中开发，已取得了不少成果，并产生了“海洋生物工程学”这 一新兴学科。我国对提取分离技术、分子修饰技术，海洋生物技术在海洋药物丌发方面的 应用也有了较大进展，特别是运用海洋生物技术方面有些重要突破。而针对海洋药物研究 开发中存在的问题，运用现有技术的组装集成，形成关键技术体系将为我国海洋药物研究 第一章前言 与开发注入新的活力。 近几十年来，国内外已从海藻，海参，海绵，珊瑚，海鞘等不同海洋动植物中分离