PCR技术将在临床检验领域迎来新契机.doc

PCR技术将在临床检验领域迎来新契机 来源：广东医学2010年2月第31卷第3期 周高英，叶锋 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司(北京100176)1985年，Mullis发明的聚合酶链式反应(PCR)技术在医学界掀起了基因诊断技术的热潮，PCR技术凭借快速、简便、灵敏等优点以惊人的速度广泛应用于临床基因诊断等领域，成为现代医学发展的又一里程碑。但十多年的临床实践表明，PCR技术本身在工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR产品标准化等方面还存在着若干弊端，这导致检测结果上的差异，这已经成为当前困扰临床医师、实验室技术人员以及患者的普遍问题。本文将从PCR技术产业发展回顾、诊断试剂的标准化以及PCR技术在临床检验领域的新契机等3个方面进行阐述。1 PCR技术及产业发展历史回顾1985年，美国MULLIS等1发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并依靠此项技术获得1993年诺贝尔化学奖。1989年，HoffmannLa Roche公司和Cetus公司开始将PCR技术应用于临床诊断领域。1996年，美国Applied Biosystems公司推出全球首款实时荧光定量PCR技术，并在欧美各国悄然兴起 ，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点，因而在各级临床实验室得以迅速推广3。PCR技术于90年代中期在国内全面展开临床应用工作，但是由于传统的PCR技术本身存在着许多局限性(如产物不能准确定量、容易交叉污染、导致假阳性等)，在1998年遭到了卫生部门的明令禁止。此后，由于荧光定量PCR技术的出现以及国内外学者的不懈努力，政府相关部门于2002年颁布临床基因扩增检验实验室管理暂行办法和临床基因扩增检验实验室工作规范等一系列准入文件，从制度上规范了PCR实验室运作，建立起有效的质量保障体系4。目前，已有多家国内外生产厂商涉足研发生产适用于临床诊断的PCR检测试剂盒，并在PCR产品市场中占得先机。经过多年的发展和完善，荧光定量PCR技术在国内科研、检测和诊断领域已得到广泛应用，无论是产品种类、产品质量、技术优势和市场规模均可与国外厂家相媲美，另外，由于试剂价格远低于进口产品，国产PCR诊断试剂占领了绝大部分国内市场份额。2 临床PCR诊断试剂产品的弊端临床实验室检验标准化并非单一因素，它由诸多关键性环节组成，其中工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR试剂产品标准化是PCR临床检验标准化的核心内容。目前国家颁布的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法和临床基因扩增检验实验室工作规范等一系列准入文件从根本上规范了工作流程标准化问题；对PCR仪器标准化而言，一些进口PCR仪器依靠高度的稳定性、可重复性和高效的数据分析软件，已实现了实验数据的可靠性和标准化操作流程；由于价格占优，国产PCR诊断试剂占据了国内的大部分市场，但是由于不同的厂家缺乏统一的检查标准，往往使得同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果存在较大差异。这已经成为困扰临床医生、患者以及实验室技术人员的普遍问题，这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。目前对于PCR诊断产品标准化主要存在以下4个问题：2.1 定量的目的和意义不明 除少数种类试剂外，目前已上市的大部分试剂盒并不是报告原始样本中病原体的浓度，而是核酸提取后产物的靶基因浓度，并不能真正反映原取材样本的靶基因的真正含量。选择合适的实验标本是减少实验误差的第一个过程，然而不同实验的实验样品并不具有通用性，很难确保实验样品的均一性。在人体，血液样本容易收集、相对恒定、能确保不同样本间的比较，对血液中病原体进行定量检测更精确且有实际意义。然而对于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、组织块等样本，由于采样时患者的生理状况和取样部位等因素，虽然用物理、化学或酶的方法对标本进行了处理，但仍然无法做到均一性和可比性，因此其所谓的定量仅仅是针对核酸提取物中靶基因定量。2.2 定量的依据不妥 据调查，目前市场上PCR定量试剂无一例外都采用质粒做为试剂盒定量标准。由于质粒是一种人为构建的脱氧核糖核酸载体，环状物理构象存在特殊性，和线性的基因组DNA相比，PCR扩增效率上具有差别。因此，先进行质粒拷贝数定值，再通过比较各个样品扩增曲线Ct值来获得病原体基因组DNA的浓度，这样的流程缺乏严谨的逻辑依据。有些厂家甚至用质粒标定RNA(有的病毒遗传物质为RNA)拷贝数，就更加无据可依。同时，采用与待检样本性质差异很大的质粒作为标准品或质控品，也无法回避检测过程的基质效应。2.3 定量的准确性不能保证 核酸提取：临床样本的多样性给核酸的提取和纯化提出了新的问题，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的优势，因此很难建立一个标准化的临床标本制作处理过程，这对于样本的预处理、核酸的提取、提取的效率评估，也是核酸纯化方法标准化的重要指标。内标选择：目前多数PCR试剂生产厂商并没有引入质量控制措施(如内标)和校正品，这对于病原体数量准确定量就无从谈起。虽然医院对于某一两次检测值的精确度要求不是太高，但对于那些引起重大疾病的病原体，如乙型肝炎病毒载量的长期监控，准确量化就成为临床十分迫切的要求，这也是现阶段体外诊断试剂生产厂家亟待突破的瓶颈。PCR实验过程：不同的PCR仪器、不同厂家的试剂、不同的操作者也是造成实验定量不准确的重要指标之一。2.4 试剂缺乏稳定性 稳定性是体外诊断试剂必须具有的基本属性，是确保产品在使用过程中安全有效的重要指标。通过对不同条件下产品的主要质量指标随时间变化情况的检测，可以为产品的保存条件和有效期的确定提供依据。而试剂方法的标准化以及标准物质的应用是保证实验室检验结果准确性的前提，在日常检验工作中应用标准物质，将极大地改善不同实验室间检验结果的可比性，从而逐步实现不同实验室间检验结果有条件的互认。3 PCR技术在临床检验领域的新契机分子生物学发展至今，人类基因组的草图早已绘就6，许多信号传导通道也已阐明7，PCR技术已经成为分子生物学十分便利的工具。然而谈到与临床检验相结合，仍有许多待改进的地方，未来的PCR临床发展之路，需要更加紧密地结合临床、体外诊断(IVD)基本要求和新材料、自动化技术等研究领域的基础理论，并在产品设计、制造工艺上取得新的突破，只有这样方能有效弥补目前PCR技术存在的缺陷，进一步拓宽这项技术的应用空间。3.1 标准化 首先，PCR技术面临的历史任务是解决标准化问题。应该说，定量这一概念的提出为PCR标准化进程迈出了第一步，但这还远远不够。标准化不仅意味着统一的量化形式，更重要的是建立固定、可重复的流程，严谨完备的质量控制体系，一致且具可比性的评估方法。满足这些条件，机器自动化无疑是最好的选择。3.2 自动化近2O年，检验医学以惊人的速度和规模获得了巨大的发展，其中自动化的迅速发展尤为迅猛，它将传统的人工检测手段提高到自动化检测的新水平，为精确、微量、快速和组合检验提供了有力的保障，自动化已成为临床检验的趋势。PCR扩增的自动化早已实现，因而核酸提取纯化的自动化就显得更为重要。近年来各仪器厂商纷纷推出磁珠法提取仪器，如Roche MagNA Pure LC，利用电磁效应以及纳米级的磁性颗粒进行核酸的分离纯化，其提取效率相比之前的自动化系统有了明显提高8。核酸提取纯化与PCR扩增联为一体的自动化检测系统则是临床诊断的趋势，如Handy-Lab公司的Jaguar全自动检测系统。仪器的自动化是临床PCR标准化的最佳选择，自动化程度越高，标准化越容易实现。虽然目前这些仪器以及配套耗材的价格偏高，但并不影响各大医院对这些新生技术平台的接纳。近年来，政府对重大传染病(如乙肝、丙肝、结核等)项目予以资金上的支持，旨在加强这些重大传染病的监控与防治。目前这些仪器设备已进入医院和院方检验的需求进一步磨合，加上生产成本平摊之后，完全取代人工操作的情景必将成为现实。3.3 高通量 (1)绝对通量的提高。过去PCR 由于通量不高而一直受人诟病，不久前挪威公司DiaGenic联合关国ABI公司开发出类似普通生物芯片的Taqman微量液体反应板，让人们看到了PCR微型化并实现高通量的希望9-10。该仪器含有384孔独立反应体系，具有良好的灵敏度、特异性和宽泛的动力学范围。在新的技术平台下，精细繁琐PCR加样的工作将完全由仪器取代，精密度进一步得到改善。另外，新的加样方式进一步微缩反应体系，1块普通的PCR反应板便能同时进行上万个反应，1次即能检遍人体内的多种基因的表达情况。Abgene公司推出的水浴热循环仪PCR一次可完成24块板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次测序反应可达到241 536=36 864个样本，真正实现了仪器的高通量。(2)相对通量的提高。相比于那些体积大的高通量仪器，临床实验室更需要一些系统结构简单、体积小、容易实现自动化操作、分析通量高的仪器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了独特的的VerriFlexTM 加热模块，它具有6个独立控制的peltier加热块，相当于6台PCR，为具有优化得到的有不同的退火温度的引物和探针的用户提供了操作的灵活性。3.4 PCR技术的发展扩大了临床应用 (1)应用种类和范围扩展。受益于生物信息学迅速发展，PCR检测的种类和范围也在日渐扩大，从一开始纯粹检测人体中的感染源，到现在检测各种基因的突变缺失，判断病原体的耐药性或人体对于某些疾病的易感性，从而实现个体化用药和治疗11。目前已在遗传病的产前筛查、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证、动植物检疫等方面展现了良好的应用前景。(2)结合其他分子生物学技术扩展。近十年来，PCR技术衍生出许多精细分支，它与免疫学方法、核酸杂交以及测序技术的结合大大丰富了分子生物学的应用领域 ，目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生，并在临床上得到广泛的应用，如TaqMan MGB探针技术使得单纯使用PCR技术对单个碱基的突变进行检测成为可能，在临床上可以对疾病相关位点(如耐药位点)进行检测；PCR结合测序技术，测序技术是在产生PCR产物的基础上，一次能获得更多的序列信息，被视为核酸序列研究的“金标准”，特别适用于多个疾病相关位点的检测(如乙肝病毒P区耐药位点检测、EGFR、KRAS等靶向药物耐药突变检测)；单碱基延伸技术(single base ex-tension，SBE)，该技术可对突变位点进行检测，这是很多高通量SNP分型技术的基础。高通量的SNP分型在临床上适用于大量标本的快速检测，如在人群中筛查携带某个疾病相关位点的个体。高分辨熔解曲线技术(HRM)是在PCR体系中加入饱和荧光染料，通过控制体系的温度变化，绘制PCR产物的温度熔解曲线图。依据杂合异源双链的原理，不同的DNA双链由于长度、GC含量、错配性等存在差异而具有不同的温度熔解曲线。该技术特别适用于那些无需确定突变位置和类型的快速筛查，如Kras基因12、13位密码子的任一突变，若使用TaqMan，需要多个反应检测8种基因型，而HRM 只需要检测野生型和非野生型。这些新技术的应用极大地增强了PCR技术对于基因细小差别的分辨能力，将PCR技术精细化的应用潜力提升到了一个新的层面。4 结语尽管PCR技术已经进入临床检验领域多年，但当前仍被视为一种辅助的临床诊断方法。不过随着分子生物学理论的快速发展，PCR技术与新材料、自动化科学的结合日益紧密，并融合新的工艺设计，逐渐凸显出以标准化、自动化、高通量以及精细化为代表的几大发展趋势。这些因素不仅为将来的PCR诊断试剂产业的发展预留了广阔空间，而且指明了方向，同时对现有的PCR产品和产业格局提出了挑战和变革要求。综上所述，PCR技术以及相关产业即将在临床检验领域迎来全新的发展契机。参考文献1 MULLIS K，FALOONA F，SCHARF S，et a1Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:the polymerase chain reactionJCold Spring Harb Symp Quant Biol，1986，51 Pt 1：2632732 HOLLAND P M，ABRAMSON R D，WATSON Ret a1Detec-tion of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymeraseJProc Natl Acad Sci U S A，1991，88(16)：7276-72803 KALININA O，LEBEDEVA I，BROWN J，et a1Nanoliter scale PCR with TaqMan detectionJNucleic Acids Res，1997，25(11200)：1999-20044 李金明临床基因扩增检验实验室的规范化J解放军检验医学杂志，2002，1(2)：99-1005 程钢，何蕴韶，周新宇荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒J 中华医学检验杂志，1999，22(3)：135-1386 McPHERSON，J D，MARRA M，HILLIER L，et a1A physical map of the human genomeJNature，2001，409(6822)：934-9417 HIMPE E，KOOIJMAN RInsulin-like growth factor-I 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