pYTAC747HsacB载体的培养与功能分析.doc

pYTAC747H/sacB载体的培养与功能分析曹辉，徐粤宇*，肖炎凤，吴东旺，叶玉平，谭啸，彭迪（湖南工程学院化学化工学院, 湖南 湘潭 411104）摘要：通过对pYLTAC747H/sacB载体进行优化培养，绘制其生长曲线，用碱裂法小量提取TAC载体DNA，琼脂糖凝胶电泳分离载体DNA，研究了菌体活性及pYLTAC747H/sacB载体的一系列性能，获得了pYLTAC747H/sacB载体的一系列数据，可以作为载体pYLTAC747H/sacB培养条件的优化，标记筛选等的依据。关键词：pYTAC747H/sacB，大肠杆菌DH5，卡那霉素Culture and Functional Analysis of pYTAC747H/sacB VectorCao Hui Xu Yueyu* Xiao Yanfeng Wu Dongwang Ye Yuping Tan Xiao Peng Di(Chemistry and Engineering Department of Hunan Engineering Institute, Xiangtan 411104, China)Abstract: By culture and functional analysis of pYTAC747H/sacB vector，we can received a series of data of vector pYTAC747H/sacB,the series of data can be a Optimization of Culture Conditions or marking the basis for selection to pYTAC747H/sacB. By using LB culture medium as a basis for its revitalization, culture bacteria，By measuring its absorbence to draw the growth curves of E. coli DH5 which carry vector pYTAC747H/sacB. Its proved that pYTAC747H/sacB have the resistance of kanamycin by the method of Contrast culture. A small amount of extracting plasmid DNA in a alkalic condition，Agarose gel electrophoresis separation of plasmid DNA, have researched the activity of bacterial and a range of performance of pYLTAC-747H/sacB vector.Key words: pYTAC747H/sacB E. coli DH5 KanamycinLiu YG 等结合PAC(PI-derived artificial chromosome)载体和BIBAC(a- binary BAC)载体的特点，构建了植物可转化人工染色(Transformation- compe tent artificial chromosome,TAC)载体。TAC载体含Pl噬菌体和发根农杆菌Ri质粒的复制子，从而它能够在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式穿梭复制(樊颖伦等，2004; Kotani等，1998) 【3】。因此，一旦筛选到目标阳性克隆，可直接利用农杆菌转化系统将其转到植物体中进行基因功能互补实验，不必进行亚克隆，减少了工作量，加速了工作进程。此外TAC载体还含有一个卡那霉素的抗性基因，便于进行目的基因的筛选。pYTAC747H/sacB的物理图谱如下图所示【3】：pYTAC747H/sacB的物理图谱1、材料与方法1.1、菌种E. coli DH5，pYTAC747H/sacB：由华南农业大学的刘耀光科学家提供。1.2、培养基及试剂1.2.1、LB液体培养基（组分为百分比/%） 蛋白胨（Bacto tryptone）1%，酵母提取物（Bacto yeast extract）0.5% ，NaCl(sodium chloride) 1%。1.2.3、LB固体培养基（组分为百分比/%） 蛋白胨1%，酵母提取物0.5% ，NaCl1%。加入1.5%的琼脂（Agar)配成固体培养基。以上的培养基均调节PH至7.0并添加过滤除菌的卡那霉素，至终浓度25g/ml1.2.4、碱法提取质粒用试剂的配置溶液I：50 mmolL葡萄糖，25 mmolL Tris-HC1(pH值80)，10 mmolL EDTA(pH值80)，配制完成后高压灭菌15 min，储存于4C冰箱。溶液：02 molL NaOH，1 SDS，用前新鲜配制。溶液 ：溶液组成为：K 3 molL，Ac一5 molL，配制完成后高压灭菌15 min。1.3、培养方法1.3.1、菌种的活化、培养与获得单克隆将LB+Kan 25g.L-1固体培养基趁热倒入培养皿中。用5ml无菌水将菌种稀释，培养基冷却后，用一接种环挑取菌种，在固体培养基上划线，把平板放37恒温箱中倒置过夜培养【5.6】。1.3.2、扩大培养用一接种环挑取画平板中的单菌落菌种接种于液体培养基中，将培养基置于37的恒温摇床中250r/min过夜培养。1.4、分析方法1.4.1、菌体的生长曲线的绘制接种单克隆菌种于LB+Kan 25g.L-1液体培养基中，置于37的恒温摇床中摇培，分别于培养时间0h、1.5h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h、取出适量培养物于比色皿中用可见紫外分光光度计进行OD（600）值测定，平行测定四组数据，依据测得数据的平均值绘制生长曲线【5.6】。1.4.2、pYTAC747H/sacB载体的功能分析分别取取含LB+Kan 25g.L-1固体培养基的培养皿及只含LB固体培养基的培养皿各一个，用记号笔将每个平板一分为二，且做标记，一边接种含pYTAC747-H/sacB载体的大肠杆菌DH5，另一边接种大肠杆菌DH5，将接好中的平板置于37恒温箱中倒置过夜培养。1.5、碱裂法小量提取质粒DNA以1.25ml菌液为例：从扩摇的菌液中取1.25ml菌液入1.5ml离心管中，以4500rpm离心10min，弃上清，用无菌纸吸去管壁上的液滴。加入0.2ml溶液入一离心管中，室温放置10min(等渗作用)。加入0.2ml新鲜配制的溶液，快速颠倒5次，置于冰浴5min（破膜作用）。加入0.15ml预冷的溶液，快速并轻柔颠倒10次（千万不可漩涡震荡），置于冰浴5min（使核DNA、蛋白质沉淀作用）。以12000rpm离心10min，取200ul上清液于别一支新管中，记号。每支离心管中加入等体积-20 70%冷乙醇，混匀后充分振荡，置冰浴10min。以12000rpm离心15min，弃上清液。用70%乙醇0.5ml再洗涤一次。沉淀干燥后，在超净工作台中，用0.1mlTE缓冲液吹打溶解【7-12】。1.6、琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA1.6.1、配胶，制板称取0.35 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml 1TAE,瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成0.5%琼脂糖凝胶液。冷却至60，加入3.5ulGold view 型核酸染色剂，摇匀。取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层【13】。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。1.6.2、点样，电泳取4Loading buffer于洁净的一次性手套上，将小指管中保存的质粒取42ul，DNA/coil Hind 42ul，相互混匀，每份与一分Loading buffer混匀后点样。点样后先于30v电泳1小时40分钟，后将电压升至40v电泳2小时30分钟。2、结果2.1、菌种的活化培养利用平板划线法对菌种进行活化培养获得单克隆菌落并对单菌落进行扩摇培养：划线培养得到的单菌落纯培养液于扩摇培养得到的细菌悬液2.2、生长曲线的绘制以不同培养时间下的OD(600)值为纵坐标，相应的培养时间为横坐标绘得单克隆培养物的生长曲线。实验平行测定了八组数据，取其平均值并以该均值为准绘制生长曲线，数据及处理如下: 组别 OD时间 值12345678总平均值00.0070.0020.0030.0030.0030.0030.0020.0030.00331.50.0080.0030.0030.0030.0040.0050.0030.0030.004030.0160.0050.0040.0050.0050.0160.0040.0040.007440.0410.0100.0090.0070.0160.0480.0120.0130.019560.1740.0860.0600.0160.0930.1640.0910.0640.093580.6860.3420.3910.1500.3920.6490.3510.4020.4204101.5901.1161.3920.7771.2081.6011.1251.3861.2744122.0551.6682.2741.6891.7122.1071.6922.2591.9320142.1032.1362.4782.4242.2352.1502.1482.4842.2698162.0792.1422.3822.3342.2392.1392.1522.4892.2445201.9892.1002.3162.3882.2012.1022.1212.4202.2046绘生长曲线时的各时间段的培养物含载体pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5的生长曲线2.3、载体pYTAC747H/sacB功能的分析通过对比分析大肠杆菌DH5和含pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5对卡那霉素抗性，结果得到含pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5能在含卡那霉素的LB固体培养基中生长，而大肠杆菌DH5却不能在含卡那霉素的LB固体培养基中生长，近而得出pYTAC747H/sacB对卡那霉素具有抗性。对比培养如下：含载体pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5及大肠杆菌DH5同时在不含卡那霉素的LB固体培养基中的生长情况含载体pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5及大肠杆菌DH5同时在含卡那霉素的LB固体培养基中的生长情况2.4、碱裂法提取质粒及电泳利用碱裂法小量提取pYTAC747H/sacB DNA，并用0.5%琼脂糖凝胶对其进行电泳分离分析，得到相关的三条带（如下图）。pYTAC747H/sacB DNA为环状DNA分子，且成超螺旋状存在，理论上提取出的DNA分子也应该为环状的超螺旋状，但在提取的过程中难免会有机械剪切力，使得最终得到的DNA分子存在三种物理形态，即超螺旋，线性，开环。当这三种形态的DNA分子经DNA/coil Hind（DNA/coil Hind在pYTAC747H/sacB中只有一个酶切位点）剪切后，超螺旋和线性的DNA分子成为开环的，应其拷贝数大在电泳过程中迁移得慢，便得图中的条带1；对于开环的DNA分子经DNA/co- il Hind剪切后分为两条短链，分别为图中的条带2于条带3，拷贝数较大者为条带2，较小者为条带3。同时还会有一些其他的杂质如RNA，蛋白质等，如图下方的一些微弱的条带。pYTAC747H/sacB DNA的0.5%琼脂糖凝胶电泳图图中的1、2、3、4均为同一样液3、讨论pYTAC747H/sacB的优点由于pYTAC747H/sacB具有卡那霉素的抗性而细菌对卡那霉素不具抗性，我们就可以利用pYTAC747H/sacB的这一功能，进行目的筛选工作。即当利用pY- LTAC747H/sacB携带目的基因进行转导时，要检验目的基因是否转导入受体菌株中，我们就可以将转导后的菌株接种于含卡那霉素的培养基中进行培养，能在其中生长的菌落便是已有目的基因转导进入的受体菌株，从中挑取便可分离得到含目的基因的菌株。该标记的筛选原理简明，操作简单，假阳性几率低。4、结论 本实验通过平板技术，连续划线法获得了含pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH- 5的单克隆，再将获得的单克隆进行扩摇得到了单克隆扩摇培养物。在单克隆扩摇的的基础上，借助比浊法测定菌株的生长曲线，得到了菌株的各个生长时期所需的时间，此数据可作为菌种培养及发酵的参考数据，作为优化菌种培养的依据。通过大肠杆菌DH5和含pYTAC747H/sacB的大肠杆菌DH5对卡那霉素的抗性的对比分析，结果得到pYTAC747H/sacB对卡那霉素具有抗性，利用pYLTAC- 747H/sacB的这一功能，我们可以方便的进行目的筛选工作；在此基础上进一步利用碱裂法小量提取pYTAC747H/sacB，提取完后用0.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离分析，得到了pYTAC747H/sacB的三个条带，以此分析得到pYTAC747H/sacB的酶切效果。参考文献：1 Xu yueyu，Zhou yulei， Song linlin，Zhang yan，Zhao maolin，Construction and characterization of the transformation-competent artificial chromosome (TAC) libraries of Leymus multicaulisJ, Sci China Ser C-Life Sci,2008，51(7) :604-613.2 徐粤宇*,周玉雷,宋琳琳,张艳,赵茂林.多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建和鉴定J.中国科学C辑,2008,38(4):328-336.3 宋琳琳，赵茂林