《畜肉食品中鸭源性成分PCR检测方法》 标准文本

ICS67.050X 04备案号：DB22吉 林 省 地 方 标 准DB XX XXXXXXXXX畜肉食品中鸭源性成分 PCR检测方法Determination of duck materials in meat by PCR methodXXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施吉 林 省 卫 生 厅 发 布 前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省卫生厅提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、邴炜、华蕾、刘金华、初真林、王莹、李媛媛、周亮、刘晓晖、刘静秋、王潇、赵立群、任明月、王颖。 畜肉食品中中鸭源性成分检测方法 PCR 法1 范围本方法规定了畜肉食品中鸭源性成分检测方法。本方法适用于新鲜、冰冻畜肉和肉干、肉酱、酱肉、火腿、肉松等畜肉加工食品中鸭成分定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1术语和定义鸭源性成分 duck-derived materials鸭种属特异性 DNA 片段。4原理对样品进行 DNA 提取，使之适用于 PCR 检测技术，通过 PCR 扩增，检测其中是否含有鸭特异性基因序列，达到对畜肉食品中鸭源性成分定性 PCR 检测的目的。5试剂和材料除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1鸭源性成分检测用引物（对）序列为：F：5- CATCTATCCTGCTAGCCGCC -3R：5- GGCTTGAGTGGAAGAATGCC -35.2CTAB 提取缓冲液：CTAB 20g/L ，氯化钠 1.4 mol/L，Tris o.1 mol/L，EDTA 20 mmol/L，pH 8.0，高压灭菌。使用前加入终浓度为 2%的 -巯基乙醇。5.3CTAB 沉淀液：CTAB 5 g/L ，氯化钠 0.04 mol/L，pH 8.0，高压灭菌。5.4氯化钠溶液：1.2 mol/L。 5.5蛋白酶 K 溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为 20 mg/mL 的溶液，分装后于-20 保存，避免反复冻融。5.6无水乙醇、异丙醇等有机试剂。5.7食物基因组 DNA 提取纯化试剂盒。5.810PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4 ）， 200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。5.9 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.10Taq DNA 聚合酶。5.11分子量标记：100 bp DNA Marker。5.12琼脂糖：电泳纯。6仪器和设备6.1天平：感量 0.01 g。6.2PCR 仪。6.3电泳仪。6.4凝胶成像系统。6.5高速冷冻离心机：最高转速 12 000 r/min 以上。6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7振荡器。6.8恒温水浴锅。6.9冰箱：2 -20 。6.10微量可调移液器及配套吸头：0.5 L 10 L、10 L 100L、20L 200L、200L 1 000L。6.11离心管：1.5 mL。7抽样7.1采样工具下列采样工具应经180 2 ，2 h高温灭菌：剪刀、镊子、钎子。7.2样品采集待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。7.3样品储运样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放入一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。 7.4试样制备与保存7.4.1试样制备从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分出不少于 500 g 作为试样。装入清洁容器中，加封后，标明标记。7.4.2试样保存将试样于-20 冷冻保存。8检测步骤8.1待检样品的制备8.1.1样品的设置检测过程中设置核酸提取空白对照、PCR 扩增空白对照、PCR 扩增阴性对照、PCR扩增阳性对照。8.1.2样品前处理加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式的样品前处理尽量去除样品中的盐、糖和色素。具体步骤是：取约500 mg样品加入50 mL离心管，加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒充分混匀，8 000 g离心5 min并弃去上清夜，重新加入约2倍体积的双蒸水，上下颠倒混匀，8 000 g离心5 min并弃去上清夜，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。悬乳浊或浊状的液体食品样品，如酱汁等，可以通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2 mL离心管， 8 000 g离心 5 min并弃去上清液，再次加入适量样品， 8 000 g离心5 min并弃去上清液，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。8.1.3样品均质采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。8.2DNA 提取和纯化8.2.1CTAB 法称取500 mg待检样品于15 mL离心管中，加入5 mL CTAB裂解液和20 L蛋白酶K溶液，65 温育1 h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时，再加入适量CTAB裂解液；8 000 g离心5 min，取1 mL上清于2 mL离心管中，加700 L三氯甲烷，漩涡震荡30 s，1 4500 g离心10 min，收集600 L650 L上清液到新的2 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温60 min；14 500 g离心5 min，去除上清液，加350 L氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，漩涡震荡30 s，14 500 g离心10 min，转移上清液到新的离心管。加0.8倍体积异丙醇，室温20 min，14 500 g离心10 min，加500 L70%乙醇水溶液，漩涡震荡30 s，14 500 g离心10 min，去除上清液，室温条件下过夜或者60 烘15 min25 min，注意不要让沉淀过干。加50 L双蒸水溶解沉淀，-20 保存。8.2.2试剂盒法采用商品化的食品基因组DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。8.3DNA 浓度测定 采用紫外分光光度法测定DNA，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2 g/mL50 g/mL，值应该在0.051的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260 nm处测定其吸收值，1 OD260nm=50 g/mL双链DNA或38 g/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260nm / OD280nm比值为1.72.0。8.4PCR 检测8.4.1PCR 反应体系表1 PCR反应体系试 剂 加入量 （ L）10PCR buffer 2.5dNTP 溶液(10 mmol/L) 0.5Taq DNA 聚合酶 (5 U/ L) 0.2上游引物(10 mol/L) 1.0下游引物(10 mol/L) 1.0DNA 模板（100 ng/ L) 2.0补水至 258.4.2PCR 扩增条件94 预变性 5 min，94 变性30 s，58 退火30 s，72 延伸30 s，共35个循环，最后72 延伸10 min。不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。8.4.3凝胶电泳检测 PCR产物用电泳缓冲液（1TAE）制备1.0%1.2% 琼脂糖凝胶（55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 g/mL，也可在电泳后进行染色）。取8 L15 L PCR扩增产物，分别和2 L上样缓冲液混合，进行点样，用100 bp DNA Marker作参照。 9 V/cm恒压电泳，电泳20 min40 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.4.4限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系（20 L）：Stu I 酶 2 U，酶切缓冲液2 L，加入PCR扩增产物至总体积20 L。酶切在37 下进行，20 min。酶切完成后电泳，方法见8.4.3 。9结果判断与表述9.1PCR 扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201 bp（序列参考附录A）。9.2酶切性内切酶酶切结果 阳性样品PCR产物采用内切酶 Stu I 酶切后，酶切片段大小为118 bp和 83 bp。9.3结果表述PCR产物和酶切产物都为阳性者判定含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 附 录 A（资料性附录）PCR产物测序结果CATCTATCCT GCTAGCCGCC