（分析化学专业论文）hsmb型电化学活性开关分子信标的研制及其应用研究.pdf

2 0 1 1 d i s s e r t a t i o nf d rm a s t e rs c h o o lc o d e ： 1 0 2 6 9 s t u d e n t sn u m b e r ：5 1 0 8 0 6 0 6 0 3 4 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d y0 nt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o n o fan o v e l h s m be l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v es w i t c h m o l e c u l a rb e a c o n d e p a l t m e n t ：塾竺坐i ! ! = y m a j o r ：望垒! y 垡垒!塾竺盥i 墨! 盟 r e s e a r c hf i e l d ：e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s s u p e r v i s o r ：苎苎i 苎! 垒望! ! = q ! 垒兰q ! = 塾竺望g 鱼望i ! 壅坠g ! = q 堡墨璺q ! = 旦旦i 塾g 垒塾g 星垒坠g ：【坚圣丛i s t u d e n t sn a m e ：) 苎纽坠g q i a p r i l ，2 0 l l ，s h a n 曲a i 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文h s m b 型电化学活性开关分 子信标的研制及其应用研究，是在华东师范大学攻读硕博士( 请 勾选) 学位期间，在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 互蔓赵日期：知1 1 年f 月牛日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 h s m b 型电化学活性开关分子信标的研制及其应用研究系 本人在华东师范大学攻读学位期间在导师指导下完成的硕士学位论 文，本论文的研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学 根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管部门和相关机构如国 家图书馆、中信所和“知网 送交学位论文的印刷版和电子版；允许 学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校 将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索， 将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合 理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) () 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密 学位论文 木，于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 朋不保密，适用上述授权。 导师签名本人签名 銎蔓熟 讪1 1 年 月叶日 f 王堪硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 华东师范大学 徐通敏教授答辩主席 化学系 华东师范大学 楚清脆副教授答辩委员 化学系 华东师范大学 施国跃教授答辩委员 化学系 论文摘要 论文摘要 伴随着基因结构和基凶功能研究的深入开展，尤其是“人类基凶组项目”完 成后，对于人类相关疾病的基因诊断和基因治疗的研究迈入了一个新的纪元，但 其首要条件在于对致病基因碱基序列的识别和确定。而传统的d n a 测序方法存在 一些局限，比如，劳动强度大且消耗时间较长。但是随着w 乱s o n c r i c k 对碱基互 补配对原则的深入探究，为分子生物学的相关研究和开发提供了一个全新的基因 检测方法一d n a 探针。其中，以杂交技术为基础的d n a 探针技术，当结合一些 标记方法，比如，荧光法，电化学法，化学发光法后，将会使d n a 探针得到一 定程度的优化使用，比如，免去了放射性物质对人体的危害；降低了标记物昂贵 的价格；节省了操作时间等，具有特异性好，快速灵敏，操作简便和无污染等特 点，且还具有分离纯化基因及分子识别的功能。目前这种类型的分子探针已经成 为基因研究领域中最具有吸引力的课题之一。 最关键的问题在于怎样找出导致各种各样基因疾病的基因，并且具有高灵敏 度和高选择性。目前检测d n a 的错配差异性最有用的工具是分子信标，其和线形 信标相比，具有高的目标选择性，因为信标分子特殊的茎环结构使得在检测前多 了一步打开茎环结构进而才与目标物进行杂交反应的过程。因此在某种程度上提 高了选择性。在本论文中，我们设计了一种新型的电化学分子信标，将之命名为 “新型电化学活性开关分子信标”，其作用机理类似于传统的以荧光基团一猝灭基 团为基础的分子信标。在此，我们使用了具有二聚能力的卟啉铁分子，并将其连 接在分子信标两端，在没有目标分子存在时，连接在信标两端的完全相同的卟啉 铁分子因为受到茎环的作用力而无限靠近，因此呈现二聚状态，此时表现出非电 化学活性特征，电化学信号被抑制；当加入目标分子时，分子信标将于目标序列 互补结合，此时分子灯塔被迫使打开，连接在其上的两个卟啉铁分子也同时被强 制分开，破坏了卟啉铁的二聚体结构而使卟啉铁以单体状态存在，因此此时电信 号恢复。这种类型的信标既具有传统荧光信标简单快捷、易于控制的特点，又具 有电化学技术成本低廉、易于小型化、便于野外操作的优势。 论义摘要 论文分为三章： 第一章：绪论 以杂交技术为基础的d n a 探针技术，结合一些标记方法后，比如，荧光方 法，电化学方法，化学发光方法后，使d n a 探针得到一定程度的优化，为分子 生物学的相关研究和开发提供了一个全新的基因检测方法分子信标技术以其高 选择性及特异性成为目前基因研究领域中的热点之一。本章通过对分子信标技 术，主要从荧光分子信标和电化学分子信标及卟啉铁的性质及应用的归纳及总 结，详细说明了本论文所研究课题的理论基础和选题依据。最后阐述了本论文的 目的意义及创新之处。 第二章：h e m i n 电化学开关行为的探讨和h s m b 电化学活性开关分 子信标的合成研究 众所周知，h e m i n 是一种高度疏水性的分子，在中性和弱碱性溶液中具有较 差的溶解性，大量的科研数据已经证明：h e m i n 溶液的物理和化学性质随着它的 聚集状态的改变而改变，因为h e m i n 的结构中存在疏水性基团乙烯基，致使h e m i n 的卟啉结构部分聚集趋势相当明显。本章通过实验证明h e m i n 的单体和二聚体的 电信号值存在很大的差异，可以将其用在新型电化学活性分子开关上。同时，通 过采用各种方法对所合成的新型电化学活性开关分子信标进行表征。实验结果表 明，合成出的分子信标良好，为新型信标在生物化学领域中的应用奠定了基础。 第三章：基于h s m b 型电化学活性开关分子信标的应用研究 p 5 3 基因是一种重要的致癌基因。据文献报道，人类5 0 的肿瘤是因为存在 论文摘要 p 5 3 基因的突变或缺失，因此p 5 3 基因的检测就显得至关重要。在本章中，我们 首先合成了一种h s m b 型电化学活性开关分子信标，这种类型的信标分子在未 加目标分子的情况下没有电化学信号，但当与完全互补杂交序列发生杂交反应后 则产生电化学信号，并将其应用于p 5 3 基凶的定性、定量检测及其s n p 突变的 识别。实验结果证明，电化学检测d p v 的峰电流值与目标d n a 的浓度之间有 良好的线性关系，回归方程为y = 8 e 0 8 x + 2 e 0 7 ( x 为目标序列的浓度，y 为响 应的峰电流值，r i 0 9 8 6 1 ) ，得到其最低检测限为3 n m 0 1 。且对一碱基错配序列与 完全互补序列的响应信号有较明显的差异性，初步证明，该分子信标可以实现对 目标分子的定量检测和s n p 突变的识别上。 关键字：d n a ，电化学，h e m i n ，分子信标，p 5 3 ，电化学活性非活性，单碱 基错配 a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d yo nm em e c h a n i s mo fg e n e 向n c t i o na 1 1 dt h es t r u c t u r eo fi tn o w a d a y sa r ea v e 巧h o tr e s e a r c hf i e l d t h em o s ti m p o r t a n ts u c c e s so ft h i s f i e l di st h e h u m a n g e n o m ep r o j e c t ”，w h i c hm e a n sg e n o m i cd i a 弘o s ea n dt r e a t m e n ta r ei 1 1 黟e a tp r o s p e c t t h ef o u n d a t i o no fr e s e a r c hi sb a s e do nt h er e c o g n i t i o na n dd e t e m l i n a t i o no fd i s e a s e r e l a t e dd n a s e q u e n c e t h et r a d i t i o n a ld n as e q u e n c ed e t e c t i o nm e t h o d s ，w h a t e v e r a r eu s u a l l yi n c o n v e n i e n ta n dt i m ec o l l s u m i n g d n ap r o b e ，an e wc o n c 印t i o no fg e n e d e t e c t i o nw h i c hb a s e do nw r a t s o n - c r i c kb a s em a t c hp r i n c i p l eo f f e r e da nn e wo p t i o n a n dt h ed n a p r o b eb a s e do nd n ah y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e ，w i md i f r e r e n t1 a b e l i n g m e t h o d ss u c ha sc h e m i c a l l 啪i n e s c e n t ，n u o r e s c e n to re l e c 仃o c h e m i c a l ，s h o w i n gg r e a t a d v a i l t a g e ss u c h a sq u i c kd e t e c t i o n ，e a s yh a n d l i n g ，f a v o r a b l es e l e c t i v i 劬a n dh a s a b i l i t i e s0 fm o l e c u l er e c o g i l i t i o na n dd n as 印a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n r e s e a r c ho n t h e s ep r o b e sh a v eb e e no n eo ft h em o s ta t t r a c t i v ef i e l d si ng e n o m es t u d y n ed e t e c t i o no fd n aw i t hu n i q u en u c l e i cs e q u e n c ei so fc o n s i d e r a b l ec u 仃e n t i n t e r e s tt 0e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o r e n s i cr e s e a r c h ，m o l e c u l a rd i a g n o s t i c sa n d g e n o m es t u d y ak e yc h a l l e n g e ，h o w e v e r ，i sh o wt oi d e n t i f yt h eg e n ev 撕a t i o n s 1 e a d i i l gt oa l lk i n d so fg e n e t i cd i s e a s ew i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i 够ap 矾i c u l a r u s e 向1 t o o lf o rd e t e c t i n gd n aw i t hh i 曲m i s m a t c hd i s c r i i i l i n a t i o ni st h em o l e c u l a r b e a c o n s ( m b s ) d i s p l a y i n gh i g h e rt a 唱e ts e l e c t i v i t yc o m p a r e dw i t hl m e rp r o b e sd u et 0 t h ec o m p e t i n gr c a c t i o nb e 俩e e nh a i 印i nf o m l a t i o na n dt h et a 玛e th y b r i d i z a t i o n h e r e i n ， w ed e s i 口e dan e wc l a s so fe l e c t r o c h e m i c a l m b ， t e n i l e d “e l e c t r o c h e m i c a l l y a c t i v e i 1 1 a c t i v es w i t c h i n gm b ”t h em e c h a n i s mi sa n a l o g i c a lt on u o r o p h o r e q u e n c h e r p a i r o fm b w eu s e dap a i ro fh e m i nm 0 1 e c u l e sp o s s e s s i n gm ea b i l i t yo f s e l f d i m e r i z a t i o n mm ea b s e n c eo ft a r g e td n a ，t w oi d e n t i c a lh e m i i lm o l e c u l e si 1 1 也e m b sc l o s e dc o n f o n n a t i o nf o n nae l e c 们i n a c t i v ed i m e rb e c a u s et h es t e m l o o p s t n j c t u r eo fm bb r i n g sm et 、) l ，oh e m i nm o i e t i e si n t oc l o s ep r o x i m i t y ，a n d 嬲ar e s u l t ， e l e c 勃r o c h e m i c a ls i g n a l i ss u p p r e s s e d h o w e v e r ，o na d d i t i o no ft a 坞e td n a ，m ec e n t 】m l o o pd o m a 证w i l lh y b r i d i z ew i t hi t st a 玛e t ，f o r c i n gm em o l e c u l eu n f o l d ，t w oh e m i n a b s t r a c t m o l e c u l e sa r ep h y s i c a l l ys e p a r a t e d ，d i s m p t i n gm eh e m i nd i m e ra n dr e s u l t i n gi na d o u b l i n go ft h ee l e c t r o c h e i l l i c a ls i g i l a l 1 1 1a d d i t i o n ，o u rd e s i 印h a sp o t e n t i a lp c r a 瑚【p l i f i c a t i o na b i l i t yf o rr e a l 一w o d da p p l i c a t i o n sw 油m o d e ms i m p l ea n dp o r t a b l e m i c r o e l e c 仃o n i c s t h ed i s s e r t a t i o ni n c h j d e s 恤e ec h a p t e r s ： c h a p t e r 1p r e f a c e t h ed n a p r o b eb a s e do nd n ah y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e ，w i t hd i f r e r e n tl a b e l i n g m e t h o d ss u c ha sc h e m i c a l l u m i n e s c e n t ，n u o r e s c e n to re l e c t l o c h e m i c a l ，s h o w i n g 铲e a t a d v a n t a g e ss u c ha sq u i c kd e t e c t i o n ，e a s yh a n d l i n g ，f a v o r a b l es e l e c t i v i t y r e s e a r c ho n t h e s ep r o b e sh a sb e e no n eo ft h em o s ta t t r a c t i v ef i e l d si ng e n o m es t u d y t a k i n g a c c o u n t i n go ft h eh i 曲s p e c i f i c i t ya n ds e l e c t i v i 吼m o l e c u l a tb e a c o n sh a v eb e e n s t l l d i e dw i d e l y h lt l l i sc h a p t e r ，w em a d eab r i e fi n t r o d u c t i o no fm o l e c u l a rb e a c o n s a n dh e m i n i ti n v o l v e dt h eb a s i cp r i n c i p l e sa n dr e l a t i v ea p p l i c a t i o n ，w h i c hp r o v i d e d n l et h e o r e t i c a lp 血c i p l ea n ds e l e c t e dt o p i cb a s i sf o rt h ep 印e r a tl a s t 也ep u r p o s ea n d i r m o v a t i o no ft h ep a p a rw e r ep o i n t e do u t c h a p t e r2s t u d yo nt h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fh e m i na n d p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fan e we l e c t r i c a la c t i v e - i n a c t i v e s w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n ni sw e l lh o w nm a th e m i ni sah i 曲l yh y d r o p h o b i cm o l e c u l e ，w i t hp o o r s o l u b i l i t yi i ln e u t r a la n da m a l i n ea q u e o u sb u 虢r s al a 略en u n l b e ro fs t u d i e sh a v e p r o v e dt h a tt l l ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fa q u e o u sh e m i ns o l u t i o i l sc o u l d c h a n g ei n am a l l i l e ri n1 i i l ew i ma g 铲e g a t i o n i nt h ec a s eo fp r o t o p o 印h 如n ( t h e p o 印h y mm o i e t yi nh e m i l l ) ，m et e n d e n c yt 0a g 莎e g a t i o ni sq u i t ed r a s t i cb e c a u s eo f a b s t r a c t m ea c t d i t i o n a lh y i p h o b i cp r o p e r t i e so ft h ep e r i p h e r a lv i n y lg r o u p s i nt h i sc h a p t e r ， w ep r o v e dh e m i nm o l e c u l a re x i s t sc l e a re l e c t r o c h e m i c a ls i g n a ld i 虢r e n c e sb e 铆e e n t h em o n o m e ra n dd i m e ro fh e m i ni 1 1s o l u t i o n ，t h u s ，i tc a nb eu s e di no u rn e we l e c t r i c a l a c t i v e i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n 1 订e a n t i m e a l lk i n d so fm e t h o d sw e r eu s e dt o c h a r a c t e r i z eo u rn e we l e c t r i c a la c t i v e i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n h l d i c a t i n g t h a tt h eo u rm o l e c u l a rp o s s e s s e de x c e l l e ma _ b i l i 劬w h i c hs h o w e dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n v a l u ei n 也ef i e l do fb i o c h e m i s t 巧 c h a p t e r 3 s t u d y o nt h e a p p l i c a t i o n o fo u rn e wh s m b e l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n p 5 3g e n ei sa ni m p o m u l tt u m o ro n c o g e n e i ti sr 印o r t e dt h a t5 0 h u m a nt u m o r s r e l a t e dt op 5 3g e n em u t a t i o no rl o s s s oi ti sv e 巧i m p o r t a n tt oa n a l y z ea n dd e t e c tp 5 3 g e n e h lt h i sc h a p t e r ，an e w e l e c t r o c h e m i c a la c t i v e - i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n w a ss y n t h e s i z e df i r s t t h i sk i n do fm o l e c u l a rb e a c o nc o u p l e dw i t hh e m i nw a s e l e c t r o c h e m i c a li n a c t i v i 吼b u ta r e rh y b r i d i z e dw i t hc o m p l e m e n t a 巧t a 略e ts e q u e n c e ， e l e c t r o c h e m i s t 巧s i g n a lw a sl a 喀e l ye i 血a n c e d ，t h e n 印p l y i n gt h i sm o l e c u l a rb e a c o ni n m ea n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fp 5 3t a 玛e ta n di t ss n pg e n e t h er c s u l t ss h o w nt h e r e l a t i o n s h i pb e 觚e e nt h ep e a l ( c u 仃e n t sa n d t h eq u a n t i t yo ft a 唱e t t h ef i t t i n ge q u a t i o n i sy = 8 e - 0 8 x + 2 e 0 7 ( xw a st h ec o n c e n 仃a t i o no ft a 略e t ，m ；yw a st h ep e a kc u r r e n t ， a ；r i o 9 8 61 ) ，a l s o ，ad e t e c t i o nl i m i to f3 n m c a nb eo b t a i n e d h s - m bi sa se f j f e c t i v e a sc o n v e n t i o n a lm o l e c u l a rb e a c o ni ns i g n a l i n gt h ep r e s e n c eo fc o m p l e m e n t a r yt a r g e t a n dd i s c r i m i n a t i n gt a 玛e t st h a td i 巧玎b yas i i l g l en u c l e o t i d e t h i sm 0 1 e c u l a rb e a c o ni s f i tf o rq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o na n dt h es i n g l e - b a s em i s m a t c hr e c o 盟i t i o no ft a 略e t k e yw o r d s ： d n a ，e 1 e c 仃o c h e m i s t h e m i n ， m 0 1 e c u l eb e a c o n ， p 5 3 ， e l e c 仃o - a c t i v e i n a c t i v e ，s i n g l e - b a s em i s m a t c h m 目录 目录 第一章：绪论 1 分子信标技术的原理及其应用1 1 1 分子信标的性质与特点l 1 2 分子信标的分类“3 1 3 分子信标的发展1 l 2 卟啉铁的性质及其应用”1 5 2 1 卟啉铁的性质1 5 2 2 卟啉铁的相关应用1 6 3 本论文的目的和意义1 7 参考文献18 第二章：h e m i n 电化学开关行为的探讨和h s m b 电化学活性开关分 子信标的合成研究 1 引言”2 3 2 实验部分2 5 2 1 试剂与仪器2 5 2 2 实验过程2 7 3 结果与讨论2 9 3 1 合成2 9 3 2h s m b 型电化学活性开关分子信标的表征3 5 4 结论“4 1 参考文献4 1 第三章：基于h s m b 型电化学活性开关分子信标的应用研究 目录 1 引。言4 3 2实验部分4 6 2 1 试剂与仪器4 6 2 2 实验过程4 8 3 结果与讨论”4 9 3 1h s m b 电化学活性开关分子信标的设计4 9 3 2h s m b 电化学活性开关分子信标性质表征5 0 3 3 对不同目标序列的检测行为5 3 3 4 热力学行为5 5 3 5 信标开关的可逆性研究5 6 3 6 杂交条件的选择5 7 3 7h s m b 对s n pp 5 3 寡聚核苷酸序列的特异性研究5 8 3 8h s - m b 对p 5 3 特定目标序列的定量检测5 9 4结论6 0 参考文献6 l i 鞋录6 3 致谢6 4 第一章绪论 第一章绪论 1 分子信标技术的原理及其应用 1 1 分子信标的性质与特点 许多新的生物技术的开发，为发展高特异性、高灵敏度的分析检测方法注入 了新的活力，其中利用d n a 分子间的特异性互补配对规律发起来的各种d n a 生 物探针技术，引起了国内外各界生物分析工作者的广泛关注【l 矧。核酸是生物化 学、分子生物学、分子遗传学、生物化学和基因工程研究的重要物质基础。在基 因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高亲和力和高灵敏度的生物分子探 针来进行定性和定量检测j 分子灯塔( m o l e c u l a rb e a c o n ) ，也称作分子信标，它是近几年兴起的利用 核苷酸杂交技术对核酸分子进行检测的新技术。这一技术是由纽约市公共健康研 究协会的t y a g i 和k r 硼e r 【7 】于1 9 9 6 年首次构建的。因为分子灯塔在与核酸分子 互补结合之后荧光分子便能开始发出荧光，故称之为“分子灯塔”。其最初目的 是能在液相中定量测定靶目标的量。自由状态时，分子信标呈现出发卡结构，此 时由于连接其上的荧光基团和猝灭基团靠的很近，荧光信号被猝灭；而当与靶目 标序列结合后，此时分子灯塔的空间结构发生了极大的改变，此时，荧光信号恢 复。 传统的寡核苷酸杂交必须清除未杂交的探针分子，以消除背景影响。利用分 子信标的杂交在没有靶d n a 存在的情况下，荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一 起，不发射荧光。因而背景很低。因此，可以省略清洗探针这一步，而且，随着 扩增的进行，分子信标结合于靶d n a 的比例逐渐增加，发射的荧光逐渐增强，因 此荧光强度与p c r 产物的累加是直接相关的。由于茎环结构很稳定，分子信标与 线性探针相比具有较高的选择能力，可以对只有一个核苷酸差掣8 。1 0 】的靶序列进 行辨别，使其成为研究单核昔酸多态性( s n p ) 的理想工具。 分子信标技术以其操作简单、灵敏度高【l o 12 1 、特异性耐1 3 ，1 4 1 、可对核酸进行 实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在一般的生物学的研究检测中 第一章绪论 有着广泛的应用，而且在疾病基因与诊断等牛物医学基础和临床试验中也充当着 重要的角色1 5 之5 1 。近年来，人们对分予信标的结构作了诸多改进，发展出很多具 有更多特性的新型分子信标。例如，r n a d n a 嵌合型分子信标，p n a 分子信标等。 随着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。 f i gla 咖i c a ls t r u c t l l r eo fm o l e c u l a rb e a c o n 分子信标( f i g1 ) 是具有茎环结构的短寡聚核苷酸序列，包括两个部分： 环部( 1 0 0 p ) 和茎部( s t e m ) 。l 0 0 p 环上的寡聚核苷酸序列约含有2 0 个碱基， 是分子信标的基因识别部分，它可以与目标基因自发地进行杂交结合。茎部是一 段5 7 对互补碱基的发夹结构( h a i r p i n ) 。在分子信标5 端和3 端通过连接 臂( 1 i n k e r ) 分别连接上荧光基团( f l u o r o p h o r e ，一般为四甲基罗丹明、荧光 素等) 和猝灭基团( q u e n c h e r ，一般为4 一二甲基对胺基偶氮苯一苯甲酸，d a b c y l ) 。 八八一，= b 哼e l | 购r d f i g2h y b r i d i z a 6 0 no fm o i e c u l a rb e a c o n 2 + 耕 旦芸 第一章绪论 当分子信标与匹配的靶标分子结合形成双链结构的时候( f i g2 ) ，l o o p 环与 靶分子杂交的部分被打开，同时信标互补区被拉开，导致荧光基团和猝灭基团拉 开，根据f o e r s t e r 理论【2 6 】，中心荧光能量转移效率与俩者距离的6 次方成反比。 杂交后，分子信标的荧光几乎恢复1 0 0 的信号，因此体系荧光信号大大增强， 且所检测到的荧光强度与溶液中的靶目标的量成正比关系。但是当分子信标与靶 分子存在错配的时候，此时不易发生构象改变，凶此就不会产生荧光，从而实现 单碱基突变的实时和特异性检测。分子信标独特的茎一环结构决定了信标技术的 高特异性，可以将完全互补和错配的序列区分开且具有高的灵敏性。茎一环结构 的存在使分子信标存在两个稳定态：当有匹配的目标序列存在时，探针与目标分 子形成双链稳定态。当处于自由态时，其茎部自身匹配形成稳定态；由于分子信 标杂交前后环状区与目标序列的双链结构之间存在热力学平衡关系，因此它的杂 交特异性明显高于常规的线状探针。如果调节分子信标序列的长度恰到好处，就 可以使其与完全互补目标物杂交后，形成的双链比分子信标自身环茎结构还要稳 定。但是如果目标序列中有错配碱基存在时，信标与目标序列双链结构的稳定性 就会不及信标自身的茎环结构，此时信标就不会被打开，就不会产生任何信号值 的变化。这样，分子信标就成为一个灵敏的“分子开关”，只在完全互补的目标 序列存在时“发光 ，在错配目标序列存在时则不“发光”，靶目标即使只有一个 碱基的改变、缺失、插入【2 7 。2 9 】，分子信标都能检测出来。其灵敏度和特异性可以 根据不同的应用目的通过调整g c 含量来达到优化，使茎环与靶目标结合的稳定 性大于信标本身的稳定性。 1 2 分子信标的分类 按照已有的关于分子信标检测技术的相关报道，分子信标按检测手段和方法 可大致分为荧光法，电化学法两大类。前者已经步入成熟阶段，而后者目前正处 于起步阶段。 1 2 1 荧光分子信标 第一章绪论 1 2 1 1 基于荧光基团一淬灭基团对及其衍生形式 通常荧光分子信标都是修饰一个单一的发光基团。在均相体系中，通过杂交 后产生的荧光信号的变化，一种分子信标只可以检测一种靶目标序列。为了实现 在一个体系中同时能够检测多种靶目标序列的目的，可以将不同的分子信标修饰 不同的荧光基团，比如，t y a g i 【3 0 】等利用四种不同的分子信标进行等位基因检测。 这四个分予信标环状部分同一位置的一个碱基不同，其所连接的荧光基团则分别 具有不同的激发和发射波长。将四种分子信标等量混合在四个试管中，然后分别 放入靶目标序列，这个时候只有与靶目标完全匹配的分子信标才能发生特异性结 合，从而发射出荧光，但是用这种方法，需要根据具体的荧光基团用不同波长的 激发源和在不同的波长处采集对应的荧光信号。 为了解决这个问题，简单地采用单一的激发光源，t y a g i 等还设计了一种称 为荧光波长转移型分子信标。如下图( f i g3 ) 所示： 墨一 艄铆 f i g3w a v e l e n g t h s h i 衔n gm o i e c u l a rb e a c o n 在这种类型的分子信标中，吸收激发光和将吸收的能量以荧光发射出去的是 两个不同的荧光基团，即：荧光吸收基团和荧光发射基团。在单一激发光源下， 荧光发射基团在可见光谱区发射出不同波长的的荧光。采用d a b c y l 猝灭基团连 接在探针的3 端，荧光素作为荧光吸收基团连接在5 端中间响应位置，然后 再在其末端连接t e x a s r e d 等荧光发射基团。机理如下：信标两端荧光基团和猝 灭基团互相紧靠，彼此共用电子，此时形成暂时无荧光复合体，此复合体会将吸 收的荧光以热能的形式释放。在此复合体中，能量从荧光吸收分子传递到猝灭基 4 第一章绪论 团的速度远远高于由于f i r t ( 荧光共振能量转移) 而引起的能量传输速度。在 未加入目标分子前，分子灯塔保持发卡结构，荧光吸收分子吸收的能量经由猝灭 基团以热能的形式发射出去。但是当加入目标序列后，荧光吸收基团与猝灭基团 分开，它所吸收的能量被传递给荧光发射基团，然后后者再将能量以特征波长发 射出去。这样可以通过选择不同波长的荧光发射基团使分子信标按设计的要求发 出不同颜色的荧光。同时，这种新型的分子信标具有较大的s t o c k s 位移，解决 了传统分子信标中激发波长和发射波长差别较小，从而使一部分激发光通过反射 和散射到达检测器，影响灵敏度的问题。 1 2 1 2 基于荧光供体一荧光受体对 传统的分子灯塔可能由于猝灭反应的不够完全而给出假阳性的结果。为了 克服这个缺陷，有学者提出了“荧光供体一荧光受体对 的概念 3 l 】。 “荧光供体一荧光受体对 这种模式类型由两个荧光基团组成。当灯塔处于 茎环结构时，受体( a c c e p t o r ) 通过荧光共振能量转移( f r e t ) 吸收了来自供体 的荧光，于是此时只有受体的荧光是可见的。当信标与目标序列杂交后，两个荧 光基团分开，f r e t 效应因为距离作用变得极弱，此时则只能观察到供体的荧光， 但是，如果供体为非荧光基团，那么分子信标则不表现出荧光。m u s u n d i 吲等研 究人员在信标末端分别标记上荧光供体c y 5 和受体c y 5 5 ，设计出一种可用在 等位基因特异性鉴别的引物探针( 如图f i g4 ) 。 a b h ea 凹甜e 7 铀甜埔t t ! 盟咝垒! 鲢丛鱼璺班肼姒篮 c a g t c c a t g c 铿毪够t g k c c 葶 h c c t a g c c c t t c c t g gg g t g 百c “柏屺g g l 埘。 芦娜8 e 删岛函d 。榭融砌l 、r 埘l如b刚 f i g4d o n o i - a c c e p t o rm o l e c u i a rb e a c o n 一2 c _ 琵一 第一章绪论 = 盈、= 扫= 口础匝工匹= 工口，口工正 、盎、一：= = 工翻互【i 工e 匝工：= 工口】r 口z 口= ，、 i o e r r e c t i o n l i ，j豳1 嘲y 矿矿、一搦凰 o 静a 蝴s ， f i g5 i i l u s t r a t i o no ft h el d r s pf r e ta s s a yi nw h i c ht w oa l l e i e s p e c i f i cp r i m e r sa 代 l