（分析化学专业论文）植物释放的挥发性抗病化学信号物质研究.pdf

复旦大学硕士学位论文 p i 6 6 上 摘要 摘要 l l 植物受到病毒或昆虫侵害时，会产生一系列次生代谢物质以抵御疾病或病毒的 侵袭植物在抗病过程中会产生挥发性化学物质，这些化合物通过空气传播到临近 的植株，临近植株接收到有病毒或昆虫侵害的信息便被诱导产生系统抗性；另一方 面，植物还能探测到入侵昆虫类型，并释放特定气味的化合物吸引昆虫天敌研究 植物间传递的挥发性化学物质，鉴定其组成和结构类型，验证其诱导抗性效果，将 l 为开发全新的生态制剂、防治植物的病虫害开辟新的途径j 本研究选择烟草、番茄 幼苗作为实验对象，对烟草花叶病毒( t m v ) 接种后的植株所释放的挥发性化学 信号物质进行了研究，取得了预期的结果 论文第一章综述了近期植物抗病信号物质的研究进展，重点评述了植物受病虫 侵袭时体内和体外所产生的多种信号物质，同时也总结了病原诱导植物产生挥发信 号方面的研究结果，探讨比较了各种分析检测化学信号物质的方法 论文第二章着重研究了烟草幼苗接种t m v 病毒后释放的挥发性抗病信号物质 牌对分析对象的特点和分析要求，选择t e n a xt a 作为吸附剂，建立了吸附一热解吸 l 的分析方法，测定了方法的可靠性和重复性选择并培育了抗性烟草品种，对烟草 幼苗感染烟草花叶病毒前后植株所产生的挥发物进行了捕集并用g c m s 分析，分 离鉴定了六种与抗病过程密切相关的化合物，除了已报道的水杨酸甲酯( m e s a ) 外，还有尼古丁、新植二烯等化合物均与抗病相关，这些化合物尚未见报道对m e s a 进行定量研究，观察到其挥发量从正常状态下 1n g 增加到接种后3 0 n g 以上的水 平，并维持数天同时，用m e s a 对健康烟草幼苗进行了诱导实验，发现诱导处理 的烟草m e s a 的释放量平均增大了4 倍；接种后产生的枯班平均直径比对比植株 减小了6 1 ，从而证明了m e s a 是烟草释放的种重要的参与抗病反应的挥发性 i 信号物质1 ， 。 论文第三章着重研究了抗性番茄品种释放的挥发性抗病信号物质憎次建立了 l 叶片组织采样g c - m s 分析新方法，测定了植株不同部位的叶片组织中挥发物的含 量本方法将植物叶片组织直接放入色谱汽化室，迅速升温使挥发性化合物进入色 复旦大学硕士学位论文摘要 谱柱头富集，然后进行程序升温分离以及质谱鉴定应用该方法，首次对番茄幼苗 感染烟草花叶病毒前后植物叶片中的挥发组分进行了分析，发现了7 种与番茄抗病 过程密切相关的化合物，其中也包括m e s a 研究同时观察到，番茄植株不同部位 对病毒侵染反应的时问不同，产生信号物质的量不同接种处附近的叶片组织首先 作出反应，而其他部位则滞后数小时不等使用浓度约2 0 0 ug ，l 的气态m e s a 对 健康番茄幼苗进行诱导抗性实验，发现诱导后番茄从外观上表现出抗病时的特征， 其植物组织释放的m e s a 增加了2 3 倍，而且其他几种抗病相关化合物的释放量也 有所增加，从而证明m e s a 很可能是番茄抗病反应释放的信号物质而且，番茄对 m e s a 的物质响应更加灵敏，诱导所产生的m e s a 量值比烟草要高上述诱导实验 结果也属首次报道 关键词：诱导抗茬：7 植物挥发喜磊病信号，烟妄番茄，t m 妒：g c m 。s 2 复旦大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t p l a n t sc o u l dp r o d u c e s i g n a lc h e m i c a l sw h i l et h e yw e r ea t t a c k e db ys o m ep a t h o g e n ， f u n g u sa n de v e nh e r b i v o r e s r e c e n tr e s e a r c hw o r k sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e s ea i r b o r n e s i g n a lc h e m i c a l sc o u l dt r a n s f e ra m o n gp l a n t st oi n d u c es y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e m o r e o v e r , p l a n tc o u l da l s oi d e n t i f yt h et y p eo fi n f e c t i o n sa n dc o u l dr e l e a s ed i f f e r e n t c h e m i c a l sa s s i g n a l l i n g e v e nt h e yw e r ea b l et oa t t r a c te n e m i e so ft h eh e r b i v o r e st o e l i m i n a t et h ei n f e c t i o n t h e r e f o r e ，i ti ss i g n i f i c a n tt oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h e s es i g n a l l i n g c h e m i c a l s i tw i l lb ev e r yi m p o r t a n tt od e v e l o pn e w t y p eo fp e s t i c i d e st h a ta r eb e a e rf o r e n v i r o n m e n ta n d e c o l o g y s y s t e m t h i st h e s i sa i m sa t t r a p p i n g a n d i s o l a t i n gs i g n a l c h e m i c a l sr e l e a s e db yt o b a c c oa n dt o m a t os e e d l i n g sa n df u r t h e ra n a l y z e db y u s i n gg c - m s i nt h ef i r s ts e c t i o no ft h i st h e s i s ，r e s e a r c hw o r k sc o n c e r n i n gt h e p l a n ts i g n a l l i n g c h e m i c a l sw e r er e v i e w e d t h er e s u l t so f e x t e n s i v e l ys t u d i e de n d o g e n e o u sp l a n ts i g n a l s a n dv o l a t i l e s i g n a l si n d u c e db yh e r b i v o r e sa r ed e s c r i b e d m e a n w h i l e ，v o l a t i l es i g n a l s i n d u c e d b y v i r u si n f e c t i o nw e r ea l s od i s c u s s e dv a r i o u s a n a l y t i c a l m e t h o d sf o r m e a s u r e m e n t o f p l a n t v o l a t i l ea r es u m m a r i z e d i nt h es e c o n ds e c t i o n ，a i r b o r n es i g n a lc h e m i c a l st r a n s f e r r i n ga m o n gt o b a c c op l a n t s w e r es t u d i e dt e n a xt aw a sf i n a l l ys e l e c t e da s a d s o r p t i o ns o r b e n t t r a p p i n g - t h e r m a l - d e s o r p t i o nd e v i c ew a sd e s i g n e da n dg c - m sa n a l y t i c a lm e t h o dw a sd e v e l o p e dv o l a t i l e s e m i t t e df r o mt o b a c c os e e d l i n gw e r ef i r s tt r a p p e da r e ri n o c u l a t i o nb yt m v a n dt h e r m a l l y d e s o r b e di n t og c m ss y s t e mf o ra n a l y s i s m o r et h a n6c o m p o u n d si n c l u d i n gn i c o t i n e ， m e t h y ls a l i c y l a t e ，n e o p h y t a d i e n ew e r e i s o l a t e da n di d e n t i f i e da sp o s s i b l es i g n a lc h e m i c a l s r e l e a s e da m o u n to fm e s aw a sq u a n t i t a t i v e l ys t u d i e da f t e ri n o c u l a t i o n , i t se m i t t i n g a m o u n t si n c r e a s e df r o ml e s st h a nl n gu pt o3 0n g p l a n t 3 ha n dm a i n t a i n e dah i g hl e v e l f o rs e v e r a ld a y s g a s e o u sm e s aw a s a p p l i e dt oi n d u c eh e a l t h yt o b a c c op l a n t st op r o d u c e d i s e a s er e s i s t a n c ei tw a so b s e r v e dt h a tm e s ar e l e a s e df r o mi n d u c e dp l a n t sw a s4 - f o l d h i g h e rt h a n t h o s ec o n t r o l l e dg r o u pi na v e r a g e a l s ot h e a v e r a g el e s i o nd i a m e t e r d e c r e a s e d b y6 1 a f t e r7 2 ho f i n o c u l a t i o n i th a sp r o v e nt h a tm e s a p r o b a b l yi sav o l a t i l es i g n a l c h e m i c a lt r a n s f e r r i n gb e t w e e nt o b a c c o s 3 复旦大学硕士学位论文a b s t r a c t i nt h et h i r ds e c t i o no ft h i st h e s i s ，an o v e l a p p r o a c hw a sd e v e l o p e df o rt h ef i r s tt i m e l e a fs l i c et i s s u ew a st a k e na n d i n s t a n t l y h e a t e di n e v a p o r a t i o n c h a m b e ro fg a s c h r o m a t o g r a p h t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t sw e r ea c c u m u l a t e do nh e a do ft h eg cc o l u m n d u r i n gt h eh e a t i n gp r o c e s s ，t h e na n a l y z e db yt e m p e r a t u r e p r o g r a m m i n gs e p a r a t i o na n d m a s ss p e c t r o m e t r yi d e n t i f i c a t i o nt h i sn o v e lm e t h o da f f o r d st o a n a l y s i s f o rd i f f e r e n t p a a so fl e a v e si no n es e e d l i n gt op r o v i d em o r ei n f o r m a t i o nt h a nt h ew h o l ea i rs a m p l i n g m e t h o d v o l a t i l ec h e m i c a ls t u d i e sf o rt o m a t ol e a ft i s s u ea r e ri n o c u l a t i o nw i t ht m v , i tw a s o b s e r v e dt h a tm o r et h a n7c o m p o u n d sw e r e c l o s e l yr e l i e dt ot o m a t os i g n a l l i n ga g a i n s t v i r u si n f e c t i o n m e a n w h i l e ，i tw a sf o u n dd i f f e r e n t p a r t so f t h ep l a n tp r o d u c ed i f f e r e n t a m o u n t so fv o l a t i l e sa f t e ri n o c u l a t i o n t h et i s s u en e a rt h ei n o c u l a t i o ns i t e sr e s p o n d st o t h ei n f e c t i o nm o r e q u i c k l yt h a no t h e rs i t e s ，a n dm o r ev o l a t i l e sw e r ep r o d u c e di nt h eu p p e r l e a v e st h a nt h el o w e rp a r to n e s v a p o rm e s aa p p l i e dt ot o m a t os e e d l i n gc o u l di n d u c e t o m a t ot op r o d u c e2 3 - f o l dm o r em e s at h a nt h o s ec o n t r o l l e dg r o u pi na v e r a g ei ti sa l s o p r o v e nt h a tm e s a i sac a n d i d a t ep l a n ts i g n a lc h e m i c a lp a r t i c i p a t i n gi nt h ei n d u c t i o no f t o m a t or e s i s t a n c e k e y w o r d s ：i n d u c e dr e s i s t a n c e ，p l a n tv o l a t i l es i g n a lc h e m i c a l s ，t o b a c c o ，t o m a t o ，t m v , g c m s 4 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 第一节引言 研究早已发现，动物在受到天敌或疾病侵害时会产生动物信息素，以提高 自身免疫能力并对同类警示。类似的现象在植物界己开始被研究者发现。1 9 世 纪末开始，人们发现植物在受到环境胁迫或病原侵害时会累积一些低分子量的 化合物，这些化合物被命名为植物抗毒素( p h y t o a l e x i n s ) ，并认为植物产生抗 性的作用是限制在局部组织的 1 】后来在烟草接种感染烟草花叶病毒( t o b a c c o m o s a i cv i r u s ，t m 、r ) 的实验中发现，植物的抗病能力作用于整个植物体系而非 某个局部，并提出了系统抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) 这一概 念，并相应进行了一系列研究，先后在6 个植物品种，2 0 个株系中发现了类似现 象【3 基于对植物产生系统抗性的研究，发现了一些与植物抵抗病害虫害相关的小 分子化合物这些化合物在植物体内不同组织间，或不同植物个体之间传播，使 未受病虫侵害的植物组织或植物个体也产生对病虫的抵抗性，因而被认为是一些 与植物抵抗病虫相关的信号物质植物信号物质按传导途径的不同，可以分为两 类：一类是在植物体内传导的化合物，称为体内信号物质：一类是由植物释放出 来的具有挥发性的化合物，它们能在不同植株间传导抗病信息，称为挥发性信号 物质通过这两类信号物质的传导，能诱导整个植物系统产生抗性，提高对病虫 害的抵御能力 植物体内传导的信号物质研究的较多，通常涉及的化合物有水杨酸 ( s a l i c y l a t ea c i d ，s a ) ，茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) ，茉莉酸甲酯( m e t h y l j a s m o n a t e ，m e j a ) 和乙烯等h ，他们的传导途径、代谢过程以及诱导植物产生抗 病性的效果已初步明确 对于植株间传递的抗病信号的研究主要集中在植物抵御植食性害虫侵害时 的防御作用中，已经报道了一些萜烯类化合物在植物防御虫害中的作用晦】，他们 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 产生的过程，诱导植物的机理己被广泛研究近期发现：植物在受到病毒、细菌、 真菌等病原感染时，也会产生一些挥发性的信号物质，他们通过外源诱导健康植 株，使其对后继病毒的侵害能产生更高的抵抗性哺，” 对植物信号的研究需要借助分析化学的手段进行现代分析化学的发展，新 的分析方法和分析仪器的使用，为低浓度、组成复杂的植物信号的分析提供了强 有力的工具对样品进行富集或预处理后，使用色谱分离技术并联用各种检测手 段，可以成功地对植物信号进行分离鉴定 对于植物在抵抗病原时产生的挥发性抗病信号物质的研究是一个新的领域， 国际上报道很少，国内尚未开展类似工作，因而进一步开展相关研究，测定信号 物质产生的过程，确定其结构组成，以及生物诱导抗性效果，将为开发新型无污 染、高效率的生态农药奠定物质基础 1 系统抗性 第二节植物的抗病反应及相关概念 早期研究者发现植物受到病虫侵害时会在受害处附近累积一些低分子的抗 原化合物( a n t i p a t h o g e n ) ，称之为植物抗毒素，并提出植物的抗病机理只限制在 局部组织而非整个系统( 1 但随着研究的进展，人们发现植物抗毒素的产生只是 植物抗病一系列反应中的一个步骤 最早发现植物抗病作用是在整个系统而非局部的现象是在烟草的抗病反应 中当用蓝霉病毒( p w e o n o s p o r at a b a c i n a ) 感染烟草基部组织时，会引起上端新 叶对蓝霉病的抗性暗 植株感病三个星期后的抗病性比没有产生抗病性植株的发 病情况减轻了9 0 在这个体系中，植物产生的抗病性是长期有效的，尤其是在植 物生长的后期r o s s 等( 9 1 发现一部分叶片感染t m v 可以使同一植株的其他叶片对 此病毒的后继侵染产生抗性，相应的现象是接种发病后的枯班数量减少，平均直 径减小k u c “们及其同事在对豆科和黄瓜n 1 1 的研究中也发现了类似的现象研究 者因而提出了系统抗性的概念，认为植物对病虫产生的抗性是作用于整个植物系 2 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 统而非局部组织s a r 的一些主要生物特性如下： 植物被病原或生物试剂诱导产生病变，如形成枯班 被诱导的植株发病时间推迟数天 未被侵染的植物组织也表现出对病原的抵抗性 诱导后的植物叶片在发病时产生的枯班数量及直径减少，病原繁殖力降低 诱导产生的抗性是长期有效的，通常为几个星期甚至几个月 抗性是广普的，并不限定于某一种病毒 s a r 的信号是可传导或组织嫁接的 到目前为止，s a r 已在6 个植物种类，2 0 个株系中显示，并且有些植物的系统 抗性对昆虫的侵害同样有效“ 2 过敏反应( h y p e r s n e s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 过敏反应是植物抵抗病原的一个重要反应，它是植物识别病原侵染后引发一 系列反应，使病毒限制在最初的感染区域而不会进一步向其他地方扩散h r 通常 引起局部组织的细胞坏死，产生枯班( 1 e s i o n ) ，它是病毒引发因子( v i r a l e li c i t o r ) 与植物抗病基因( a n t i p a t h o g e ng e n e ) 相互作用的结果强的病毒引发 因子能被植物很快识别并产生抗性反应，病原立刻被限制在最初的感染区域：弱 的引发因子引起h r 教慢，在被限制前已开始扩散研究最多的烟草抗t 吖病毒的 基因是n 一，n 一基因，n 一基因对所有烟草病毒都能产生抗性，而n ，- 基因只对一些 病毒及病毒变异体产生抗性 1 3 抗病蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n ，p r ) 抗病蛋白是一系列在植物抗病反应过程中生成的蛋白p r i 系列蛋白与植 物系统抗性的产生和调节植物抗病过程的s a 的累积密切相关“，”1 检测植物体 内是否有p r 蛋白产生是确定植物是否产生系统抗性的一个重要依据 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 4 植物信号物质( p l a n ts i g n a l ) 植物远离病虫侵害部位的组织以及附近的未受侵害的健康植株是如何获取 抗病信息并产生系统抗性的呢? 不象动物具有循环系统，可以把大量抗病化合 物、蛋白质和细胞运送到体内各组织和细胞中，或通过挥发动物信息素警示同类： 植物是通过传导低浓度，小分子的带有抗病信息的化合物来诱导植物产生s a r 的， 这一类化合物叫做植物抗病化学信号物质“在植物体内传导的信号物质叫体 内信号，它不具有挥发性，通过在植物体内传导使植物各个部位组织都表现出对 后继病原或昆虫侵害的抵抗性在植株间传导的挥发性信号物质，是从被病虫侵 窖的植株叶片组织中挥发出来的，通过空气传播到临近健康植株，诱导其产生s a r 抵御侵害 作为能诱导产生s a r 过程中的信号物质，必须满足以下标准：由植物合成， 能系统地提高植物对于后继病原和昆虫的侵害，具有一定的产生量和持续的产 生时间，能在植物的不同组织间或不同植株间传导，能激发pr 蛋白产生 5 研究植物抗病信号的意义 植物产生s a r 以抵御进一步的病虫侵害，是通过植物抗病信号的传导来完成 的这为如何提高农业及园艺种植中作物的病虫防治提供了一个新的途径传统 的农药及杀虫剂在喷洒之后直接作用于害虫及病菌，通过杀死病虫的方法达到防 治目的：而对植物使用抗病信号物质时，可以系统地提高植物自身的抗病能力，以 达到防治效果，这与传统农药的作用机制完全不同 传统的农药在使用过程中会造成一定的环境污染，并且杀虫效率低，对动物 和人也有一定的毒性利用植物产生的微量诱导抗性的信号物质作为新型生态农 药，对人和微生物的毒性i t , j , 或没有毒性，不会引起环境污染，而且一种抗性信号 可以诱导植物对真菌、细菌、病毒等多种病原产生抗性，可以达到一药兼防多 病的效果。因此，分离鉴定植株产生的挥发性抗病信号物质，将为开发新型的 无污染、高效率的生态农药奠定物质基础，在生产应用上有广泛的前景 1 7 “ 4 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 第三节 植物抗病信号物质的研究进展 1 引言 植物抗病信号是一个新的研究领域，属于植物病理学和分析化学相交叉的 研究方向。该类研究在国际上仍处于起步阶段，国内未见同类报道。其中植物 体内信号和植物抵抗虫害时的体外挥发性信号物质研究教多，而植物抵抗病原 侵害的体外信号只有两篇相关报道 2 植物体内信号的相关研究 植物在受到病虫侵害时体内产生的反应分三个步骤：第一步是植物对入侵 病虫进行识别，激活植物防御体系；第二步是在病毒或昆虫侵害处产生抗性反 应，阻止病毒扩散或昆虫继续取食；第三步是抗病信号产生，传导到植物各个 组织产生系统抗性，诱导p r 蛋白产生“ 在植物体内传导的是一些小分子的，不具挥发性的化合物主要研究的有水 杨酸( s a ) 、水杨酸甲酯( m e s a ) 、茉莉酸( j a ) 、茉莉酸甲酯( m e j a ) 、龙胆酸 ( g e n t i s t i ca c i d ，g a ，2 ，5 - 二羟基苯甲酸) 等 2 1s a s a 是一种小分子酚类化合物一邻羟基苯甲酸它是一种广泛研究并被公认的 调节植物抗病过程的体内信号物质水杨酸广泛存在于植物界中，在3 4 种主要农 作物的叶片和繁殖器官中都有s a ，在健康植株中含量很低，但在受病原侵染的植 物组织中含量很高呛 在烟草抗病实验中发现，内源s a 在烟草( x a n t h i n c ，n n ) 接种t m v 的叶片处 增加了至少2 0 倍，且s a 的累积与枯班的形成同步进行在幼苗上端未接种叶上 s a 的水平也增加了5 倍，假接种或感病烟草品种中没有s a 的累积现象发生嘶1 烟草在体内累积s a 的同时伴随着在接种叶和未接种叶中p r 一1 蛋白的生成，s a 在发生枯班的周围组织中含量最高，累积的p r - 1 蛋白最多，对后继病毒的抵抗能 力最强y a l p a n i 2 ”等人用不同浓度的t m v 接种烟草叶片，叶片中的s a 水平与 枯班数都有变化如图l ，s a 浓度水平与h r 产生的枯班数都与感染的1 m v 浓度成 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 比例，并且在温度升高到3 2 。c 时，能阻止烟草h r 的发生以及s a 的累积 o0 2 12 510 t m v ( “g l l e a f ) 图1 不同浓度t m v 对烟草体内s a 累积水平和发生h r 反应产生枯班数的影响 s a 在抗病反应中的作用为：1 诱导植物产生并累积抗病相关蛋白以产生抗 病性，如外源应用s a 可诱导烟草、黄瓜、马铃薯、菜豆、豇豆、水稻和拟南芥 等多种植物累积p r s 并产生对真菌、细菌、病毒等多种病原的抗性阻圳：2 表 现抗病反应的植物体内累积s a ，且这种内源s a 的累积先于p r 基因的表达和抗 病性的产生 6 一；叱。高lf)鼍u日o”u11日价 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 s a 在体内的合成代谢途径现已基本明确，如图2 瞄l ， 苯丙氨酸 反式肉桂酸 图2 s a 在植物体内的代谢过程 c 0 0 h 水杨酸葡糖苷 s a 是通过苯丙烷类代谢途径合成的，催化生成s a 的关键酶是苯甲酸一2 一羟 化酶( b a 2 h ) 在烟草中，s a 主要通过水杨酸葡糖基转移酶( g t a s e ) 转化为水杨酸 葡糖苷( s a g ) ，还可形成大量的m e s a 而m e s a 被认为很可能是一种信号分子在烟 草抗病性中起重要作用2 ” 由于水杨酸在植物抗病过程中的累积现象、传导方式以及诱导植物产生抗 病性的效果已被广泛研究确认，因而可以把植物体内是否累积了数倍于健康状态 下的s a 作为植物是否诱导产生抗性的依据 2 2 非挥发性的内源m e s a 如图2 ，植物产生的m e s a 是由s a 衍生转化而来，它分为两种途径传播：一 部分在体内传导作为体内抗病信号，一部分从植物叶片挥发出来在植株间传导作 为体外挥发信号2 “ m i r j a n a 等人测定了烟草植物组织中m e s a 的含量，发现烟草感染t m v 后，伴 随着s a 含量的增加，m e s a 的含量也迅速增加，在h r 发生后，m e s a 开始在植物 组织中被检测到，随后达到最高值3 8 6 n g g ( 鲜重) 的水平，并在感染病毒后4 8 9 6 h 内保持不变，1 4 4 h 后又重新降至低于检测限水平当烟草在3 2 。c 培养时，可 7 o 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 以阻止h r 发生，温度降低到常温1 2 h 后，m e s a 迅速增加到2 3 1 8 n g g 的水平转 基因烟草s a h g 不累计s a ，也未检测到m e s a 幽1 2 3 茉莉酸与茉莉酸甲酯 j a 与m e j a 是在植物抵抗病虫及物理损伤时参与调控抗性的化合物j a 在机 械损伤时参与的调控作用已有许多报道研究发现，当植物造成机械损伤时，在伤 口附近j a 能迅速累计并引起一系列相关损伤抗性基因的产生1 同时，烟草在 感染病毒( p s e u d o r n o n a ss y r i n g a ep v p h a s e o l i c o l a ) 发生h r 后3 6 h 内，j a 含量也迅速增加，这种累积先于植物细胞坏死和蛋白损失训 m e j a 由j a 转化而来，在植物体内或植株间传递并诱导抗性外源使用气态 m e j a 诱导植物，可使植物产生类似于昆虫取食或机械损伤诱导的抗性反应用 l o n 的气态m e j a 诱导番茄植株，可使植株叶片中产生蛋白抑制剂i 和i i ，阻止 昆虫的进一步取食m 1 2 4s a 与j a 的相互抑制作用 j a 与s a 都被认为是烟草抵抗病虫时调控抗性的信号物质实验发现，烟草 接种t m v 后在体内累积的s a 会减轻由机械损伤造成的j a 的累积和相关尼古丁 类产物的生成，但这种抑制作用是在植株体内进行而不能在植株间进行口“在番 茄抗病实验中也发现了类似现象番茄被p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o 感 染时产生的s a 衍生物会减轻由j a 调节的对害虫的抗性，而用j a 处理的番茄也 会减少s a 调节的抗病相关蛋白的表达，它们之问是种相互抑制的过程协“ 2 5 龙胆酸( g a ) g a 是最新被发现的与植物抗病相关的体内信号当番茄植株( l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u mc v r u t g e r s ) 被番茄花叶病毒( t o m a t om o s a i cv i r u s ) 感染后，植物 叶片中游离的g a 和g a 总含量可以增加1 5 0 倍，健康叶片中的苯甲酸( b a ) 和s a 可以在发病过程中很快地转变成g a 外源应用g a 可以诱导番茄植株产生抗病蛋 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 - 白p 2 。、p 。p 。，说明g a 具有抗病信号的特征b 5 3 植株间传递的挥发性信号物质的研究 对于在植株间传递的挥发性信号的研究是一个新的领域植物在受到病毒或 昆虫侵害时会释放一些挥发物，这些化合物通过空气传播到周围临近植株，诱导 它们产生抗性其中研究植物抵抗虫害的体外信号作用及机理较多，而植物抵抗 病原侵害的研究尚处于起步阶段 3 1 虫害诱导植物产生的挥发性信号物质 植物遇到害虫侵害时会产生一系列反应抵御虫害，包括：1 ) 产生能引起昆虫 忌避或抑制昆虫取食的物质，阻止昆虫继续取食：2 ) 产生某些物质使昆虫中毒死 亡，使植物避免蒙受更大的损害：3 ) 产生某些挥发性物质引诱致害昆虫天敌 3 7 ， 植食性昆虫的天敌搜寻猎物时，主要依靠带有相关信息的信息素 ( i n f o c h e m i c a l s ) 当昆虫取食时，植物会释放大量挥发性物质以吸引天敌 3 9 4 0 j ， 同时植物还可以释放相应的化合物阻止昆虫产卵，并吸引昆虫天敌取食虫卵“ 昆虫在取食植物时会造成机械损伤单纯的机械损伤也能使植物释放出一些 次生代谢物质，其主要成分为己醛、己醇之类的脂肪酸衍生物，它们能引诱植食 性昆虫的天敌，但这种引诱作用在损伤形成后就很快消退了“而植食性昆虫的 取食活动对植物造成的损伤，不仅能诱导植物改变其挥发性物质的组成相，增强 对天敌昆虫的引诱作用，而且这种诱导出来的新的组成相能在损伤后持续相当长 的时间，诱导产物以萜类，吲哚为常见h “ 虫害诱导植物产生的挥发信号有以下特点： 1 ) 昆虫危害是植物产生挥发信号的必要条件 只有昆虫侵害诱导植物产生的挥发信号才具有生物信号的特性植食性昆虫 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 的天敌能够区分受害植株与未受害植株的气味，体现这种差异的挥发性物质来源 于被侵害的植株，而不是致害昆虫本身“例如在金甲豆一棉红蜘蛛或苹果红蜘 蛛( p a n o n y c h u su l m i ) 一智利小植绥蛹h 5 ，”3 ：玉米( z e am a y s ) 一甜菜夜蛾 ( s p o d o p t e r ae x i g u a ) 一缘腹绒茧蜂( c o t e s i am a r g i n i v e n t r i s ) “1 ：卷心菜 ( b r a s s i ao l e r a c e ac a p i t a t a ) 一大菜粉蝶( p i e r i sb r a s s i c a r e ) 或菜粉蝶的幼虫 一菜粉蝶绒茧蜂( c g l o m e r a t a ) 或微红绒茧蜂h 9 “1 等的研究中都可以证实 2 ) 信号的主要成分通常是一些萜类化合物 在昆虫侵害植物的研究中，萜类化合物是常见于报道的挥发信号的主要成分 机械损伤或没有被害虫侵害的植株一般不产生或只产生很少量的萜类物质砧蚓： 有两种单萜( e ) 一4 ，8 - 二甲基一1 ，3 ，7 - 壬三烯和4 ，8 ，1 2 一三甲基一l ，3 ( e ) ，7 ( e ) ，1 1 一 十三烯存在于许多植物与昆虫的相互作用中，被认为是植食性昆虫诱导的植物挥 发性信号盼，还有三种萜类物质一石竹烯( c a r y o p h y l l e u e ) 、水芹烯 ( p h e l l a n d r e n e ) 和薇草烯( h u m u l e n e ) 研“9 “6 幻也被认为在引诱昆虫天敌 时有重要作用 3 ) 产生挥发性信号物质是植物对害虫为害的整体反应 植物被昆虫侵害时，不仅受伤部位产生挥发信号，没有被侵害的叶片组织也 产生这样的挥发物，并引诱害虫的天敌53 ，矧，说明植食性昆虫取食后，整株植物都 做出了反应 6 “ 4 ) 植物释放挥发信号具有滞后性 在对玉米和棉花的( g o s s y p i u mh i r s u t u m ) 的研究中发现嵋“，被植食性昆虫 取食危害后，隔夜释放的物质在种类和数量上都明显多于刚刚受损害时的挥发物 同时发现：损伤的早期主要释放大量的脂肪氧合酶衍生的挥发性化合物( 如( z ) 一 3 一己醛，( z ) 一3 一己烯基乙酸) 和萜烯类碳氢化合物( 如a 一蒎烯、香叶烯、石竹烯) ： 随着为害的继续，早期阶段释放的很少的其它一些萜类物质开始增多，逐渐从早 期的闭环和开环式萜类占优势转变成另一类萜类为主要成分，如( e ) 一b 一罗勒 1 0 复旦大学硕士学位论文第章文献综述 烯、里那醇、( e ) 一4 ，8 - 二甲基一l ，3 ，7 - 壬三烯、( e ) 一1 3 一法尼烯、( e ，e ) 一4 ，8 ，1 2 一十三烯 5 ) 信号的释放具有时间规律 l o u g h r i n ”5 1 等发现甜菜夜蛾取食棉花后，释放的气味表现出明显的规律性 受到侵害的第二天早晨，被诱导产生的萜类物质( e ) 一b 一罗勒烯和( e ) 一4 ，8 - 二甲基一l ，3 ，7 - 壬三烯开始增多，下午达到高峰，比开始释放时提高了十倍，晚 上又减小了，第三天再次上升，晚上再次下降 虫害诱导植物产生挥发性物质的组成和含量受到很多因素的影响，其中影响 最大的是植物的种类t a k a b a y a s h i 6 6 1 分析了4 种植物( 金甲豆、黄瓜、苹果、 西红柿) 被棉红蜘蛛侵害产生的挥发性物质，发现苹果和西红柿释放的挥发信号 非常简单，苹果主要放出( 3 e ) 一4 ，8 一二甲基一l ，3 ，7 一壬三烯和少量的( e ) 一b 一罗 勒烯；西红柿只放出种成分，即m e s a 相对于植物种类对挥发信号的影响来说， 不同种的植食性害虫使植物释放的挥发信号差异较小，如红蜘蛛( t u r t i c a e ) 和 苹果红蜘蛛( p u l m i ) 分别诱导苹果树s r e d 品系产生的挥发信号中都含有4 ，8 一 二甲基一l ，3 ，7 - 壬三烯，只是含量不同，前者诱导含量为4 9 4 ，后者为8 5 旧3 许多成分直接作用于致害昆虫，如柠烯、蒎烯、香叶烯等对昆虫可引起忌避 或抗生作用：除了直接防御作用外，间接防御作用更为主要即整个植株都能对昆 虫取食造成的局部损伤做出应答，通过调整自身的生理变化，在适当的时间释放 出大量的区别于周围环境并有一定特异性的次生代谢物，寄生物寻找寄主或捕食 者寻找猎物时能够检测到挥发信号提供的信息发现目标，解救受害植株 3 2 病毒侵染诱导植物产生的挥发性信号物质 有关病毒侵染诱导植株产生s a r 并释放一些挥发信号的研究报道很少，在国 际上仅有关于乙烯、m e s a 、苯甲醛作为可能的抗病信号的初步探讨，研究对象 仅限于烟草植株 复旦大学硕士学位论文第一章文献综述 1 ) 几种初步报道的信号化合物 乙烯：乙烯是调节植物病理过程的种气态的植物激素m 3 ，植物感染病原 后产生s a r 会伴随乙烯挥发量的增加如烟草( s a m s u nn n ) 感染t m v 后乙烯的挥 发量增加了1 0 倍其释放量在发生h r 前数小时达到最高，并且和桔班直径的大 小成比例汹1 用乙烯可以诱导植物产生抗病蛋白的现象确认了它可能是参与抗 病过程的一种信号物质“ m e s a ：植物感病后产生的s a 转化成m e s a 后一部分在体内传导作为体内信 号，另一部分从植物叶片挥发出来，在植株间传导抗病信息盯烟草在感染t m v 后，在捕集到的挥发物中发现m e s a 的含量迅速增加，4 8 h 后达到2 2 n g 株h 的 水平，而在健康和假接种的烟草植株附近未检测到该化合物( 检测限为i n g ) 外 源使用气态m e s a 可以诱导烟草植株产生抗性，从诱导处理的植株发病时枯班平 均直径减小以及产生p r 蛋白得到验证 苯甲醛( b d ) ：苯甲醛是植物体内合成苯甲酸的个中间体，最近的研究发 现，烟草感病后b d 的挥发量比正常状态下增加了2 - 3 倍，达到8 - 9 n g 株h 的水 平，外源使用b d 也可诱导烟草产生抗性，因而认为它也是一种参与烟草抗病过程 的信号物质7 “ 2 ) 确定挥发物具有诱导抗性的方法 收集到的植物挥发物中有多种化合物，到底哪一种或几种具有诱导植物产生 抗病性的效果，即哪一种或几种挥发物是植物抗病信号，需要从以下几方面考 虑： 能否诱导植物体内产生更多，甚至是数倍于健康状态下的s a 或m e s a 如 用b d 诱导健康烟草幼苗，发现其体内的s a 含量增加了1 3 倍7 “，由于s a 是一种 研究广泛并被公认的与植物抗病相关的信号物质，因而可以确定植物处于抗病状 态 复旦大学硕士学位论文 第一章文献综述 能否诱导植物产生p r 基因表达以及抗病相关蛋白的产生如用乙烯、m e s a 、 b d 诱导烟草幼苗，都能检测到p r 蛋白的产生”- ”u 诱导处理的植株发病情况是否减轻可以从发生h r 生成的枯班数量和平均 直径衡量如用2 5 0pg l 的m e s a 处理烟草，可使烟草发病后产生的枯班平均直 径减少7 5 ，且浓度越大，发病后枯班平均直径越小 第四节研究植物抗病信号的化学方法 研究植物的抗病化学信号是一个植物病理学与分析化学结合的领域不论 是体内信号还是体外挥发信号的研究，从样品处理、分离、定性、定量都要借 助现代分析化学的手段进行色谱技术的出现，为各种复杂混合物的分离提供了 有效的手段用色谱联用质谱进行分析，还可以对各种分离出来的化合物进 行定性 针对两种植物信号的特点，所采取的分析方法不同对体内抗病信号的分析， 主要解决复杂组分的分离问题：对体外挥发信号的分析，主要解决痕量组分的预 先富集处理问题 。 l - 体内信号的分析方法 己报道的s a 、g a 、m e s a 等体内传递的信号，均采用液相色谱( l c ) 进行分 离分析，在进样l c 之前，要