细胞培养及培养细胞的生物学特点ppt课件.ppt

细胞工程的研究范畴 细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程转基因生物与生物反应器 第二章细胞培养及培养细胞的生物学特点 第一节组织培养 tissueculture 组织培养 tissueculture 习惯上泛指所有的体外培养 即器官培养 组织培养和细胞培养的总称 其本意是指从活的机体中取出组织或细胞 模拟机体内生理条件 在体外建立无菌 适温和一定营养条件等 使之生长和生存 并维持其结构和功能的技术称为组织培养 组织培养这一名词实际上是一个通用名词 其实际内容根据培养物的不同可概括为三个不同概念 一 组织培养的基本概念 组织培养 将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中 待组织块粘着后 沿底面平面移动生长的过程称为组织培养 从组织块中生长出来的仍然是细胞 细胞在生长的同时也发生移动 至使组织中的培养难以长时间维持其原有结构 结果也就成了细胞培养 细胞培养 将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞 做成细胞悬液 再培养于固体基质上 成单层细胞生长 或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养 器官培养 所谓器官培养 是指采取某些措施使器官的原基 器官的一部分或整个器官在体外存活 生长 并保持其原有结构和功能的培养技术称为器官培养 体外培养的种类 二 细胞培养的优点 1 研究的对象是活细胞在实验过程中 根据要求可始终保持细胞活力 并可长时间监控 检测甚至定量评估一部分活细胞的情况 包括活细胞的形态 结构 生命活动等 2 研究条件可以人为控制可以根据需要 控制包括pH 温度 氧气 二氧化碳 张力等物理化学的条件 同时 可以施加化学 物理 生物等因素作为条件而进行实验观察 这些因素同样可以处于严格控制之下 3 研究的样本可以达到比较均一性通过细胞培养一定代数后 所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞 需要时 可采用克隆化等方法使细胞达到纯化 4 研究内容便于观察 检测和记录采用各种研究技术 记录方法 研究 倒置生物显微镜 荧光显微镜 电子显微镜 流式细胞术 激光共焦显微镜 免疫组织化学 原位杂交 同位素标记记录 摄影照片 缩时电影 电视 5 研究的范围比较广泛学科多 病毒学 免疫学 肿瘤学 遗传学 临床医学等对象广 各种动物 低等动物 高等动物 人类一种动物 不同年龄 不同组织 正常或异常 肿瘤 6 研究的费用相对较经济可提供大量 同一时期 重复性好的 生物学性状相似的实验对象 三 细胞培养的缺点 1 体外培养的细胞 尤其是反复传代 长期培养者 有可能发生染色体非二倍体改变等情况 2 细胞培养对人员 设备等条件都要求较高 这些都影响细胞培养技术的更广泛应用 3 动物细胞的培养对营养的要求较高 4 动物细胞培养的另一个突出特点 是对环境条件要求严格 正确认识 现在人工模拟体内环境的技术已经很高 但 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同 当细胞被置于体外培养后 生活在缺乏动态平衡的环境中 久了 必然发生变化 因此 对于体外培养的细胞 应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状 结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体 而不能将之与体内的细胞完全等同 第二节细胞培养的细胞生物学 一 体内外细胞的差异及分化 一 体内外细胞的差异1 与体内主要不同相对孤立 相对单一 缺乏体内的系统作用 失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2 主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显细胞趋向单一化 3 提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体 二 培养细胞形态分类 一 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式分为两种类型贴附型细胞 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞 悬浮型细胞 不必附着于固相支持物表面 而在悬浮状态下即可生长的细胞 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 1 贴附 粘附 型细胞 培养特点与体内同名的细胞不完全相同如 形态相似的成纤维细胞 可不同来源 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但发展趋向不同培养细胞的形态不稳定条件改变 细胞形态可能有变化 培养细胞形态不稳定血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样 分类根据形态大致的不同 主要4类 上皮细胞型成纤维细胞型游走细胞性多形型细胞 1 上皮细胞型 概念 仅形态上似体内 实际上不完全等于 来源 来源于外胚层 内胚层细胞如 皮肤及其衍生物消化道 乳腺 肺泡上皮性肿瘤形态 类似体内的上皮细胞扁平 不规则多角形 中有圆形核 生长特点易相连成片 相靠紧密相连 成薄层铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动 体外培养细胞类型 1 上皮细胞型 成纤维细胞型 概念 凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源 由中胚层间充质组织起源的组织如 真正的成纤维细胞 心肌 平滑肌 成骨细胞 血管内皮 形态 似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2 3个长短不等的突起中有卵圆形核 生长特点排列成放射状 漩涡状 并不紧靠连成片 细胞 细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 体外培养细胞类型 2 成纤维细胞型 3 游走细胞型细胞质常伸出伪足或突起 呈活跃的游走或变形运动 贴附于支持物上散在生长 一般不连接成片 该类细胞形状很不稳定 有时与上皮样细胞或成纤维细胞难以区别 单核细胞 巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培养时常呈现此种形态 4 多形型细胞生长时像神经细胞那样呈多角形 并伸出较长的神经纤维 很难确定它们的形状 因而我们将此类细胞称为多形型细胞 体外培养时常见的多形型细胞是神经元和神经胶质细胞 2 悬浮生长型 概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血 脾或骨髓 尤以血中白细胞 癌 肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好 细胞圆形 单个或小细胞团 优点生存空间大 提供数量大传代方便 不需消化 易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长 尤以正常细胞 三 培养细胞的生长特点 一 贴附 二 接触抑制 三 密度抑制 四 培养细胞的生长和增殖过程 一 单个细胞的生长过程 二 培养细胞生命期 LifeSpanofCultureCells 所谓培养细胞生命期 是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 包括原代培养期 传代培养期及衰退期 正常培养的细胞周期 原代培养 PrimaryCulture 期 也称初代培养 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段 一般持续1 4周 特点 细胞呈活跃移动 可见细胞分裂 但不旺盛 与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大 特点 在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛 并能维持二倍体核型 传代期 传代 体内细胞生长在动态平衡环境中 而组织培养细胞的生存环境是培养瓶 皿或其它容器 生存空间和营养是有限的 当细胞增殖达到一定密度后 则需要分离出一部分细胞和更新营养液 否则将影响细胞的继续生存 这一过程叫传代 初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系 衰退期 特点 此期细胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 最后衰退凋亡 三 体外培养细胞一代生存期 潜伏期指数增生期停止期 所谓细胞的 一代 是指从细胞接种到分离再培养的一段时间 潜伏期 包括悬浮期及潜伏期 当细胞接种入新的培养器皿 不论是何种细胞类型 其原来的形态如何 此时细胞的胞质回缩 胞体均呈圆球形 先悬浮于培养液中 短时间后 那些尚可能存活的细胞 即开始附着于底物 并逐渐伸展 恢复其原来的形态 再经过一潜伏期 此时细胞已存活 具有代谢及运动但尚无增殖发生 以后出现细胞分裂并逐渐增多而进入指数生长期 指数增生期 又称对数期 此期细胞增殖旺盛 成倍增长 活力最佳 适用于进行实验研究 细胞生长增殖状况可以细胞倍增情况 细胞群体倍增时间 及细胞分裂指数等来判断 在此阶段 若细胞处于理想的培养条件 将不断生长繁殖 细胞数量日渐增加 细胞将接触而连成一片 渐次长满培养器皿底面 提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失 因接触抑制而细胞运动停止 密度抑制而细胞终止分裂 停止期 又称平台期 此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满 细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖 此时细胞虽已停止生长 但仍存在代谢活动并可继续存活一定的进间 若及时分离培养 进行传代 将细胞分开接种到新的培养器皿并补充以新鲜培养液 细胞将于新的培养器皿中成为下代的细胞而再次繁殖 否则 若传代不及时 细胞将因中毒而发生改变 甚至脱落 死亡 每次传代接种后 细胞的这些生长繁殖过程 若进行检测计数 可以绘制成曲线 是为生长曲线 各细胞的生长曲线各具特点 是该细胞生物学特性的指标之一 五 体外培养细胞的遗传学特征 一 染色质和染色体 人体体细胞具有二倍体核型 染色体数目为46 2N 原代培养细胞多呈二倍体 经传代成细胞系后 细胞可保持二倍体状态 但经长期传代可能发生偏离二倍体现象 即染色体数多于或少于46 当细胞发生转化或肿瘤细胞 大多失去二倍体核型 成为多倍体或异倍体 在各类培养细胞中 有时会见到异常的染色体 如双着丝点 环形染色体 长臂或短臂 二 细胞性别在23对染色体中有一对性染色体 女性的两个X染色体中有一个在间期呈明显的异固缩状态 呈半月形或三角形小体 称Barr小