鸡肉中金刚烷胺残留量的测定　液相色谱-串联质谱法-规范性审查稿

ICS11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/T XXXXXXXXX鸡肉中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法Determination of amantadine residue in chickenHPLC-MS/MSXXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/T XXXXXXXXXI前言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由山东省质量技术监督局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。本标准主要起草人：高迎春、陈玲、魏秀丽、张呈军、薄永恒、陆庆泉、尹伶灵、章安源、陈志强。DB37/T XXXXXXXXX1鸡肉中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了鸡肉中金刚烷胺残留 量 的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于鸡肉中金刚烷胺残 留 量 的测定。本方法检测限为1.0 g/kg，定量限为2.0 g/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3原理鸡肉中的金刚烷胺经0.5 %三氯乙酸乙腈（11）提取，用混合型阳离子萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。4试剂和材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。4.1乙腈(CH 3CN)：色谱纯。4.2甲醇(CH 3OH)：色谱纯。4.3甲酸(HCOOH)：色谱纯。4.4浓氨水(NH 3H2O)。4.5三氯乙酸(C 2Cl3O2)。4.6异丙醇(C 3H8O)。4.70.5 %三氯乙酸+乙腈(1+1)：称取三氯乙酸(4.5) 0.5 g，用水溶解并稀释至 100 mL，再加入 100 mL 乙腈(4.1)混匀。4.82 %甲酸水溶液：吸取甲酸(4.3)2 mL，加水稀释至 100 mL。4.950 %甲醇水溶液：吸取甲醇(4.2)50 mL，加水稀释至 100 mL。4.105 %氨化甲醇+异丙醇(1+1)：吸取浓氨水(4.4)5 mL，加甲醇(4.2)95 mL 稀释至 100 mL，再加入异丙醇(4.6)100 mL 混匀即得，现用现配。4.11初始流动相：吸取甲酸(4.3) 1 mL，加甲醇(4.2)100 mL，用水稀释至 1000 mL。4.12流动相 A(0.1 %甲酸甲醇溶液)：吸取甲酸(4.3) 1 mL，加甲醇(4.2)稀释至 1000 mL，过 0.22 m 有机系微孔滤膜脱气备用。现用现配。4.13流动相 B(0.1 %甲酸水溶液)：吸取甲酸(4.3) 1 mL，加水稀释至 1000 mL，过 0.22 m 水系微孔滤膜脱气备用。现用现配。DB37/T XXXXXXXXX24.14标准物质：金刚烷胺、马来酸氯苯那敏，纯度95.0 %。4.15标准储备液：准确称取金刚烷胺标准物质 10 mg(精确至 0.0001 g)，于 100 mL 容量瓶内，用甲醇(4.2)溶解并定容，配制成 100 g/mL 的标准储备液，-18 冷冻保存，有效期 3 个月。4.16内标储备液：准确称取马来酸氯苯那敏 10 mg(精确至 0.0001 g)，于 100 mL 容量瓶内，用 50 %甲醇水溶液(4.9)溶解并定容，配制成 100 g/mL 的内标储备液，4 冷藏保存，有效期 1 个月。4.17中间标准溶液：准确吸取标准储备液(4.15) 0.1 mL，置 50 mL 量瓶中，用甲醇(4.3)稀释至刻度，摇匀，其浓度为 200 ng/mL。现用现配。4.18中间内标标准溶液：准确吸取内标储备液(4.16) 0.1 mL，置 50 mL 量瓶中，用甲醇(4.3)稀释至刻度，摇匀，其浓度为 200 ng/mL。现用现配。4.19标准工作溶液：准确吸取适量中间标准溶液(4.17)，中间内标标准溶液(4.18)，用初始流动相(4.11)稀释，摇匀，配成适宜浓度的标准工作液。现用现配。5仪器与设备5.1高效液相色谱-串联质谱仪。5.2天平：感量 0.01g。5.3分析天平：感量 0.00001 g。5.4氮吹仪。5.5振荡器。5.6匀浆机（10000 r/min） 。5.7离心机（10000 r/min） 。5.8真空泵。5.9MCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）。5.10有机微孔滤膜：0.22 m。5.11离心管：50 mL。6测定步骤6.1制样的制备取适量新鲜或解冻的供试组织，同时取空白样品，绞碎并使均质。上述制备的样品-20 以下贮存备用。6.2提取取匀浆后的样品2 g0.05 g，加中间内标标准溶液(4.18)100 L，然后加0.5 %的三氯乙酸+乙腈(4.7) 10 mL，震荡 10 min，10000 r/min离心10 min，取上清液待净化。 6.3净化取MCX固相萃取柱依次用甲醇（4.3）3 mL、水3 mL活化，取提取液（6.2）全部过柱，依次用2 %甲酸水溶液（4.8）3 mL、甲醇(4.2) 3 mL清洗，减压抽干，用5 %氨化甲醇+异丙醇（11） （4.10）3 mL洗脱，50 下氮气吹干。残余物用初始流动相（4.11）1 mL溶解，用有机微孔滤膜（5.10）过滤，待测。 6.4仪器参考条件DB37/T XXXXXXXXX36.4.1高效液相色谱参考条件色谱柱： C 18色谱柱，100 mm2.1 mm1.7 m，或性能相当者。流动相A（0.1 %甲酸甲醇溶液） ；流动相B（0.1 %甲酸水溶液） ；流速：0.3 mL/min；进样量：10 L；柱温：35 ；洗脱条件见表1表 1液相色谱梯度洗脱条件时间（min）流速（mL/min）流动相 A（%）流动相 B（%）0 0.3 10 900.5 0.3 20 802 0.3 80 203 0.3 80 204 0.3 10 906.4.2质谱参考条件电离模式：电喷雾正离子(ESI +)；毛细管电压：3 kv；离子源温度：110 ；脱溶剂温度：320 ；脱溶剂氮气流速：550 L/h；检测方式：多反应监测(MRM)。金刚烷胺的定性、定量离子见表2表 2定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量品名 定量离子对 定性离子对 锥孔电压(V)碰撞能量（eV）金刚烷胺 152.0134.9 152.0134.91512.092.9 30 2515马来酸氯苯那敏 275.0230.0 28 186.5测定6.5.1标准曲线的绘制准确吸取中间标准溶液(4.17) 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL分别置10 mL量瓶中，每量瓶加入1.0 mL中间内标标准溶液(4.18)，用初始流动相 (4.11)定容至刻度，摇匀，配制成浓度为：1、2、4、10、20 ng/mL含内标 20 ng/mL的混合标准溶液，供高效液相色谱测定。以标准溶液中金刚烷DB37/T XXXXXXXXX4胺峰面积和马来酸氯苯那敏峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中相应金刚烷胺的浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.5.2定性测定通过试样色谱图的保留时间与相应标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准溶液保留时间的相对偏差不大于1.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与标准溶液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在金刚烷胺残留。表 3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50 % 20 %至 50 % 10 %至 20 % 10 %允许的相对偏差 20 % 25 % 30 % 50 %6.5.3定量测定取试样溶液、标准溶液上机测定，内标法定量，标准溶液及试样溶液中金刚烷胺和马来酸氯苯那敏峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，典型的金刚烷胺标准溶液中特征离子的质量色谱图参见附录A。7结果计算金刚烷胺残留量按下列公式计算：.(1)10mCVX式中：X 试样中金刚烷胺残留量，单位为微克每千克（g/kg）；C 试样溶液中金刚烷胺浓度，单位为纳克每毫升（ng/ mL）；V 溶解残渣的体积，单位为毫升（mL）；m 试样的质量，单位为克（g）。计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20 %。DB37/T XXXXXXXXX5A A附录A（资料性附录）金刚烷胺特征离子质量色谱图Time1.601.802.02.02.402.602.803.03.20%0101.601.802.02.02.402.602.803.03.20%0101.601.