食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB 22255201x2010-发布 1.1.1.12010-06-01 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布201x-xx-xx 发布 201x-xx-xx 实施食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定（征求意见稿）GB 22255201xI前 言本标准代替 GB/T 22255-2008食品中三氯蔗糖(蔗糖素) 的测定 。本标准与 GB/T 22255-2008 相比，主要变化如下： 增加了含 20%以上糖或糖醇的试样的制备步骤；高效液相色谱分离采用了等度洗脱。GB 22255201x1食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定1 范围本标准规定了食品中三氯蔗糖的液相色谱测定方法。本标准适用于食品中三氯蔗糖的测定。2 原理三氯蔗糖是水溶性物质，易溶于水和甲醇。试样经75%（V+V）甲醇水溶液提取并去除蛋白，含脂肪高的样品再以正己烷萃取去除脂肪，水相经水浴蒸干，加水定容（可根据需要采取中性氧化铝固相萃取柱净化或者C18固相萃取柱富集净化），过滤后进高效液相色谱仪，经反相C 18色谱柱分离后，由蒸发光散射检测器检测，根据保留时间定性,以峰面积定量。3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 甲醇（CH 3OH）。3.2 乙腈（CH 3CN）：色谱纯。3.3 正己烷（C 6H14）。3.4 商品化中性氧化铝固相萃取柱（2 g 装）。3.5 C18 固相萃取柱（3 mL,500 mg） 使用前依次用 4 mL 甲醇，4 mL 水活化。3.6 三氯蔗糖标准品（C 12H19Cl3O8）：纯度99%。3.7 标准溶液的制备 3.7.1 三氯蔗糖贮备液（0.50 mg/mL）：精确称取三氯蔗糖对照品 0.0500 g，用水定容至 100 mL，混匀，其中三氯蔗糖浓度为 0.50 mg/mL。贮备液置于 4 冰箱中保存。 3.7.2 三氯蔗糖工作液：分别吸取0.0 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、8.0 mL三氯蔗糖贮备液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。其中三氯蔗糖工作液浓度分别为0.00 mg/mL、0.050 mg/mL、0.15 mg/mL、0.25 mg/mL、0.40 mg/mL。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱仪：附蒸发光散射检测器。4.2 天平：感量分别为 0.1 mg、1 mg 。4.3 涡旋混合器。GB 22255201x24.4 离心机：转速3000 r/min。5 分析步骤5.1 试样制备 5.1.1 低脂、无脂及非酱色类试样5.1.1.1 称取适量样品（精确到 0.001 g）（使三氯蔗糖的含量在 0.25 mg2.0 mg 范围内） ，置于 50 mL 离心管中，加入 5 mL 水，涡旋混合器上振荡 3 min 后加入 15 mL 甲醇，继续振荡 30 s，超声波提取 20 min，以 3000 r/min 离心 5 min，仔细将上清液移入 50 mL 玻璃蒸发皿内。同时做样品空白试验。5.1.1.2 沉淀物加入 10 mL 75%（V+V ）甲醇水溶液，玻棒搅拌均匀后，以 3000 r/min 离心 5 min，将上清液合并于 50 mL 玻璃蒸发皿中，置于沸水浴上蒸干，残渣用水溶解并定容至 5.00 mL，过 0.45 m 滤膜，滤液为制备的试样溶液备用。同时做样品空白试验。5.1.2 含脂肪样品按 5.1.1.1 操作，上清液移入分液漏斗中，沉淀物按 5.1.1.2 操作，上清液合并于分液漏斗内，然后取 30 mL 正己烷加入分液漏斗中，振摇 2 min，静置 20 min 后分层，移出下层水相置于蒸发皿内，于沸水浴上蒸干，残渣用水溶解并定容至 5.00 mL 后过 0.45 m 滤膜，滤液为制备的试样溶液备用。同时做样品空白试验。5.1.3 酱色类试样甜味酱、豆瓣酱、酱油等试样经 5.1.1 或 5.1.2 处理后所得的 5.0 mL 水溶液通过中性氧化铝固相萃取柱，弃去最初 2 mL 滤液，接收余下滤液，再过 0.45 m 滤膜，滤液为制备的试样溶液备用。同时做样品空白试验。5.1.4 含 20%以上的糖或糖醇的试样含 20%以上糖或糖醇的试样经 5.1.1 或 5.1.2 处理，在沸水浴蒸干步骤时，当蒸发皿中液体在 1 mL左右时用 9 mL 水溶解，移置于 30 mL 体积的离心管中，超声波提取 5 min，以 3000 r/min 离心 5 min，取上清液移入已活化的 C18 固相萃取柱，保持液体流速为 1 mL/ min，到柱上液面为 2 mm 左右时加入 1 mL 水，继续保持液体流速为 1 mL/ min，到柱中液体近干后，用 3 mL 甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液。洗脱液置于蒸发皿内，于沸水浴上蒸干，残渣用水溶解并定容至 5.00 mL。同时做样品空白试验。酱色类试样的溶液继续按 5.1.3 处理，其余试样的溶液过 0.45 m 滤膜，滤液为制备的试样溶液备用。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱：C 18 (4.6 mm150 mm, 5 m) 。5.2.2 流动相：水+乙腈=89+11（V+V）。5.2.3 流速：1.0 mL/min。5.2.4 柱温：35 。5.2.5 蒸发光检测器：按仪器在高水相流动相条件下设置。5.2.6 进样量：20.0 L 。5.3 标准曲线的制作取三氯蔗糖标准系列工作液分别进样 20.0 L，在上述色谱条件下测定峰面积，然后作峰面积 三氯蔗糖浓度（mg/mL）标准曲线，曲线方程依蒸发光散射检测原理，见式（ 1）：峰面积 y 按公式（1）计算：GB 22255201x3(1)abxy式中： y 峰面积； a、 b 与蒸发室温度、检测波长及流动相性质等实验条件有关的常数；x 三氯蔗糖的浓度，单位为毫克每豪升（mg/mL） 。按仪器数据处理软件的处理方式不同，也可作对数方程，即lgy=b+algx。5.4 试样溶液的测定取制备的试样溶液和空白试样溶液20.0 L进样，进行HPLC分析。以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。6 结果计算试样中三氯蔗糖含量按公式（2）计算：（2）10)(mVCX式中：X试样中三氯蔗糖的含量，单位为克每千克(g/kg)；C由标准曲线查得试样进样液中三氯蔗糖的量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；C0由标准曲线查得空白试样进样液中三氯蔗糖的量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；V试样制备液总体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g) ；结果保留两位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8 其他本方法线性范围为0.050 mg/mL0.40 mg/mL。当取样量5.00 g时，定容至5.00 mL时，检出限为0.004 g/kg，定量限为0.014 g/kg。GB 22255201x4附录 A三氯蔗糖（蔗糖素）高效液相色谱图A.1 三氯蔗糖（蔗糖素）标准溶液的液相色谱图图A.1 三氯蔗糖（蔗糖素）标准溶液的色谱图A.2 三氯蔗糖（蔗糖素）试样的液相色谱图图A.2 三氯蔗糖（蔗糖素）试样的色谱图三氯