（食品科学专业论文）茶叶细胞悬浮系的建立及动力学初步研究.pdf

摘要 本文以茶叶品种龙井4 3 为材料，进行了愈伤组织的诱导、摇瓶悬浮培养，并建立了摇瓶悬 浮培养的动力学模型。 愈伤组织诱导培养中，外植体类型、培养基种类、激素、蔗糖浓度、p h 对愈伤组织的诱导 均有影响。通过对培养条件的优化，得到了愈伤组织生长的适宜培养基：m s + i 0m g l 2 ，4 d + 1 0 m g l n a a + 0 5m g f l 6 一b a ，蔗糖浓度3 ，p h 为5 8 。同时测定了愈伤组织在4 5d 天内的生长 曲线，在培养的第3 9d ，愈伤组织生长可达到最大值，其鲜重的最大增殖倍数为4 1 4 。 悬浮培养过程中研究了转速、接种量、装液量、蔗糖浓度、激素对悬浮细胞生长的影响， 得到了悬浮培养的适宜生长条件：m s + 2 0 r e g a l2 ，4 - d + 0 2 5m g j lk t ，蔗糖浓度3 ，接种量1 0 0 g 几鲜重，转液量为3 0m l 1 5 0m l ，转速1 0 0r p m 。 在摇瓶悬浮培养中，建立了茶叶细胞悬浮培养的动力学模型，主要对茶叶细胞生长、蔗糖 消耗和茶氨酸合成的动力学进行了描述。其方程分别为 1 一上也 驴+ 万c x m a x - - c x o 、r 一百e y * x s 眠2 南。 关键词：茶叶，愈伤组织，悬浮培养，动力学 a b s t r a c t t h i sp a p e rr e p o r t e dt h es t u d yo fc a m e l l i as i n e n s 括c a l l u sw a s i n d u c t e d s u s p e n s i o nc u l t u r eo f c a m e l l i as i n e n s i sc e l lw a sc a r r i e do u ti n1 5 0m l f l a s k ，t h e nw ec o n s t r u c t e dan o n s t r u c t u r e dk i n e t i c m o d e l d i f f e r e n te x p l a n t s ，m e d i a ，p h y t o h o r m o n e s , s u c l o s ec o n c e n t r a t i o n sa n dp h c o u l di n d u c ec a l l u s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ho fc a m e l l i as i n e n s i sc a l l u sw a sm s ，c o m b i n e dw i t h1 m g l 2 ，4d ，1m g ln a a ，0 5m g l6 - b aa n d3 s u c r o s e t h ep ho fm e d i u mi s 5 8 d u f f n g4 5d a y s c u l t u r e s ，t h eg r o w t hr a t eo fc a l l u sw a sm e a s u r e d e v e r yt h r e ed a y s t h ec u r v eo ft h eg r o w t hs h a p e d s ， m u l t i p l i c a t i o nr a t eo f c a l l u sw a sh i g h e s tw h e nc a l l u s e sw e r ec u l t u r e di nt h et h i r t y - n i n t h d a y i nt h ec o u r s eo f s u s p e n s i o nc u l t u r e ，t h ee f f e c t so fr o t a t i o n r a t i o ，i n o c u l u m d e n s i t y , p h y t o h o r m o n e s ，t h eb o t t l el o a da n ds u c r o s ec o n c e n t r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n f o rt h eg r o w t ho fc a m e l l i as i n e n s i sc e l lw a sa sf o l l o w s ：1 0 0r p m ，1 0 0g lf w ：3 s u c r o s e ；t h e r e a c t i o nw a sc a r r i e do u ti n1 5 0m l f l a s kw i t ht h eb o t t l el o a do f3 0m l ；t h eb e s tm e d i u mw a sm s ， c o m b i n e dw i t h2m e t e 2 4 - da n d0 2 5m g l k t an o n 。s t r u c t u r e dk i n e t i cm o d e lo ft h e g r o w t ho fc a m e l l i as i n e n s i sc e l l s u s p e n s i o nw a s c o n s t r u c t e d t h i sm o d e ld e s c r i b e dt h er u l eo fc a m e l l i as i n e n s i s c e l l g r o w t h ，l i m i t i n gs u b s t a n c e 。o “s u m p t i o n a n dt h e a n i n e p r o d u c t i o n - t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o d e lh a da v e r yh i g h c o i n c i d e n c ew i t ht h e e x p e r i m e n t a l d a t e s t h e s e e q u a t i o n s o fk i n e t i cm o d e lw e r ea s f o i l o w s r e s p e c t i v e l y 竺! ! f ! ! ，一显 铲+ 贫t e t d t 、铲一 ，卜n 、 。 ” 1 + j e y ， 可彻， k e yw o r d s ：c a m e l l i as i n e n s i s ，c a l l u s ，s u s p e n s i o nc u l t u r e ，k i n e t i c s 兰旦虫些 1 - lb e 一“ 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：一一栉硒谚 时间： p 叶年6 月。7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 嘞飒铭 时间：p 。f 年6 月f _ i 日 导师签名： f 一一j 。， 时间： 、，。牛年6 月f 占日 2 4 一d 6 。b a n a a k t m s e r f w d w c d w p v p a c 缩略词 a b b r e v i a t i o n s 2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e n a p h t h y l e n e a c e t i ca c i d k i n e t i n m u r a s h i g ea n ds k o o g m e d i u m e r i k s s o n f r e s hw e i g h t d r yw e i g h t c a l l u sd r yw e i g h t p o l y y i n g l p y r r o l i d o n e a c t i v ec a r b o n v 2 、4 二氯苯氧乙酸 6 - 苄基氨基乙酸 萘乙酸 激动素 m s 培养基 e r 培养基 鲜重 干重 愈伤组织干重 聚乙烯吡咯烷酮 活性炭 第一章绪论 1 1 植物细胞培养技术 1 1 1 概述 植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官( 如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、 种子等) 、组织( 如形成层、花药组织、胚乳、皮层等) 、细胞p 口体细胞、生殖细胞等) 、胚胎( 如成 熟和未成熟的胚) 、原生质体( 如脱壁后仍具有生活力的原生质体) ，培养在人工配制的培养基上， 给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物细胞培养 技术唑将诱导形成的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养嘲。 植物细胞培养技术的核一i i 理论基础是1 9 0 2 年，德国著名植物学家哈布兰特( g h a b e r l a n d t ) 提出的细胞全能性理论，即植物体的任何一个细胞都包含有整株植物全部的遗传信息，在一定的 条件下具有发育成个完整植株的能力 3 1 。1 9 3 9 年，w h i t e ，n o b e - c o u r t ，g a u t h e r e t 分别建立了连续 培养的组织培养物，为植物细胞培养的发展奠定了基础 4 1 。1 9 4 2 年，g a u t h e r e t 发现植物细胞培养 物可产生次生代谢产物；1 9 4 9 年，c a p l i n h es t e w a r d 提出离体培养的高等植物细胞具有合成天然 产物的潜力 5 1 。1 9 5 4 年m u i r 第一次进行了植物细胞悬浮培养1 6 j 。1 9 5 6 年，r o u t i e s 和n i c h e l l 提 出了第一个植物细胞培养生产天然产物的专利，详细介绍了用3 0l 鼓泡塔反应器培养植物细胞 生产有用次生代谢物质 7 1 。1 9 5 9 年，t u l e e k e 和n i c k e n 在2 0 l 通气的硫酸瓶进行了蔷薇( r o s a s p ) 、 银杏( g i n k g o b i 如b a ) 、冬青掣f ，d “m ) 等植物细胞的悬浮培养；1 9 6 7 年，k a u l 和s t a b a 火规 模培养牙签草( a m m i v i s n a g a ) 细胞，得到了植物次生代谢产物呋喃色酮r a n o c h r o m e s ) ，推动了植 物细胞培养的发展t t 。经过各国科学家的辛勤探索，该技术在科学研究领域和现代化农业生产中 显示出很大的优越性，目前植物组织培养技术主要应用在有用物质的生产、植物无性系的快速繁 殖和遗传突变体的筛选以及植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面展开了深入的研究 8 】，并已经 取得巨大的经济效髓。 1 1 2 植物细胞培养生产有用物质 植物除了为人类提供赖以生存的食物外，还是许多药物( 吗啡、紫草宁、阿吗碱、紫杉醇) 、 色素( 花青素、藏红花) 、香料( 草莓香精、香草香精、葡萄香精) 、农药( 除虫菊酯、鱼藤酮) 等的重要来源。目前，人类已经应用的3 万多种天然化合物中有8 0 p a 上来自于植物“，其中 有1 1 9 种用作药物的化学物质来源于植物提取物，美国使用的处方药中2 5 的活性成分来自于高 等植物【1 1 】。近年来，利用植物细胞、组织和器官培养的方法来生产药用植物的研究取得了惊人的 进展，已有近1 0 0 0 种植物进行过细胞培养方面的研究【1 2 j 。例如，作为染料和消炎药的紫草宁 ( s h i l o n i n ) 、抗癌新药紫杉醇( f “胡、长春花碱( v i n b l a s t i n e ) 、抗疟疾新药青篙素( a r t e m i s i n i n ) 、生物 碱( h e r b e r i n e ) 、香草香料( v a n i l l a 刀h v o r ) 等物质己成功的利用组织培养技术或组织培养方法达到中 试或以上生长规模。 传统上植物体内有重要价值的产物都是从天然植株中提取的，然而提供这些活性物质的植物 资源是有限的，这是因为植物自然生长的局g 良性：( 1 ) 人多数情况下，由于栽培植物生长周期长， 中国农业大学硕上学位论文第一章绪论 并且占用大量土地；( 2 ) 植物生长受到气候、土壤、季节、病虫害等自然因素的影响，种植地域 受到了限制；( 3 ) 随着上业化技术的发展人们试图利用化学方法合成这些产物，但由于许多产物 的生产工艺流程过于复杂，成本高以即近年来人们对化工副产品的担忧。此外，化工台成方法也 无法完全解决植物资源短缺的状况。 植物细胞盼大规模培养，为这些物质的获得提供了极大的优势，通过这种方法获得的天然产 物，不但可以解决原料来源不足、天然资源大量砍伐造成的环境问题而且还能产生天然原料中 不能积累的物质。如从植物中提取的色素、药品等微量的化合物，多数为手性分子，难于合成或 干脆不能合成。与栽培的整珠植物相比，用细胞培养方法生产天然产物具有以下优点【”】： 1 可以实现工业化生产，产量高，生产周期短，成本低； 2 生产过程可人为控制，不受环境如气候、季节、土壤、病虫害的影响； 3 可以保护环境资源，不必占用耕地； 4 易于通过诱变、细胞杂交等技术筛选出高产细胞系； 5 可以进行特定的生物转化，将某些前体及廉价化合物转化为高价化合物： 6 可以利用基因工程手段探索或创造新的生物合成路线或获得新的有用物质。 与动物细胞和微生物细胞培养相比，植物细胞培养还具有以下优点：( 1 ) 大多数植物次生代 请t 产物的合成途径错综复杂，涉及多种植物特有的酶系统，因而很难在动物和微生物体内合成， 利用基因_ ：l 程技术可在微生物细胞内克隆特定的酶的基因，将其转移到植物细胞体内可大大提高 细胞代谢产物；( 2 ) 植物细胞工程的生态污染小，产物对人类无副作用；( 3 ) 产物易于分离纯化， 可降低生产成本。 1 1 3 植物细胞培养生产次生代谢物的研究进展 自2 0 世纪7 0 年代植物细胞工程迅速发展起米，全世界已经对千种植物进行过细胞培养方面 的研究，已经对4 0 0 多种植物细胞进行悬浮培养，从中分离出来6 0 0 多种次生代谢产物，其中6 0 多种在含量上超过或接近原有植物，2 0 种以上超过干重的1 。1 9 7 7 年，z e l l l ( 等从长春花悬浮 细胞培养中获得宿根碱和阿玛碱，其中阿玛碱为细胞干重的1 0 ，宿根碱可达细胞干重的0 8 ， 超过亲本水平【”】。1 9 6 7 年，s o l t 等从烟草根尖的细胞培养中获得吡啶生物碱，含量高达干重的 2 9 。决明愈伤组织培养获得的蒽醌含量比原植物的种子高加倍，约为干重的6 1 1 5 j 。从紫草的 悬浮培养细胞中提取萘醌。含量比原植物提高8 倍，约为干重的1 2 ，现已进行工业化生产。 中国科学院上海植物生理研究所罗士韦研究员，他采用悬浮法培养人参细胞使细胞产率日 增一倍，培养物总人参皂甙含量高达1 0 5 ，超过栽培人参( 4 1 ) ，每立方米培养液可获得干 参1 3 9 8k g 【“】。中国林科院对东北红豆杉愈伤组织进行了细胞克隆及悬浮磁头研究，获得了生长 量高达o 4 9 d 的细胞系，每升细胞培养物紫杉醇的产量可达o 2 5m g 7 1o 中国科学院植物研究 所研究紫草细胞大规模培养，其发酵培养规模己达百斤，有效成份紫草素的含量可达细胞干重的 t 0 以上。上海中医药火学在黄芪毛状根大规模培养和利用毛地黄细胞培养进行生物转化方面已 2 中国农业大学碗l 学位论文第一章绪论 取得了突破性进展【1 8 】。 尽管植物细胞培养技术的研究取得了大量突破性的进展，但是耍使更多种类的植物细胞进入 r 业化产业的行列，还存在着一系列的问题 1 9 】： 1 相对于微生物发酵，植物细胞生产缓慢，效率低，培养过程中易引起污染等问题； 2 植物细胞分化程度低，次生代谢产物产量低，致使生产成本提高； 3 培养细胞的原种难以保存，转接过程中容易产生突变，细胞系退化： 4 目标代谢产物含量低或缺失，其原因是培养条件下的细胞形态分化受到抑制，与之相关 的化学特性消失有关。 1 2 4 植物细胞悬浮培养的特点 1 2 4 1 剪切力 植物细胞的个体大，细胞壁僵脆且具有大的液泡，这些特性决定了其对剪切力十分敏感。适 当的剪切力可以改善通气，使植物细胞具有良好的混合状态和分散性，甚至可以提高细胞密度和 增加代谢产物产量。但过高剪切力可使细胞受到机械损伤，细胞体积变小，细胞形态和聚集状态 改变，或影响细胞代谢，降低产率：或使细胞自溶，胞内化台物释放 也可能导致细胞活性丧失 。 1 2 4 2 植物细胞的聚集与粘附口1 】 植物细胞在培养过程中易成团，形成聚集体。其主要原因是在植物细胞的培养前期，年幼细 胞迅速分裂，产生的新细胞不能及时分开，于是细胞便聚集在一起；另一种原因是在培养的后期， 由于多糖物质和蛋白质的分泌，细胞容易相互粘附，形成大的聚集体。 1 2 4 3 溶氧和气体成分 与微生物相比，植物细胞对氧气的需求量较小。一般在植物细胞培养中采用1 5 2 0 的氧 饱和度。s c h l a t m a n n 2 2 】在长春花细胞高密度培养时，比较在1 5 n8 5 饱和度下的生物量和生物 碱合成基，结果发现两种情况下，生物量无明显差异，但高溶氧时蛇碱产量提高了5 倍，这说明 溶氧浓度对体内次生代谢产物的影响还是比较大的。 此外，二氧化碳的浓度也是影响植物生长和次生代谢产物的又一个重要因素。大规模植物组 织培养合成次生代谢产物也受乙烯影响，很多研究者的工作表明乙烯】添加对细胞生长产生抑制 作用，但能提高细胞培养物中次级代谢产物的合成量。 1 2 植物细胞悬浮培养动力学模型建立 动力学研究的目的是定量地描述反应过程的变化速率以及影响过程速率的各个因素。就植物 细胞培养过程而言，动力学主要研究的是培养过程中植物细胞的生长速率，培养基中各种成分的 3 中幽农业大学预l ：学位论文 第一章绪论 消耗速率，次生代谢产物的生成速率等变化规律以及各种影响因素【。 植物细胞的生长代谢过程是个复杂的生物化学过程，既包括各种细胞内的反应，胞内与胞外 的物质交换，也包含有胞外的物质传递及生化反应，是一个多相、多组分和非线形的体系。由于 众多组分的参与和代谢途径的错综复杂，并且在细胞生长的同时还伴随着代谢产物的生成反应， 因此，要用具有准确系数的反应方程式，来描述生化反应过程几乎是不可能的，必须做出适当的 假设。因而欲对其进行模型的构建，必须作出简化【2 5 7 6 1 。即把工艺过程的复杂结构压缩为少数系 统，而且这些系统被认为是重要的可以用关键量来描述。进行简化不能损失基本信息。通过模型 的简化，可以将一个复杂的反应过程简单化通过检测液体培养基中的外部变化来检查代谢产物 的内部变化。 描述植物细胞悬浮培养的动力学模型采用传统路线，如m o m o d 模型、c o n t o i s 模型、 l e u d e k i n g p i r e t 方程等。这些模型是建立在“平衡生长”假设基础上的，即不考虑细胞之间和不 同培养时期组分代谢特征差异，不考虑细胞本身结构的差异，而是把细胞理想化为均一的模型， 并以此来研究培养过程的生长代谢规律口7 1 。结构模型是将细胞问的差异纳入研究范围，模型中引 入了较多反映细胞培养过程细胞变化的变量，集中反映了细胞内部组分之问，细胞之间以及细胞 与环境之间的生理生长过程。这类模型对分析细胞内部的代谢调控有很大的适用价值。 植物细胞培养的动力学研究，一直受到各国学者的关注，各式各样的模型也层出不穷，有考 虑底物缺乏情况的非结构模型，考虑中间代谢物的结构模型，考虑细胞存活率的结构模型，考虑 底物吸收及活化机制的结构模型，考虑磷酸盐或钙盐影响的结构模型等 2 8 2 ”。 g u a r d i o l a 删1 等提出了一个关于葡萄细胞的生长、底物消耗和产物合成的非结构模型。1 9 8 9 年，f r a z i e r 等提出了一个关于植物细胞聚生体的中间代谢物向介质中释放的生民模型。1 9 9 8 年， g l l c k l i s 3 1 j 等提出了一个关于植物细胞悬浮培养生成多糖产物的数学模型，主要描述了随培养时间 的变化，细胞干湿重、存活率、底物消耗、胞内和胞外多糖浓度的变化情况。b r a m b l e a 2 】等建立 了一个考虑到钙盐和磷酸盐对咖啡细胞悬浮培养影响的模型。 综上所述，植物细胞悬浮培养的建模工作已取得了很多成就，但由于植物细胞是个复杂的体 系，细胞培养过程中存在着各种生理和遗传的不稳定性，同时由于植物细胞种类不同，其次生物 质的代谢调控机制不同，因此，缺乏具有通用性的动力学模型。 1 3 茶叶细胞培养概况 茶叶生物技术研究开始于2 0 世纪6 0 年代末，英国剑桥大学化学系以茶树幼茎为材料，研究 了离体咖啡碱的合成1 ，日本胜尾清进行了茶树花药培养和再生单倍体的研究【“1 。最早的茶树微 繁技术研究报道于1 9 8 4 年p h u k a n 和m i t r a 对茶树茎外植体的培养；n a k a m u r a 在1 9 8 7 年第一次 报道了在茎尖培养中得到了生根和再生植株；1 9 9 0 年s a r a t h c h a n d r a 和a r u l p r a g a s a m ”噪用来自 田问植株的茎节作为外植体，建立了实用的茶树体外繁殖的方法。至今，茶树组织培养技术已经 取得了很大的发展。 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 刘德华、n a k a m u r a t 3 ”、奚彪 3 8 1 等均从茶树腋芽培养中获得了再生植株。上井芳宪”、 k a t o “、i c m t 4 ”、n a k a m u r a ”】、黄亚辉1 4 2 等均以茶树茎段为外植体，获得了再生植株。不同激素 组合对茎段培养具有不同效应，如添加1 0 一m o l l - 1 n a a + 1 0 m o l l - 1 k t 有利于愈伤组织的诱导 3 9 1 ：添加b a + n a a 和b a + g a 分别有利于愈伤组织的形成和生长【4 3 j ；根在1 2 e r 、1 2 m s 培养 基上分化效果较好p 6 3 7 】；f r i s c h 等【圳的研究表明，1 0 7m o l 1 5 1 2 ，4 ，5 - t 和加一m o l l 1 k t 是茶树茎 段诱导愈伤组织的最佳生长素组合。 刘德华等【4 5 ，删以叶为外植体在m s + 1 0m g l - 1 b a + 0 5m g l - 1 n a a + 3m g - l - 1 g a 培养基上诱导 愈伤组织，再将愈伤组织转至m s + 4m g l - 1 b a + 0 5m g l 1 n a a + 3m g l 1 g a 培养基上，分化山芽 并形成苗。 吴振铎以祁门种子叶为外植体获得再生植株”7 1 。刘德华h 8 1 用日本“薮北种”茶籽的子叶柄作 外植体，直接分化了芽。颜慕勤h 9 1 等均从子叶培养中得到胚状体，并再生了植株。 陈平等 5 0 l 以火叶茶成熟种子胚为外植体，诱导分化形成了完整植株；王立等【5 1 1 在改良的 e r + 2 5m g l 1 b a + 0 2m g l 1 1 n a a 培养基上诱导愈伤组织，诱导率达1 0 0 ，芽分化也较好并诱 导了合子胚、不定胚及不定芽，形成完整植株。 陈振光等【5 2 】于1 9 8 0 年首次从福云7 号的花药培养中获得了完糌植株。中国农业科学院茶叶 研究所也进行了花药培养，并诱导出愈伤组织 5 3 l 。 茶树茎和叶的愈伤组织在培养和增殖过程中能合成各种次生代谢产物咖啡碱、茶氮酸、儿茶 素等物质f 5 t 5 5 ，5 t 5 ”。成浩等对茶树悬浮细胞培养中儿茶素的形成进行了一系列的研究1 5 8 , 5 9 ，系统 地研究了培养基中大量元素、微量元素和有机成分_ 1 埒对儿茶素形成的影响。 钟俊辉等( 6 2 j 以碧云嫩叶为诱导材料，对茶树愈伤组织培养所要求的光照、温度、培养基、碳 源、激素、前体物等条件进行研究：陈瑛 6 3 1 等地分析了摇床转速、接种量、装液量和培养基主要 成分对茶树细胞悬浮培养及茶氨酸生产的影响。n a o m is h i b a s a k i 磁t a k a w a 脚喀在悬浮培养中，研 究了培养周期，光照射对茶叶细胞生产类黄酮的影响。 1 4 茶氨酸概述 茶叶中富含有糖类、蛋白质、脂肪、多种维生素等营养成分。其中茶氨酸( n 一乙基一y 罐氨 酰胺) 是茶p t 中特有的一种氨基酸，是茶叶中有效的呈味物质。是决定茶叶品质的重要物质，占 茶叶干重的1 一2 。 1 4 1 荼氨酸的生理效应 6 5 6 6 , 6 7 】 1 4 1 1 降血压作用 血压是通过人体中枢及末梢神经系统的递质儿茶酚胺和5 羟基色胺的分泌量米调节的。等通 过实验证明，服用茶氨酸后5 羟基色胺在老鼠大脑中的合成减少了，并增加了5 ，羟基色胺在老鼠 大脑中的分解，老鼠体内的5 羟基色胺的含量明显降低。 5 中陶农业人学硕士学位论文第一章绪论 1 4 1 2 抗肿瘤作用 茶氨酸是谷氨酰胺的衍生物，而肿瘤细胞的谷氨酰胺代谢比正常细胞活跃得多。因此，茶氨 酸作为谷氨酰胺的竞争物，通过干扰谷氨酰胺的代谢来抑制癌细胞的生长。动物实验证明茶氨酸 对小鼠可转移性肿瘤有延缓作用，对患白血病小鼠可延长其存活期。因此茶氨酸可开发为治疗肿 瘤的辅助药物。 1 4 1 3 静心安神作用 茶氨酸对咖啡因有拮抗作用，对于因咖啡因所产生的兴奋有明显抑制作用。人体多巴胺的释 放会大大影响人的情绪，茶氨酸可影响多巴胺的释放，从而调控人的情绪。另外，茶氨酸对大脑 血清素的合成和分解也产生影响，能降低血清素的合成及增加其分解，或抑制其释放，服用茶氨 酸后，大脑中的血清素含星明显降低。茶氨酸对人脑电波也产生影响，能使人情绪放松、减少紧 张。总之，茶氨酸能起到静心安神的作用，饮茶后能使人心情平静、情绪稳定。 1 4 1 4 促进大脑功能作用 茶氨酸能影响人体大脑的功能，服用茶氨酸后，人的记忆能力可得到提高，这是由于茶氨酸 影响了与学习、记忆有关的脑内中枢神经递质5 羟色胺的活性茶氨酸能活化5 羟色胺。 l _ 4 1 5 减肥作用 用混有0 0 2 8 茶氨酸的饲料喂养小鼠1 6 周后，其体重比对照群有明显减少，腹腔脂肪减少 到对照群的5 8 。同时血液的中性脂肪及胆固醇含量分别减少3 2 t l1 5 ，肝脏中的胆固醇减少 2 8 。因此茶叶的减肥作用是茶叶中包括茶氨酸在内的多种成分共同作用的结果，茶氨酸尤其对 减少体内胆固醇有效。 1 4 2 茶氨酸的生产方法 6 8 6 9 】 1 4 2 1 直接提取法 由于茶叶中茶氨酸的含量不高，从茶叶提取茶氨酸无实际生产价值。 1 4 2 2 化学合成法 茶氨酸的化学合成首先是谷氨酸的吡咯烷酮化。此外，还可通过二硫化碳保护a 氨基来合成 茶氨酸，或者改用谷氨酸乙醛为原料再用钯碳催化还原合成茶氨酸。化学合成的优点是操作相对 简单、可大量合成，但是其提纯不易，且易混杂有毒物质，产品不宜于食品卫生。 1 4 2 3 微生物发酵法 在化学合成茶氨酸的过程中，必需对a 氨基进行乙胺基化，而微生物发酵合成茶氨酸则无需 对a 氨基进行乙胺基化，这是因为酶促反应具有高度专一性，但必须与葡萄糖的降解反应相偶联。 目前应用于生产合成茶氨酸的酶不是从茶树中提取到的茶氨酸合成酶，而是细菌中的谷氨酰胺合 成酶提取物，这是因为茶树中提取的茶氨酸合成酶容易失活。另外，由于茶氨酸在自然条件下含 量少，冈此不能大量提取。 6 中困农业人学硕士学位论文 第一章绪论 1 4 2 4 植物组织培养法 植物细胞培养技术不仅能加快植物细胞的生长速度，而且自身又具有合成各种天然化合物的 功能。采用茶树细胞培养来产生茶氨酸，或者采用茶树愈伤组织培养来产生茶氨酸，然后通过离 子交换法从茶树愈伤组织中提取茶氨酸。 1 5 立题依据和研究内容 1 51 立题依据 茶氨酸是种安全、无毒、具有多种生理功能的天然食品添加剂，具有广阔的开发前景。茶 饮料将成为目前世界上主要的饮料之一，茶氨酸作为茶叶的主要呈味物质，首先被作为一种食品 添加剂用于茶饮料。茶氨酸可用于各类点心、糖果、果冻、饮料及口香糖等几乎所有的食品，而 且添加茶氢酸后，不但能提高食品的品质，而且能提高其附加值。此外。茶氨酸可用作净水剂来 净化饮用水，作为一种除臭剂的有效成份等。茶氨酸的诸多作用，为其开发利用展示了广阔的前 景，具有重大的开发和应用价值。 1 5 ，2 研究内容 本文通过植物组织培养技术，从愈伤组织的诱导培养出发，随后进行了细胞悬浮培养，使细 胞能够快速大量的增殖，并测定了培养过程中茶氨酸的含量，为茶氨酸的分离提纯做准备，为使 茶叶细胞最终能在食品工业中应用做一些基础研究。主要研究内容如下： 1 茶叶愈伤组织的诱导培养：通过对基本培养基的筛选，研究了激素、蔗糖浓度、p h 对愈 伤组织诱导的影响； 2 茶叶细胞悬浮培养系的建立：主要研究接种量、蔗糖浓度、植物激素、转速、装液量对 悬浮细胞生长的影响； 3 建立了摇瓶悬浮培养的动力学模型。 7 2 1 引言 第二章茶叶愈伤组织的诱导培养 愈伤组织是指植物受伤后在受伤表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在培养基上由 外植体长出的一团无序生长的薄壁细胞，称之为愈伤组织。 愈伤组织诱导中，外植体取材部位和发育阶段对愈伤组织的形成有很大的影响，在不同的季 节，植物提供的外植体类型不同，一般来说选用外植体时，通常要选取易分化的幼芽、幼茎段、 半水质化茎段等材料作为外植体i ”1 。不同的外植体所需要的诱导时间也不同，在茶叶的愈伤组织 培养中，茎段诱导产生愈伤组织的时间9 1 2d ，叶需要2 0d ，子叶和根需要8 1 2d ，花药需要7 1 0 d 【，“。获得良好的愈伤组织不仅是细胞悬浮培养的基础，而且是植物进行遗传转化的基础。 本实验主要研究了培养基、激素、蔗糖浓度、培养基的p h 对愈伤组织诱导的影响，找出适 合愈伤组织生长的最佳培养条件。以便获得诱导率高、生长快速的愈伤组织，为茶叶细胞悬浮培 养做准备。同时，在继代培养过程中，研究了不同抗褐变剂对愈伤组织生长情况的影响及抗褐变 的效果；并且测定了愈伤组织的生长曲线和茶氨酸含量。 2 2 材料和主要试剂、设备 2 2 1 供试材料 茶叶( c a m e l l i as i n e s 括) 品种龙井4 3 ：种苗和种子，由河北农业科学院提供。 2 2 2 主要试剂 硝酸铵分析纯北京化工厂 硝酸钠分析纯北京化工厂 硝酸钾分析纯北京益利精细化学品有限公司 硫酸镁分析纯北京益利精细化学品有限公司 磷酸二氢钾分析纯北京益利精细化学品有限公司 硫酸钠分析纯北京化工厂 磷酸二氨钠分析纯北京益利精细化学品有限公司 氯化钾分析纯北京化学试剂二厂 碘化钾分析纯北京化工厂 硼酸分析纯北京化工厂 硫酸锰分析纯北京化工厂 硫酸锌分析纯北京化工厂 聚乙烯吡咯烷酮分析纯北京化学试剂公司 活性炭分析纯北京化学试剂公司 r 中国农业大学硕士学位论义第叫章茶叶自胞的生物反应器培养 2 4 d分析纯北京化丁厂 6 b a分析纯北京化工厂 n a a分析纯北京化上厂 2 2 3 主要仪器和设备 电子称 b s 2 0 0 s北京赛多利斯天平有限公司 p h 计p h s 一2 5上海精科雷磁仪器厂 微波炉pj21f-b顺德市美的微波炉制造有限公司 恒温磁力搅拌器8 5 2上海司乐仪器厂 玻璃仪器气流干燥器诗圣牌b 型河南省巩义市杜甫仪器厂 电热干燥箱c s l 0 1 - - 1 a b重庆银河试验仪器有限公司 高压灭菌锅y x - 2 8 0江阴滨江医疗设备厂 超净工作台 f ic _ 一3哈尔滨市东联公司 超声波清洗器d l - - 3 6 0 a上海之信仪器有限公司 其它常规组培设备 2 3 实验方法 2 3 1 外植体的消毒处理 取龙井茶的幼嫩茎段，用自来水冲洗1h ，然后经7 0 的酒精表面灭菌3 0s ，o 1 的升汞灭 菌1 2r a i n ，最后用无菌水反复清洗5 次，在杀菌和无菌水清洗过程中分别采用手摇、磁力搅拌和 静止的处理方式。然后将无菌材料接种在m s 培养基上。蔗糖浓度3 ，p h 5 8 ，温度2 5 _ + 1 ， 暗培养。接种3 0 个外植体，实验每天观察一次，出现污染后，及时将没有污染的材料转入新的 培养基中，以便于统计外植体的消毒效率。 2 3 2 茶叶愈伤组织生长条件的优化 2 3 2 1 培养基的筛选 m s 、w h i t e 、h e l l e r 培养基，附加蔗糖3 0 9 几，2 , 4 d1 0 m g i 6 - b a 0 1m g l 【7 ”，p h 5 8 ，5 6 g l 琼脂，加热溶解分装后经1 2 1 ，0 1 5m p a 压强下灭菌1 5 m i n ，冷却备用。 2 ，3 ，2 2 外植体的选择 咀m s 为基本培养基，附加蔗糖3 0 9 m ，2 , 4 d1r a g l + 6 b a 0 1m g l 碉上。实验设置了茶叶 种子、幼嫩茎段、老茎段、幼叶和老叶作为外植体，经消毒后，接入愈伤组织诱导的培养基中， 比较不同部位的外植体在愈伤组织诱导的培养基上的诱导情况，选择愈伤组织诱导率高、生长状 况良好的外植体。 2 3 ，2 3 不同激素对茶叶愈伤组织诱导的影响 以m s 培养基为基本培养基，蔗糖浓度3 ，含有不同浓度的2 , 4 - d 、6 - b a 、n a a 正交组合 9 中周农业大学硕士学位论文 第心章茶叶细胞的生物反庶器培养 的培养基中，每处理接种外植体4 0 个，培养周期3 0d ，3 0d 后统计愈伤组织的诱导率。 2 3 2 4 不同浓度的蔗糖对茶叶愈伤组织诱导的影响 在最佳激素浓度组合下，在m s 培养基上附加不同浓度的蔗糖：0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、 6 0g l 。实验每处理接种外植体3 0 个。3 0d 后统计愈伤组织的诱导率。 2 3 2 5 不同p h 对茶叶愈伤组织诱导的影响 在最佳激素组合和最佳蔗糖浓度组合下，设置了不同p h 值的m s 培养基。每个处理接种外 植体3 0 个，3 0d 后统计愈伤组织的诱导率。 2 ，3 3 茶叶愈伤组织继代培养过程中的抗褐变处理 在最适激素组合、最适蔗糖浓度和最佳o h 条件下，将诱导山的愈伤组织接种在m s 培养基 上。培养基中含有不同浓度的活性炭( a c ) 和聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) ，3 0d 后统计愈伤组织的 增殖倍数和和褐变程度。 2 3 4 茶叶愈伤组织生物量的确定方法 2 3 4 1 愈伤组织的生长曲线 在最适激素组合、最适蔗糖浓度和最佳p h 条件下，将愈伤组织继代培养在愈伤组织生氏的 最佳培养基上，接种量为1 5g 鲜重瓶，连续培养4 5d ，每3d 取样称重一次，实验三次重复， 三实验结果取取平均值。 2 3 4 2 茶氨酸含量的测定 茶氨酸的测定采用滴定法1 。称取2g 鲜重的愈伤组织，研磨后用2 0m l l 0 0 热水提取3 0 m i n ，过滤后加5 的中性醋酸铅处理，过滤，减压浓缩至干，用甲醛和冰醋酸溶解，加结晶紫， 用高氯酸滴定。茶氨酸含量每3d 取样以一次，进行测量。 2 3 5 实验数据计算方法 消毒效率( ) = 未污染外植体数接种外植体个数1 0 0 愈伤组织诱导率( ) = 愈伤组织个数接种外植体个数1 0 0 愈伤组织增殖倍数= 接种前愈伤组织鲜重接种后收获的愈伤组织鲜重 2 4 结果与分析 2 4 1 外植体消毒处理 大量实验表明，o 1 的升汞和7 0 的酒精组合是较理想的杀菌方式。但灭菌时问要求极为严 格，时间过短，杀菌不完全，不能有效的杀死外植体表面的微生物；时间过长，对外植体有损伤， 有时甚至杀死外植体，不利于愈伤组织的诱导【”。 1 0 中国农业大学硕士学位论文第四章茶叶细胞的生物反戊器培养 由表2 1 可以看出，在杀菌方式的比较中，静置、手摇动、磁力搅拌的消毒效率分别为8 0 0 、 8 3 3 、8 6 7 ，同时其褐变程度最轻。而在清洗方式实验中，不同的清洗方式，对外植体消毒效 率影响很人，磁力、静止、手摇动的消毒效率分别为8 6 。7 、5 6 7 、6 6 7 ，差异显著；同时， 都不同程度的出现了褐变，其中尤以静止方式清洗时最为严重。这是因为采用磁力搅拌可以将附 着在外植体表面的升汞有效的除去，减少对材料的杀伤作用，而采用手动和静止的方式不能有效 地去除外植体表面的杀菌剂。孙仲序等p 目在山东茶树组织培养研究中，采用7 5 的酒精灭菌3 0s 和0 ，1 升汞灭菌1 1m i n ，在振荡处理方式下，剪取冬季嫩茎段，成活率可达到5 7 。 表2 - 1 不同灭菌方式对消毒效率和褐变程度的影响 t a b l e 2 - 1 e f f e c t o f d i f f e r e n t m e t h o n d o f s t e r i l i z a t i o n0 n t h er a t eo f s t e r i l i z a t i o na n d t h e d e g r e eo f b r o w n i n g 注：一表示褐变昂轻培养基为白色；+ 表示轻微榀变，培养基为浅黄褐色 + + 表示褐变严重培养基为黄褐色 2 4 ，2 外植体的选择 j | 植物不同部位的组织作外植体，进行愈伤组织诱导时，其产物或诱导率不同。选择外植体 时还要考虑所取外植体的组织部位所处的发育阶段，不同发育阶段的外植体在相嗣的培养基上愈 伤组织的诱导率和状态都不同。 实验进行了不同外植体和不同发育阶段的外植体的愈伤组织的诱导实验，每处理接种外植体 3 0 个。实验结果见表2 - 2 、表2 - 3 。 表z - 2 不同外植体对愈伤组绠的诱导情况 t a b l e2 - 2 e f f e c t o fd i f f e r e n te x p l a n t so nc a l l u s i n d u c t i o n o f c a m e l l i a s i n e s i s 外植体类型愈伤组织状态产生愈伤组织韵时间( d )愈伤诱导宰( ) e x p l a n t c a l l u ss t a t e c a l l u sf o r m a t i o nt i m er a t eo f c a l l u si n d u c t i o n 叶黄绿色，质地较硬 2 37 3 ，3 茎淡黄绿色，质地较硬 1 18 3 3 种子不产生愈伤组织一一 由表2 2 、2 - 3 可看出，茶叶的幼叶、幼茎、顶芽均能诱导处愈伤组织，且幼茎诱导出的愈伤 组织质地和诱导率均较高，且愈伤组织诱导时间短。幼嫩叶片，因为叶表面积大，背后有绒毛， 不易彻底消毒，在培养过程中易污染，所以其诱导率低。顶芽在消毒过程中易受损伤，在以后的 培养中易褐变，所以诱导率低。故咀后实验中采用幼茎作为外植体。 表2 - 3 外植体的幼嫩程度对愈伤组织诱导的情况 t a b l e 2 - 3 e f f e c t o f t e n d e r d e g r e eo nc a l l u s i n d u c t i o no f c a m e l l i a s i n e s i s 2 4 3 培养基的筛选 植物生长所需要的培养基成分包括大量元素、微量元素、有机成分、碳源和植物生长调节剂。 培养基中各组分的浓度和不同组合，对植物的生妖将产生不同的影响，因各种植物对营养成分的 需要不同。为了选择茶叶愈伤组织诱导生长的最适培养基，选用了无机盐含量高、微量元素全的 m s 培养基，无机盐中等含量的h e l l e r 培养基和无机盐含量较低的w h i t e 培养基3 种基本培养基 作试验。 表2 - 4 不同基本培养基对茶叶愈伤组织诱导的影响 t a b l e2 4e f f e c to f d i f f e r e n tm e d i u mo nc a l l u si n d u c t i o no f c a m e l l i as i n e s i s 将茶叶的幼嫩茎段消毒后接种在m s 、w h i t e 、h e l l e r 培养基上( 见附页图1 ) ，暗培养。在 接种后的第1 0d 开始出现愈伤组织，愈伤组织颜色为浅黄、淡绿色。相同激素组合，不同基本 培养基对茶叶愈伤组织的诱导情况如表2 - 4 所示