（生理学专业论文）卵巢特异性转lrh1基因小鼠的生产.pdf

摘要 l r h 1 0 i v e rr e c e p t o rh o m o l o g u e - 1 ) 是首先在小鼠肝脏中发现的一个核受体蛋白，l r h l 在 动物胚胎的早期发育及分化，维持成体动物胆固醇平衡，胆酸平衡等过程中起重要作用，对多 神蛋白的正常表达起调控作用最近的研究证实l r h - 1 在卵巢中有大量表达，且体外实验证明 其可启动c y p l 9 基因的表达为进一步研究l r h 1 在卵巢中的功能，本实验试图生产一种在 卵巢中超量表达m l r h 1 ( m o m l r h 1 ) 的转基因小鼠，用以研究该基因超量表达时对卵巢功能 的影响。 本试验通过r t - p c r 从小鼠肝脏反转录扩增出小鼠l r h 1 基因的e d n a 序列，并将其e d n a 与g f p ( g r e e nf l u o r e s c 矗 t o ep r o t e i n ) 基因的5 端融合，使两个基因处在同一个阅读框内然 后通过体外同源重组将a m h r 2 ( a n f i - m u l l e r i a l lh o r m o n er e c e p t o rt y p e 玎，抗缪勒氏管激素 型受体) 基因上游约1 3 k b 长的基因组片段。套取”下来，得到最终的转基因载体 p a m h r 2 - l r i - i i g f p 。最后用n o ti 和m l u i 双酶切p a m h r 2 l r h i - g f p ，得到一个1 5 4 k b 的转 基因表达片段，该转基因片段从5 到3 端依次连有a m h r 2 启动予，工舢，g f p 融合基因及 s v 4 0p o l y a 加尾信号。细胞转染试验证明l r h l g f p 融合基因可在h e k 2 9 3 细胞中正常表达。 将表达片段通过原核注射导入f v b 小鼠受精卵中，出生的小鼠通过聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 。p c r ) 及s o u t h e r n 杂交检测。 p c r 及s o u t h e r n 检测确定在2 4 只后代中得到3 只阳性小鼠。 关键词：转基因小鼠，l r h 1 。卵巢 a b s t r a c t l r h l ( 1 i v e rr e c e p t o rh o m o l o g u e - 1 ) w a san u c l e a rr e c e p t o ri n i t i a l yi s o l a t e df r o mt h em o b $ el i v e r , l r h 1f l a y sa l ls i g n i 6 c a n t r o l e d u r i n g t h e e a r l y d e v e l o p m e n t o f a x l b t y o , a n d i n k e q 丽n g h o m e o s t a s i s o f c h o l e s t e r o la n db i l ea c i d i tw a sa l s of o u n dt h a tl i 媸i - ih a sa na b u n d a n te x p r e s s i o ni no v a r ya n d m a yp a r t i c i p a t ei nt h eo o r p u $ l u t e u mf u n c t i o n r e c e n t l y , t h ei nv i t r oa s s a yd e m o n s t r a t e dt h a tl r h 1 c o u l dr e g u l a t ec y p l 9 e x p r e i o n , s u g g e s t i n gt h a tl r h - 1p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns t e r o i d g c n e s i s t o m a k eaf l l r t h c rs t u d ya b o u tt h ef u n c t i o no f l r h 一1i no v a r yi nv i v o , w ep i o d i l 。c dt h et r a n s g e n i cm i c e w h i c hs p e c i f i c a l l yo v e r e x p r e s sl r h 一1i no v a r y i nm ye x p e r i m e n t , l r h - ic d n aw a si s o l a t e df r o mm o i k q eh v e r , a n df u s e dw i t hag f p ( o r e e a f l u o r e s c c 。p r o t e i n ) g e n ei ni t sct e r m i n a l l r h t - g f pw a gd r i v e nb ya1 3 k bp u t a t i v ep r o m o t e ro f a m h r 2 ( a n t i m u l l e r i a nh o r m o n er e c e p t o rt y p el dg e n e ，w h i c hw a si n t i o d u c e di n t ot h ev e c t o r t h r o u g h r e t r i v a l ”m e d i a t e db yr e c o m b i n e e r i n g t h e p r i i o nf m g m e n tw a se n d e db yas v 4 0p o l y a t os t a b i l i z et h ec o n s 打u c lf i n a l l y , t h ec o n s t r u c tw a gl i n e a r i z e db yn o ti m l uid i g e s t i o nt or e l e a s e t h e 嫡e c t i o nf r a g m e n t s a f t e rp u r i f i c a t i o n , t h et r a n s g e n i cf r a g m e n t sw e r em i c r o i n j e c t e di n t ot h e p r o n u c l e u so f t h ef v b i n o u s ez y g o t e s s c r e e n e dt h r o u g hp c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) a n ds o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n ，w cc o n f i r m e d t h a t3o u to f2 4p u l mh a di n t e g r a t e dt h ee x o g e n o u sl r h ie x p r e s s i o nf r a g m e n t si n t ot h e i rg e n o m i o s e q u e n c e s k e y w o r d s ：t r a n s g e n i cm o u s e ，l r h - 1 ，o v a r y h 缩略语表 ( a b b r e v i a t i o n s ) l l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 擞也 、 时间：扫6 7年月狮 关于论文使用授权的说明 本人完全了勰中量农业大学有关保留、使用学位论文豹规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被套阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 躲癣曼 导师签名； 时阚t 习 f 年彳黾这b 时间叼年击妒 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 m i 一 i i i 宣i i i i i i i 宣i i i i i 1 1 核受体简介 第一章文献综述 核受体( n u c l e a r r e c e p t o r s , n r s ) 是转录因子( w a n s c r i p t i o nf a c t o r , t f ) 中最大的家族之一， 目前发现的核受体总数约有7 0 多个，其中人类基因组中有4 8 个。在脊椎动物( v e r t e b r a t e s ) ， 节肢动物( a r 血r o p o d s ) 和线虫类( n e m a t o d e s ) 的发育、维持机体动态平衡、诱发或抑制细胞 增殖分化以及凋亡等过程中，核受体调控诸多关键性步骤并产生一系列复杂的生理事件。大多 数核受体是通过与小分子脂类配体结合而产生活性的，这些小分子脂类配体包括激素、代谢产 物以及某些合成的配体。还有一些核受体的活性激活不需要配体的结合，他们被称为“孤核受 体”( o r p h a nn r s ) ( d i n om o r a s ，1 9 9 8 ) 。 核受体与配体结合并激活后发生构型改变，导致共抑制因子复合物( c o - r e p r e s s o r c o m p l e x ) 的解聚和共激活因子复合物( c o a c t i v a t o rc o m p l e x ) 的募集。这些复合物往往由多种蛋白构成，前 者抑制转录的起始而后者则促进转录的起始，其机理一般是通过改变与隐藏于染色质结构中的 目标d n a 的接触难易度来改变基础转录速率的( e l i s a b e t h ，2 0 0 4 ) 。 核受体蛋白家族的结构比较保守，除了个别核受体只含有d n a 和配体结合区外，大多数 核受体从氨基端到羧基端依次包括a b 区，d n a 结合区( d n a b i n d i n gd o m a i n , d b d ) ，铰链区 ( d 区) ，配体结合区( l i g a n d b i n d i n g d o m a i n ，l b d ) ，还有一些核受体的羧基端还含有一个功能 未知的f 区。核受体( n r s ) 超家族分为7 个亚家族( n r 0 n r 6 ) ，l r h 1 属于其中的n r s a 亚家族，该亚家族含4 个不同的成员( m e m b e r s ) ，l r h 1 是其中的第2 个成员，所以l r h 1 也叫n r s a 2 ( n u c l e a r r e c e p t o rs u b f a m i l y5 ，g r o u pa m e m b e r 2 ) ( e l i s a b e t h ，2 0 0 4 ) 。 1 2 卵巢的激素分泌功麓 卵巢是雌性动物主要的生殖器官，其主要功能包括卵子的产生和性激素的分泌。卵巢分泌 的激素主要有雌激素和孕酮。雌激素主要由存在于颗粒细胞内的芳香化酶作用于卵泡，由卵泡 膜细胞产生雄激素，雄激素被芳香化面生成雌激素。孕酮主要由发情后期，间情期，妊娠期的 黄体细胞产生。雌激素诱导雌性生殖器官的生长、发育以及雌性动物的发情行为。孕酮可刺激 子宫腺的发育及分泌，使子宫处于接受状态；可阻止卵泡的成熟和再次发情，使动物处于妊娠 状态( 杨增明，孙青元，夏国良，生廑吻学烈华盛拓栏) 。 中售农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 3l r h - 1 简介及研究进展 l r h 1 ( 1 i v e r r e c e p t o r h o m o l o g u e ：- i ) 是最近在小鼠肝脏中发现的一个核受体蛋白( t u g w o o d ， 1 9 9 1 ) 小鼠l r h - i 基因在出生前就开始表达，胚胎期4 5 天( e 4 5 ) 时大量表达于囊胚内细胞 团中( g a l a m e a u , 1 9 9 6 ) 。e 7 5 天时表达于原肠内胚层( p a r c j f o 0 0 1 ) 。e 8 5 天时表达于卵黄囊 内胚层，鳃弓和神经脊细胞( r a u s a , 1 9 9 9 ；a n n i e o t t e , 2 0 0 3 ) 。在肝脏，睾丸和胰腺形态形成的e 9 5 天时持续表达于原肠内胚层细胞。这时随着这些细胞的分化，u m i 进程性地表达( p r o g r e s s i v e l y e x p r e s s e d ) 于肝、睾丸以及胰腺外分泌腺中。e 1 7 5 天时，l r h - i 表现出其成体表达模式，即 在肝脏、胰腺外分泌腺及胃上皮细胞中持续性表达从胰腺内分泌腺中消失，而在小肠的表达 则限于l i e b e r k u h n 脊细胞。 作为一个核受体，l r h - 1 主要是作为一个转录调控因子执行其功能的，通过在不同时期的 不同组织( 主要是内胚层源的组织) 中调控多种蛋白的表达，从而影响这些组织的发育及生理 生化功能。 1 ，3 1l r h 一1 在胚胎发育中的作用 在囊胚内细胞团中，o c t 4 对维持内细胞团和胚胎干细胞( e s ) 的多潜能性具有重要作用， 在未分化的e s 细胞中，l r h 1 可结合到o c t 4 的前端启动子上激活o c t 4 报告基因的表达，破坏 l r t t - i 基因会造成外胚层期o c t 4 表达量的降低，从而可能影响胚胎干细胞的多潜能性( p e i l ig u c t a l 2 0 0 5 ) 。在肝的分化与发育过程中，ai - 胎蛋白( a f p ) 的表达是原肠内胚层细胞向肝细胞 系分化的一个标志，j e a n 等人证明l r h 1 可以调控早期a f p 的表达。另外。h n f - ia ( h e p a t i c n u c l e a rf a c t o r - io1 、h n f - 3 1 及h n f - 4 a 等蛋白的表达对肝早期的分化都具有重要意义，而这三 个基因的启动予上都发现了l r h 1 的结合位点( p a r dc ta 1 2 0 0 1 ；r a u s ac ta 1 1 9 9 9 ) 。与此相应的 是l r h 1 的启动子上含有保守的g a t a 因子结合位点( z h a n ge ta 1 2 0 0 1 ) 但h n f - 1a ，m v f - 3 尹 及h n f - 4 a 的启动子上均没有，而g a t a 是已知的广泛参与内胚层源组织分化的因子，所以更 有可能是l r i - i 1 直接受g a t a 因子的调控进而调控h n f - j 口，h n f - 3 p 及i i n f - 4 a 基因的表达。 在胰腺的发育过程中，同源盒因子p d x 1 发挥重要作用，p d x - i 突变的纯和体会导致胰腺 发育不全，而在胚胎发育过程中l r h - i 和p d x 1 共表达于胰腺中，且在e 8 5 - - e 1 6 5 之问内 l r h - j 的表达受到p d x 1 的调控( a n n i c o t ee ta 1 2 0 0 3 ) 。 l r h i 还在人乳腺组织中未分化的前脂肪细胞( p r e - a d i p o c y t e s ) 中表达，但在分化的脂肪 细胞中不表达，而芳香化酶p 4 5 0 作为前脂肪细胞分化的标志也仅在前脂肪细胞中表达( c l y n ee t a 1 2 0 0 2 ) ，因此l r h 1 也可能作为前脂肪细胞分化的一个标志。后来科研人员发现l r h l 在 人类前脂肪细胞中确实可以调控芳香化酶p 4 5 0 的编码基因c y p l 9 的表达( c o l i n d 。c 1 y n e , 2 0 0 2 ) ， 所以l r h 1 可能参与控制前脂肪细胞的分化。 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 3 2l r h _ 1 在胆固醇代谢中的作用 胆固醇广泛参与多种生理生化过程，包括细胞膜的合成，以及胆酸和类固醇激素的合成。体 内胆固醇的水平与很多疾病息息相关。如动脉硬化症( a t h e r o a c l e r o s i s ) ，胆汁淤积( c h o l c s m s i s ) 以及胆结石的形成。因此正确调控胆固醇代谢，保持胆固酵在细胞间的正常水平对保持健康来说 意义重大而l r i - i - 1 在维持体内胆固醇平衡方面发挥重要作用。 胆固醇主要是以与高密度脂蛋白( h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n , h d l ) 结合的形式通过b i 型清道夫 受体( s c a v e n g e r r e c e p t o r t y p e b i ，s r o b i ) 从外周组织进入肝脏的，该过程叫做胆固醇的反向运输 ( r e v e r s ec h o l c s a o lt r a n s p o r t ) 。在这一过程中h d l 被一些酶重构( r e m o d e l ) 。如胆固醇脂转化蛋 白( c h o l e s t e r y | - e s t e r - t r a n a f e r p r o t e i n , c e t p ) 可以将h d 瞒化成富含甘油三酸酯的脂蛋白( 极低密 度脂蛋白，中密度脂蛋白和低密度腊蛋白) ，随后这些脂蛋白被肝脏分解，从而间接促进了胆固 醇反向运输l u o 等人的研究发现，胆固醇水平的升高会引发c e t p 转录和蛋白水平的升高，这一 过程是由氧化固醇( o x y s t e r 0 1 ) 激活的l x r o t 和l x r l 3 受体介导的，而这个过程很可能受到l r h - i 的调控( l u oe t a l 2 0 0 1 ) 。另外，l r h - i 还参与肝脏中的胆酸( b a ) 对c e t p 的下调作用，可能的 途径是b a 促进v x r ：r 导的s h p 升高，而s h p 抑制u m i 的生成，进而下调c e t p 。 在胆固酵反向运输过程中，s r o b i 受体的作用也不容忽视。因为它负责肝脏对h d l 中胆固酵 酯的选择性吸收。肝脏中的s r - b i 受体过量表达时，就会伴随h d l 水平的降低和胆固醇排出 ( e x e r c t i o n ) 的增加。s r b f 讣鼠的胞浆胆固醇水平会升高，并且当其与有易感遗传背景的小鼠 杂交后容易发生动脉硬化。研究发现l r h 1 可以通过辨8 瑾因启动子上的l r h 1 识别元件 ( l r h 1r e c o g n i t i o ne l e m e n t l r h 1r e ) 调控s r - b i 的表达( s c h o o n j a n se ta 1 2 0 0 2 ) 。 因此。l r h 1 对c e t p 和s r - b i 的调控说明其在胆固醇反向运输中具有重要的作用。 l r h - i 在溻控胆圈醇代澎方嚣韵另一个重要作用在于维持魈酸平衡，艟酸合成是胆固酵从体 内清除的一个主要途径，大约有5 0 分泌的胆固醇会转化成初级胆酸一即胆汁酸和鹅胆酸 ( c h e n o d c o x y c h o l i ca c i d ) 。从胆固醇合成胆酸的关键酶有胆固醇7 q 羟化酶( c h o l e s t e r o l 7 a - h y d f o x y l a s c ，c y p 7 a 1 ) 类固醇2 7 一羟化酶( s t e r o l2 7 - h y d r o x y i a s c , c y p 2 7 ) 和类固醇1 2 羟化酶 ( s t e r o l1 2 a - h y d r o x y l a s e ，c y p 8 b i ) 在啮齿类动物中，胆固醇的积累会导致胆酸合成的增加。这是因为胆固醇增加后，氧化圃醇 的量增加了，氧化固酵可以激活l x r a 受体诱导c y p 7 a i 的表达，l r i t ，1 在这一过程中作为一个 感受态因子( c o m p e t e n c ef a c t o r ) 发挥作用。另一方面，肝脏中胆酸的增多会澈活f x r 受体的表达， 后者激活s h p 的转录，而s h p 蛋白的增多会抑目# j l r h 1 的活性，进而抑$ j j c y p 7 a i 和c y p 8 b i 的表 达( l uda 1 2 0 0 0 ；g o o d w i n 或a 1 2 0 0 0 ；d e lc a s t i l l o - o l i v a r e se ta 1 2 0 0 0 ) 。但这一反馈途径可能具有物 种特异性( d e lc a s t i l l o - o l i v a r e se a 1 2 0 0 4 ) 。 在小肠内。食源的胆固醇与乳糜微粒结合并以游离态胆圃醇被吸收。在这里由胰腺分泌的 羧基酯脂肪酶( c a d o x y lc s t c tl i p a ，c e l ) 催化胆固醇酯水解。而人类c e l 基因启动子上的l i c h - 1 r e 序列说明c e l 也是l r h 1 的靶基因之一( f a y a r dc ta 1 2 0 0 3 ) 。 大约有9 5 的胆酸通过肠细胞( e n t e r o c y t c s ) 的重吸收经由门静脉回到肝脏，这个过程叫做 肠肝循环( e n t e r o h e p a t i cc i r c u l a t i o n ) ，该过程受到众多核受体的调节，其中就包括l r h 一1 。胆酸 3 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 从肠腔通过被动扩散或者通过回肠顶点钠依赖的b a 运输蛋白( a p i c a lt m d i u m - d e p e n d e n tb a 仃a p o n e f ；a s b t ) 主动运输进入肠细胞。在肠细胞的基侧( b a s o l a t e r a l ) 膜上，多药物抗性蛋 白3 ( m u l f i d r u g - r e s i s t a n c ep r o t e i n3 。枷肿3 ) 将b a 送入血液( f r a n c i se ta 1 2 0 0 3 ) 。其中a s b t 的表达受b a 的负反馈调控，这一调控由l r h 1 介导的c y p 7 a i 的表达实现，但相同的机制是 否在人体内存在还不得而知( c h e ne t a l 2 0 0 3 ) 面m r p 3 在人肠细胞中的表达也受b a 调控， 这种调控也必须有l r h 1m r n a 的帮助( i n o k u c h ic ta 1 2 0 0 1 ) ，且l r h 1 必须与m r p 3 基因启 动子上的两个l r h 1r e 序列结合。另外，在肝细胞中l r h - i 也调控m r p 3 的表达。可见，l r h 1 在维持胆酸平衡与肝肠循环中发挥重要作用。 1 3 3l r h 1 在卵巢中的研究 l r h 1 在卵巢中的表达是d e e k 等2 0 0 0 在卵巢功能研究中意外发现的( d e e k e t a l 2 0 0 0 ) ，目前 已发现在其他物种的卵巢中l r h 一1 也有大量的表达( b o e d o o o me ta 1 2 0 0 0 ) ，且表达主要集中在卵 泡颗粒细胞和妊娠期的黄体细胞中。 虽然人们对l r h 1 基因在卵巢中的功能还不很清楚，但我们知道胆固醇是卵巢类固醇激素合 成的主要原料，而且也是通过s r - b i 受体进入类固醇合成组织的。胆固醇在卵巢内被卵泡和黄体 内的类固酵合成酶类合成雄激素雌激素和孕酮等类固醇激素。在大多数哺乳动物中，胆固醇在 l h 的作用下由鞘膜内层细胞合成雄激素。在这个过程中，胆固醇支链裂解蛋白 ( c h o l e s t e r o l - s i d e - c h a i n - c l e a v a g e p r o t e i n ，c y p l l a i ) 将胆固醇催化成孕烯醇酮。接着，型3 p 羟 基类固醇脱氢酶( 3 h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e t y p e i i h s d 3 8 2 ) 将孕烯醇酮催化成孕酮 ( p r o g e s t e r o n e ) 。然后，1 7 昏羟化酶 1 7 a - h y d r o x y l a s e ) 将孕酮转化成雄激素( a n d r o g e n s ) 这些 雄激素( 主要是雄烯二酮和睾酮) 扩散进入卵泡腔，并：芷f s h 和c y p l 9 的作用下变成雌激素 ( e l i s a b e t he ta 1 2 0 0 4 ) 。 在发育卵泡内，s r - b i 表达于鞘膜细胞而非颗粒细胞腔。s r - b i 在颗粒细胞中的表达仅限于排 卵前的l h 峰之后，这与此时l r h l 的高表达相一致( s c h o o n j a n sc ta 1 2 0 0 2 ；c a o e t a l 1 9 9 7 ) 。在颗 粒细胞和黄体细胞中由芳香化酶催化生成的雌激素调控动情周期和排卵，以及l h 受体的生成。颗 粒细胞中大量表达的l r h 1 也极有可能对c y p l 9 的表达有重要作用，这一点由两个基因的表达模 式也可以得到佐证，在舜泡的早期发育阶段，l r h 1 的表达要先于c y p l 9 的表达；在妊娠期的颗 粒细胞和黄体细胞中两者也呈现重叠表达模式。说明可能是l r h 一1 在这些细胞里调控s r - b i 和 c y p l 9 的表达，进而调控雌激素的生物合成的。再加上最近p e n g 等人证明，在黄体中是l r h 1 调 控h s d 3 8 2 的表达( p e n g e ta 1 2 0 0 3 ) ，更说明在卵巢中l r h 1 有重要的作用。 1 4 转基因技术 1 4 1 转基因载体构建 转基因载体主要分为用于原核注射的载体和用于基因打靶的打靶载体，在这基础上科学家们 4 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 往往又根据自己的需要来设计一些能够进行时空特异性表达或人工调控表达的载体，以获得更好 得表达模式。这里主要论述常规原核注射用表达载体的一般要素。 ( 一)启动子 根据不同的实验目的，科学家们可以选择不同的启动子来启动目的基因的表达 如果要生产广泛表达的转基因小鼠，就可以使用一些持家基因或病毒基因的启动子，这些启 动子包括：b - - a c t i n 启动子( b a l li n ge ta i 1 9 8 9 ；b e d d i n s t o n ge ta i 1 9 8 9 ) ，巨细胞病毒 ( c y t o m e g a l o v ir u $ c w ) 增强子一鸡b a c t i n 启动子组合( n i w ae ta 1 1 9 9 1 ) ，小鼠金属 硫蛋白( m e t a i i o t h i o n e l n ) 启动子( p a i m i t e re ta 1 1 9 8 3 ；1 w a m o t oe ta i 1 9 9 1 ) 小鼠砌筘r 启动子( m e t r l a i je ta i 1 9 9 0 ；t a m & t a n1 9 9 2 ) 组蛋白h 4 启动子( c h o ie ta i 1 9 9 1 ) ，r o s a 2 6 位点启动子( k i s s e r b e r t he ta i 1 9 9 9 ) 。被上述调控元件介导的基因表达在很大程度上依赖于 随机整合的位点。因此需要筛选许多的转基因鼠系才能获得理想的表达品系。 除此以外，如果要生产只在某个组织特异性表达或某个特定的发育阶段特异性表达的转基 因小鼠，就需要利用组织特异性表达的基因的启动子，或者在构建的载体里引入可调控序列通 过药物诱导表达，如它莫西芬t a m o x i f e n ) 和r u - - 4 8 6 诱导的重组酶表达( g o ue ta 1 2 0 0 2 ) 和 四环索( t e t r a c y c l i n e ) 诱导的基因表达( g o s s c nc ta 1 1 9 9 5 ) 。由于本实验希望获得只在卵巢颗 粒细胞中表达外源基因的小鼠。所以应该选择仅在该细胞系表达的基因的启动子作为转基因载 体的启动子 a m h r i i ( a n t i - m u l l e r i a uh o r m o n er e c e p t o rt y p e i l l 属于t g f - b e t a ( t r a n s f o r mg r o w t hf a c t o r b c 扭) 超家族中的一员，是a m h ( a n 6 一m u l l e r i a nh o r m o n e ) 激素的两个受体之一a m h 激索作用 于在缪勒氏管周围表达的a m h r i 和a m h r i i ，使得缪勒氏管在向雄性发育的个体中退化 a m h r i i 主要在胚胎缪勒氏管上皮周围的问充质细胞表达。成年动物体内主要在睾丸支持细胞 及卵巢颗粒细胞中表达( t s u j i ，me l a l 1 9 9 2 ) ，有人将c r e 重组酶序列敲入到a m h r 2 基因组的第五 个外显子后面，得到了在卵巢颗粒细胞高特异性表达c r e 重组酶的转基因小鼠( s o a z i k p j i b ，2 0 0 2 ) 。 尽管当今的分子生物学技术可以几乎任意地操作d n a 片断，对其进行修饰、扩增及移动， 但d n a 的片段越长这些操作也就越困难。例如。如果需要在片段两端引入酶切位点，那么片 段越长可以选择的酶切位点就越少，同时恝通过传统p c r 的方法扩增获褥大量的长片段d n a 也就越困难，因为常用的d n a 聚合酶的保真性一般都在1 0 5 级，用d n a 聚合酶体外扩增l o k b 以上的片段就几乎无法避免出现碱基突变。而且d n a 片段越长，连接的效率也就越低。最近， 由p e n t a ol i u 等人( p e n t a ol i u ，n a n c ya ，e c t ，2 0 0 6 ) 发展了一种体外d n a 重组技术，大大提高 了操作大片段d n a 的效率。该技术主要利用一种经改造的大肠杆菌e l 3 5 0 ，该菌株在3 2 培养 时可进行正常的质粒扩增，在4 2 c 培养1 0 1 5 分钟后可诱导 噬菌体r e d 蛋白表达，该蛋白可 介导同源d n a 重组，这个过程叫做r e t r i e v a l “套取”。这样可以用很短的d n a 片段( 5 0 5 0 0 b p ) 把与其同源的序列之间的很长的d n a 片段r e t r i e v a l 下来，从而减少了p c r 扩增和酶切连接带 来的不便与突变的风险。 ( 二) 目的基因 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献缘述 通常，使用c d n a 基因来构建一个融合基因表达载体生产转基因小鼠比使用基因组d 眦容易 因为基因组d n a 通常较大而不容易操作但是使用c d n a 的表达结构无论是表达的频率还是表达的 水平都比使用包含外显子和内含子的基因组d n a 要低得多( b r i n s t e re ta f 。1 9 8 8 ) 这是因为 内含子中的增强子( e n h a n c e r ) 在起作用，但不是唯一的原因。c h o i ( 1 9 9 1 ) 的小组及p a i m i t e r ( 1 9 9 4 ) 的小组在c d 融表达结构中加入异种( h e t e r o l o g o u s ) 内含子可以往表达水平成倍增加 但这种结果可能是基因特异性的。因而当表达水平很重要时，应考虑以下几种方案： 1 如果基因组d n a 的尺寸是可以操作的那就使用基因组d m 而不使用c d n a 。 2 使用含有部分c d n a 序列、外显子及内含子的迷你基因( h a m m e re ta i 1 9 8 7 ) 3 把外源外显子( e x o g e n o u se x o f l s ) 序列加入到c d n a 序列当中去( c h o ie ta i 1 9 9 1 ；p a l m i t e r e ta i 1 9 9 1 ) ( 三) 多聚腺嘌呤化信号( p o l y a 信号) 真核细胞中，m r n a 的3 p o l y a 的添加是r n a 转录后修饰的重要步骤，其生物学意义主要是 防止核酸外切酶对m r n a 的剪切，延长n d t , n a 的半衰期，以提高基因的表达量。在转基因载体结 构末端加入多聚腺嘌呤化信号有助于外源基因转录产物的稳定表达，因此本实验利用p e g f p - c 3 质粒中g 即序列后原有的3 1 1 4 0p o l y a 来稳定转基因载体的表达结构。 ( 四) 报告基因 为了研究目的基因，可以构件一个含有目的基因和报告基因的融合载体，然后生产转基因小 鼠。已经在转基因小鼠中成功使用的报告基因包括大肠杆菌的i a c z 基因( 6 0 r i n ge ta i 1 9 8 7 ) ， 氯霉素乙酰基转移酶( c h l o r a m p h e n i c a i a c e t y i t r s n s f e r a s e ，c a t ) 基因( o v e r b e e ke ta 1 1 9 8 5 ) 、 萤火虫的荧光素酶基因( l ir ae ta i 1 9 9 0 ；l e e 酞a 1 1 9 9 2 ) 、热稳定的人胎盘碱性磷酸酶 ( h e a t - r e s i s t a n th u m a n p i a c e n t a i l k a i n ep h o s p h a t a s e a l p p ) 基因( d e p r i m o e ta i 1 9 9 6 ) 、 绿色荧光蛋白( g r e e nf i u e r e s e n c ep r o t e i n ，g f p ) 基因( o b a k ee ta i 1 9 9 6 ) 或者它的衍生基 因。l a c z 基因特别适合用来研究小鼠胚胎发育过程中的基因表达，因为整个发育到怀孕中期的 小鼠胚胎都可以用染色的方法来检测口一半乳糖甘酶( b g a l a c t o s i d a s e ) 活性在小鼠胚胎发 育的后期。p 一半乳糖甘酶活性可以在合适的组织中通过染色观察到。除此之外，还有许多9 一半 乳藉甘酶基因的变种可以用来对目的基因的表达进行细胞定位。同t a c z 基因相似， l p p 基因也 是可以在细胞水平上检测再胚胎或组织上表达的一个优良的报告基因。a l p p 基因比i a c z 更灵敏 一些，但是在染色时不容易染到组织内部。c a t 和荧光素酶都容易被检测，灵敏度高而且可以用 来定量，但它们不能用来检测空间表达模式。近来最为广泛应用的是g f p 基因及其变种。g f p 基 因来源于一种水母( a e q u o r e av i c t o r i a ) 。它的表达产物可以在异种中被适当的光激发出荧光。 经过增强突变，被激发的荧光得以加强。增强突变的变种还可以激发出青色( c y a n ) 或者黄色的 荧光。使用这几种荧光蛋白作报告基因在观察时不需要对细胞进行处理，活细胞就可以观察。 当然，报告基因并不是一个转基因载体所必需的元素，但是本实验希望不仅可以方便的检测 到转入的基因，而且可以在以后的实验中观察m l r h - i 蛋白在活细胞中的动态分布及活动情况，因 此g f p 基因成为首选。另外，由于l r h 1 是小鼠的内源性基因，将g f p 基因外源l r h 1 基因融合还 有助于区分内外源l r h 1 。 6 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 4 2 生产转基因小鼠的方法 ( 一) 原核注射法 原核显微注射法就是直接把b n a 注射到受精卵的原核中，这是目前应用最广泛也是最成功的 一种方法早在1 9 9 8 年，l i n 首先证实使用显微操作系统把合适的玻璃针插入到小鼠的受稽卵 后，小鼠的受精卵存活了下来。接下来，l i n 又把牛血清白蛋白( 陷a ) 注入到小鼠的受精卵， 然后把经过注射的受精卵移植到假孕母鼠受体，并成功的得到了后代。l i n 的技术在当时还是相 当先进的，因为那个时候重组d n a 技术还没有诞生。1 9 8 0 年，美国科学院院报( p n a s ) 报导了 g a r d o n ( 1 9 8 0 ) 等人通过原核显微注射成功的得到了转基因小鼠的工作第二年，有六个实验室 先后获得了能够整合、传代并表达外源基因的转基因小鼠( b r i n s t e re ta i 。1 9 8 1 ：c o s t a n t i n i & l a c y l 9 8 1 ； g o r d o n r u d d i e ，1 9 8 1 ：h a r b e r se ta i ，1 9 8 1 ：w a g n e re ta i ，1 9 8 1 ；w a g n e r e ta i 。1 9 8 1 ) 今天，这种试验方法已经很成熟，世界上的许多实验室都已经建立起了一套标 准的试验程序。近年，大片段d n a 的注射也开始变得普遍( c o p e l a n de ta 1 ，2 0 0 1 ) 酵母人 工染色体( y a c s ) d n a ( s c h e d ie ta i ，1 9 9 2 ；p e t e r s o ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 、p 1 噬菌体来源的人 工染色体( p a c s ) d n a ( s t e r n b e r g ，1 9 9 2 ) 和细菌人工染色体( 8 a c s ) d n a ( a n t o c he ta i ，1 9 9 7 ； n i e l s e ne ta 1 ，1 9 9 7 ；y a n ge ta i 。，1 9 9 7 ) 都成功的用于显微注射生产转基因小鼠。这些方法 能够得到大约1 0 - - 4 0 的染色体稳定整合阳性小鼠。g ir fl a d o ( 2 0 0 1 ) 对此写了一篇关于这方面的 很全面的综述。 通过原核显微注射方法得到的转基因小鼠。外源基因的整合是随机的( 8 r i n g s t e r ，1 9 8 9 ) ， 整合的位点无法预测，整合的拷贝数范围在1 一几百之间，在一定程度上是可以通过注射的d n a 浓 度来控制的( e ll i se ta 1 ，1 9 9 7 ) 因此，每一只转基因原代小鼠( f o u n d e r ) 都会有一个独 特的整合位点、拷贝数和整合模式。无论注射的是线性化载体还是环型载体，最终都会得到多拷 贝的整合。现在认为原因是当线性化的载体注入受精卵后会迅速的环化，多个载体之间会发生同 源重组，然后整合到染色体上( b r i n s t e re ta i ，1 9 8 1 。1 9 8 2 ) 。线性化载体的末端类型对整合 的频率和结构都没有影响。这些线性化载体，都是以首尾相连的形式整合到基因组上( b ri n s t e r e ta i ，1 9 8 1 ) 大多数情况下外源基因都是整合到染色体的单一位点，只有在很少的情况下才 会偶然整合到多条染色体上( l a c ye ta1 ，1 9 8 3 ) 如果整合发生在一只原代小鼠的不同的染 色体上面，那么在它的后代中就可以得到不同的转基因小鼠品种( 1 i n e ) 整合通常会发生在注 射后和第一次卵裂前。但是，大约有2 0 - - 3 0 的整合是发生在第一次卵裂之后的，这种整合方式 得到的转基因小鼠是嵌合体( w ii k i ee ta i ，1 9 8 6 ) 。因此这些小鼠只有一部分体细胞和生殖 细胞带有转入的基因。当用嵌合体小鼠和非转基因小鼠杂交时，只有不到5 0 的后代带是转基因 的 ( 二) 反转录病毒法 使用反转录病毒载体感染小鼠胚胎也能生产转基因小鼠。不仅是原核期受精卵，即使是附植 前后的小鼠胚胎都可被自然的或者人工重组的反转录病毒感染，反转录病毒的基因组会稳定的整 7 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 i i i i i i i i i i i i i i i i i 宣i i i 葺i i i 宣i 宣i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 合到小鼠的基因组上( j a e n i s c h ，1 9 7 6 ；j a