（内科学专业论文）维生素b1对百草枯中毒大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要3 研究论文维生素b 1 对百草枯中毒大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究 前言6 月l j 舌 材料与方法7 结果1 3 附图16 附表2 4 讨论2 6 结论2 9 参考文献2 9 综述百草枯中毒救治的研究现状31 致谢4 2 个人简历4 3 中文摘要 维生素b l 对百草枯中毒大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究 摘要 目的：本研究通过建立百草枯( p a r a q u a t ，p q ) 中毒大鼠模型，观察 维生素b 1 对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。 方法：6 6 只健康成年雄性s d 大鼠随机分为四组：正常对照组 ( c o n t r o l ，n c 组) 6 只、百草枯染毒组( p a r a q u a t ，p q 组) 2 0 只、百草 枯+ 低剂量维生素b1 组( p a r a q u a t + l o w d o s ev i t a m i nb1 ，p q + l v b 组) 2 0 只和百草枯+ 高剂量维生素b 1 组( p a r a q u a t + h i g h d o s ev i t a m i nb 1 ， p q + h v b 组) 2 0 只。n c 组给予l m l 生理盐水灌胃，0 5 h 后给予l m l 生 理盐水灌胃；p q 组给予1 0 0 m g k gp q 灌胃，0 5 h 后给予l m l 生理盐水灌 胃；p q + l v b 组给予l o o m g k gp q 灌胃，0 5 h 后给予1 0 0 m g k g 维生素b 1 灌胃；p q + h w 组给予1 0 0 m g k gp q 灌胃，o 5 h 后给予2 0 0 m g k g 维生素 b 1 灌胃。在染毒的第1 、3 、7 d 分批处死动物。心脏采血，3 7 放置2 h ， 离心取上清液，常规方法取肺组织。分别测定血清和肺组织匀浆中超氧化 物歧化酶( s o d ) 、丙二醛( m d a ) 含量以及肺组织中羟脯氨酸( h 忡) 含量； 选取肺脏、肾脏进行常规h e 、m a s s o n 染色，观察病理组织学变化。免 疫组织化学方法检测转化生长因子p l ( t g f 1 3 1 ) 在各组大鼠肺组织中的 表达。 结果：1 大鼠中毒表现：一般于染毒后2 小时内各系统出现明显中毒 症状，在1 3 天最为明显。 2 血清中s o d 、m d a 含量：实验期间各时间点p q 组血清s o d 活 力明显低于n c 组( p o 0 5 ) 。随着时间的延长，p q 组血清s o d 活力下 降，d 7 较d 1 明显下降，差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。随着时间的延 长，维生素b 1 两个剂量组大鼠血清s o d 活力呈现下降趋势。在相同时 间点均高于p q 组，具有统计学意义( p o 0 5 ) 。在第7 天p q + h v b 组血 清s o d 活力高于p q + l v b 组，具有统计学意义( p o 0 5 ) 。各组大鼠血 清m d a 含量与s o d 活力呈现相反的规律。 3 肺组织匀浆中s o d 、m d a 含量：实验期间各时间点p q 组肺组织 s o d 活力明显低于n c 组( p o 0 5 ) 。随着时间的延长，p q 组肺组织s o d 中文摘要 活力下降，d 7 较d 1 明显下降，差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。随着时： 间的延长，维生素b 1 两个剂量组大鼠肺组织s o d 活力呈现下降趋势。 在相同时间点均高于p q 组，具有统计学意义( p o 0 50 在第7 天p q + h v b 组肺组织s o d 活力高于p q + l v b 组，具有统计学意义( p o 0 5 ) 。第7 天各组h y p 高于n c 组( p 0 0 5 ) 。 p q + h v b 组h y p 值均低于p q 组和p q + l v b 组，差异具有统计学意义 ( p o 0 5 ) 。 5 肺组织病理学改变：大体标本观察，n c 组肺脏基本正常。p q 组 肺脏肿胀变大，表面呈深暗红色，有明显的出血点或淤血。第7 d 局部肺 组织变苍白，出现灰白色凹凸不平病灶。维生素b 1 干预后病变有所减轻， 且以p q + h v b 组明显。光镜观察：n c 组肺泡结构完整，正常。p q 组可 见肺泡出血、纤维蛋白渗出，肺泡壁毛细血管扩张及炎性细胞浸润。维生 素b 1 干预后病变有所减轻，且以p q + h v b 组明显。m a s s o n 染色可见正 常组很少有蓝绿色胶原纤维沉积在支气管壁及肺泡间隔，而p q 组第7 天 时较多蓝色胶原纤维沉积与支气管壁及肺泡间隔，p q + h v b 组蓝染胶原 沉积较少。 6 免疫组化结果：n c 组t g f p l 基本没有表达。p q 组t g f d l 表达 在染毒后7 d 开始明显，p q + l v b 组和p q + h b v 组病变较轻。 7 肾组织病理变化：大体标本呈暗红色，饱满，质不硬，切面皮髓分 界清晰。光镜：n c 组可见肾小球及肾小管结构清晰，小管内未见管型及 颗粒。p q 组可见肾小管上皮细胞肿胀，伴空泡和颗粒变性。p q + l v b 组 和p q + h b v 组病变较轻。 结论：1 p q 中毒后大鼠体内出现明显氧化应激反应，导致急性肺损伤， 进而出现肺纤维化。 2 维生素b 1 可以减轻百草枯中毒后所致的弥漫性肺损伤，抑制脂质 过氧化，改善肺纤维化，作用机制也许与维生素bl 拮抗百草枯毒性有关。 关键词：百草枯；维生素b 1 ；急性肺损伤；氧自由基；大鼠 英文摘要 e x p e r i m e n t a ls t u d yo nt h ep r o t e c t i v ee f f e c to f v i t a m i n b1 a g a i n s tp a r a q u a t - - i n d u c e da c u t el u n gi n j u r yi nr a t s a b s t r a c t p u r p o s e ：n es t u a yw a st o e s t a b l i s ham o d e li n d u c e db yp a r a q u a t p o i s i o n i n gi nr a ta n do b s e r v et h ep r o t e c t i v ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo f v i t a m i n b1i nr a t sw i t hp a r a q u a t - i n d u c e da c u t el u n gi n j u r y m e t h o d ：s i x t y s i xa d u l th e a l t h ym a l es p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t o f o u rg r o u p so fd i f f e r e n tt r e a t m e n t sd e s i g n a t e da s ： n o r m a lc o n t r o l g r o u p ( n cg r o u p ，6 ) p q a d m i n i s t r a t i o n g r o u p ( p q g r o u p ，2 0 ) ，p a r a q u a t + l o w d o e s v i t a m i nb1 g r o u p ( p q + l v bg r o u p ，2 0 ) a n d p a r a q u a t + h i g h d o e sv i t a m i nb 1g r o u p ( p q + h v bg r o u p ，2 0 ) n cg r o u pw a s g i v e ns o d i u mc h l o r i d e lm lb yo r a la d m i n i s t r a t i o n ，a f t e ro 5 hw a sg i v e n s o d i u mc h l o r i d elm lb yo r a la d m i n i s t r a t i o na g a i n ；p qg r o u pw a sg i v e n p a r a q u a t 10 0 m g k gb yo r a la d m i n i s t r a t i o n ，a f t e ro 5 hw a sg i v e ns o d i u m c h l o r i d elm lb yo r a la d m i n i s t r a t i o n ；p q + l v bg r o u pw a sg i v e np a r a q u a t 10 0 m g k gb yo r a la d m i n i s t r a t i o n ，a f t e ro 5 hw a sg i v e nv i t a m i nb1 lo o m g k g b yo r a la d m i n i s t r a t i o n ；p qg r o u pw a sg i v e np a r a q u a t 10 0 m g k gb yo r a l a d m i n i s t r a t i o n ，a f t e r 0 5 hw a sg i v e nv i t a m i nb1 2 0 0 m g k gb y o r a l a d m i n i s t r a t i o n a f t e re x p o s u r e ，a n i m a l sw e r es a c r i f i c e di nb a t c h e so i ld a y sl ， 3 ，7 a f t e rd i s l o d g e df r o mh e a r t ，t h eb l o o dw a sp l a c e di n3 7 w a t e r b a t hf o r 2 ha n dt h es u p e r n a t a n tw a st a k e na w a ya n dr e t a i n e di ne p p e n d o r ft u b e s l u n gt i s s u e sw e r eo b t a i n e dw i t hr o u t i n em e t h o d t h e nt h e a c t i v i t i e so f s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) b o t hi ns e r u m a n d l u n g h o m o g e n a t eo fr a t sa n dt h ec o n t e n t so fh y p e r t r o p h y ( h v p ) i nl u n g w e r e m e a s u r e d l u n ga n dr e n a lt i s s u e sw e r ed y e di nh ea n dm a s s o n m e t h o d st o i n v e s t i g a t et h eh i s t o p a t h o l o g i cc h a n g e s 1 1 1 el e v e lo ft g f 一1 3l i nl u n gt i s s u e w e r ed e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s r ys t a i n i n g r e s u l t ：1i n t o x i c a t i o nm a n i f e s t a t i o n s ：i n t o x i c a t i o nm a n i f e s t a t i o n s o c c u r r e di nr a t s2h o u r sa f t e rp qa n dw a sm o s ts e r i o u sd u r i n gt h ef i r s tt h r e e 3 英文摘要 d a y s ，。 ，t 2t h es o da n dm d ac o n t e n ti n p l a s m a ：t h es o da c t i v i t yw a s o b v i o u s l yl o w e ri ng r o u pp qt h a nt h a ti ng r o u pn c ( p 0 0 5 ) i tw a sa l s ol o w e r a td 7t h a nt h a ta td l ( p o 0 5 ) a n di tw a s o b v i o u s l yh i g h e ri ng r o u pp q + h v b a n dp q + l v bt h a nt h a to fi ng r o u pp q ( p o 0 5 ) i tw a sh i g h e ri ng r o u p p q + h v bt h a nt h a ti ng r o u pp q + l v b a td 7( p o 0 5 ) t h ec o n t e n to fm d a w a sc o n t r a d i c t o r yw i t ht h es t a t eo f a c t i v i t yo fs o d 3t h es o da n dm d ac o n t e n ti nl u n gh o m o g e n a t e ：t h es o d a c t i v i t yw a s o b v i o u s l yl o w e ri ng r o u pp qt h a nt h a ti ng r o u pn c ( p 0 0 5 ) i tw a sa l s ol o w e r a td 7t h a nt h a ta td l ( p o 0 5 ) a n di tw a s o b v i o u s l yh i g h e ri ng r o u pp q + h v b a n dp q + l v bt h a nt h a to fi ng r o u pp qa td 7 ( p 0 0 5 ) i tw a s h i g h e ri ng r o u p p q + h v bt h a nt h a ti ng r o u pp q + l v b ( p 0 0 5 ) t h ec o n t e n to fh y p w a s h i g h e ri ng r o u p st h a nt h a ti ng r o u pn c ，a n di t h a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo n l ya td 7 ( p o 0 5 ) a n di tw a sl o w e ri ng r o u p p q + h b v t h a nt h a ti ng r o u pp qo rp q + l v b ( p o 0 5 ) 5p u l m o n a r ym o r p h o l o g i ca n dp a t h o l o g i cf i n d i n g s ：g r o s sa p p e a r a n c e ： l u n gs a m p l e si nn cg r o u pw a sn o r m a l t h el u n go fr a t si np qg r o u pw e r e s w e l lw i t he x t e n s i v ed a r kr e dp a t c h yb l e e d i n gf o c u s w h i l ei n p q + h v b g r o u pw a s b e t t e rt h a np qg r o u pa f t e rv i t a m i ni n t e r v e n t i o n l i g h tm i c r o s c o p i c f i n d i n g s ：i nn cg r o u pa l v e o l a rs t r u c t u r ew a si n t e g r a t e da n dn o r m a l i np q g r o u pa n dp q + l v bg r o u p ，a l v e o l a rc o l l a p s e da n dl e a k a g eo fb l o o da n d f i b r o p r o t e i ni n t ot h ea l v e o l a rs p a c ec o u l db es e e n t h ec a p i l l a r yo fa l v e o l a r w a l ld i l a t e da n dc o n g e s t e da n dt h ea l v e o l a rs e p t aw i d e n e d s u r r o u n d i n gt h e v e s s e l sa n dt r a c h e a ，t h e r ew a sd i f f e r e n td e g r e eo fe d e m aa n di n f l a m m a t o r yc e l l i n f i l t r a t i o n a l lt h ep a t h o l o g i ca l t e r a t i o n s p a l l i a t e do b v i o u s l yi na o + h v b g r o u p m a s s o ns t a i n i n g ：i nc o n t r o lg r o u pt h e r ew e r eas m a l lq u a n t i t yo f c o l l a s g e nf i b e rs t a i n e dg r e e no rb l u eo nt h eb r o n c h u sd i s s e p i m e n ta n dt h e s e p t a ls u r f a c e p r o l i f e r a t i o no ft h es t a i n e dc o l l a g e nf i b e r sa n dt h i c k n e s so ft h e 4 英文摘要 a l v e o l a rw a l l ，w e r es e e ni np qg r o u pa t7d a ya n ds i g n i f i c a n ta m e l i o r a t i o no f f i b r o s i sw e r ef o u n di np q + h v bg r o u p j 6i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i n g ：n cg r o u pb a s i c a l l yd i dn o te x p r e s s t g f p 1 t h ei n t e n s i t yo ft h ee x p r e s s i o nt g f - 1 31 w a ss i g n i f i c a n t l yi np qa n d p q + l v bg r o u pt h a nt h a ti nt h eo t h e rt w og r o u p sa t7 d 7n e p h r i d i a lt i s s u ep a t h o l o g i c a lc h a n g e ：g r o s sa p p e a r a n c ew a sn o r m a lo n t h ew h o l e l i g h tm i c r o s c o p i cf i n d i n g s ：i np qg r o u pr e n a lc e l l u l a rs w e l l e d ， v a c u o l ea n dg r a n u l a rd e g e n e r a t i o nc o u l db es e e n a l lt h ep a t h o l o g i ca l t e r a t i o n s p a l l i a t e di np q 卜h v b a n dp q + l v b g r o u p c o n c l u s i o n ： 1p qr a t so b v i o u si nt h es t a t eo fo x i d a t i v es t r e s s ，l e a dt oa c u t el u n g i n j u r y , t h e nt h ep u l m o n a r yf i b r o s i se m e r g i n g 2v i t a m i nb1r e d u c et h ed i f f u s e di n j u r yo fl u n gc a u s e db yp q ，i n h i b i t i n g l i p i dp e r o x i d a t i o n ，i m p r o v i n gp u l m o n a r yf i b r o s i s ，t h em e c h a n i s mo fa c t i o n w o u l db ec o n c e r n e dw i t ht h ea c t i o no fv i t a m i n b1a g a i n s tt o x i c i t yo fp q k e yw o r d s ：p a r a q u a t ；v i t a m i nb 1 ；a c u t el u n gi n j u r y ；o x y g e nf r e e ， r a d i c a l s ；r a t s ，_ _ _ - - _ _ _ _ _ _ - l - _ - _ - _ _ - - _ _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ - l _ - - _ _ - - _ - i _ _ - _ i _ - - _ _ _ - - - - _ _ _ - - - - _ - _ _ _ _ - - _ - l _ _ - - _ - _ - _ _ i _ _ i _ _ 一 5 研究论文 维生素b l 对百草枯中毒大鼠急性肺损伤保护作用的疗效观察 - - _ 一 莉吾 百草枯( p q ) 是一种世界广泛使用的除草剂，其化学名称l ，1 - - 甲基4 ，4 联吡啶，属有机杂环类化合物，分子式为c 1 2 h 1 4 n 2 2 c 1 ，相对 分子质量2 5 7 2 ，常用制剂为2 0 水溶液。p q 可经皮肤、呼吸道、消化 道吸收进入人体，口服吸收率较低，约占5 1 0 ，属高等毒性，人经 口致死量约3 0 - - - ，4 0 m g k g ，进入血液后几乎不与血浆蛋白结合，于吸收 后1 , - - - 4 j x 时达到血浆浓度峰值，并且由于被组织吸收及肾脏排泄其血 浆浓度很快下降，在体内可分布于各种组织和体液中，主要集中在肺及 骨骼肌中。p q 中毒可引起人体多器官损害，超大剂量的p q 中毒患者多 在短期内死于多器官功能衰竭，中、重度中毒如能度过急性期，以后 则出现不可逆的肺纤维化，后期多死于肺功能衰竭。目前对于百草枯 中毒的治疗主要是支持性的，迄今为止没有特异性解毒剂和有效的治 疗被证实。 维生素b i ( v b l ) ，化学名称为氯化4 甲基3 【( 2 甲基4 氨基5 嘧啶 基) 甲基】5 ( 2 一羟基乙基) 噻唑翁盐酸盐。分子式：c 1 2 h i 7 c l n 4 0 s h c l ， 分子量：3 3 7 2 7 。维生素b 1 与百草枯的化学结构式同为季胺类型，国 内有大剂量维生素b 1 治疗成功抢救3 例p q 中毒患者的报道【l 】，推测维 生素b 1 可能拮抗组织中的百草枯，且其本身的生化作用对中毒患者也 有益处。 本研究通过动物实验分析维生素b 1 对百草枯毒性大鼠引起的急 性肺损伤的保护作用及其机制。 研究论文 材料与方法 1 实验动物和材料 1 1 实验动物的选择 本实验选用健康成年雄性s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠6 6 只，体重2 0 0 - - 2 5 0 9 ，由河北医科大学实验动物中心提供。所有大鼠在相同饲料和饲养 条件下饲养，让其自由进食饮水，每日更换饮水、饲料，保持生活环境通 风及清洁卫生；笼子、垫料及饮用水均经过灭菌处理；室温2 l 2 3 ， 相对湿度控制在4 0 左右，自然采光。在饲养期间，所有动物均严格遵守 实验动物伦理道德法则，保证所有实验动物享有应有的权利 1 2 主要试剂 2 0 百草枯先正达南通作物保护有限公司批号s n a 9 c 0 9 4 9 7 维生素b l山东方明药业股份有限公司批号1 0 0 4 0 4 7 超氧化物歧化酶( s o d ) 试剂盒南京建成生物工程研究所 丙二醛( m d a ) 试剂盒 南京建成生物工程研究所 羟脯氨酸试剂盒南京建成生物工程研究所 考马斯亮蓝检测试剂盒南京建成生物工程研究所 t g f 1 3 1 试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 1 3 主要仪器与设备 7 2 2 型紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司 台式离心机北京医用离心机设备厂 s s w 型恒温水浴箱上海博讯实业有限公司 恒温干燥箱上海跃进医疗仪器厂 组织匀浆器石家庄拜昂生物技术有限公司 b s 2 2 4 s 型电子天平 s a r t o r i u sr 2 0 0 d ，美国 冰箱( - 7 0 c ) t h e r m od w - 8 6 l 3 8 6 电子天平美国梅特勒公司 2 实验方法和步骤 2 1 实验动物分组 健康雄性s d 大鼠6 6 只随机分为四组：正常对照组( n c 组) 6 只、 百草枯染毒组( p q 组) 2 0 只、百草枯+ 低剂量维生素b l 组( p q + l v b 组) 研究论文 2 0 只、百草枯+ 高剂量维生素b 1 组( p q + h v b 组) 2 0 只。 2 2 动物模型的建立与药物干预 造模前，各组大鼠禁食水1 0 h ，n c 组给予l m l 生理盐水灌胃，0 5 h 后给予l m l 生理盐水灌胃；p q 组给予1 0 0 m g k gp q 灌胃，o 5 h 后给予l m l 生理盐水灌胃；p q + l v b 组给予1 0 0 m g k gp q 灌胃，0 5 h 后给予1 0 0 m g k g 维生素b l 灌胃；p q + h v b 组给予1 0 0 m g k gp q 灌胃，o 5 h 后给予2 0 0 m g k g 维生素b 1 灌胃。各组大鼠灌胃染毒及给药途中均未发生呕吐、抽搐或未 完全灌入所需药量等情况。 2 3 实验动物饲养与中毒表现观察 造模后，观察实验大鼠中毒反应，即大鼠的进食、饮水、排泄情况， 活动反应程度，如有无精神反应迟钝、鼠毛蓬松、鼠尾紫绀、呼吸困难、 四肢无力、攻击性降低等中毒表现以及存活情况等。 2 4 实验动物的抽血、处死和标本留取 于灌胃后的第1 d 、第3 d 、第7 d 分别处死各组到达各自观察终点的实 验大鼠，收集血液、肺组织及肾组织标本。具体操作步骤如下： ( 1 ) 将待处死的大鼠做好记录； ( 2 ) 处死前用10 水合氯醛3 0 0 m g k g 腹腔麻醉，待麻醉充分后， 将大鼠仰卧于鼠台上固定，胸腹部常规酒精消毒，打开胸腔及腹腔，心脏 采血4 6 m l ，3 7 水浴箱中放置2 h ，3 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 m i n ，取上清， 分装7 0 * ( 2 保存。用于测定大鼠血清s o d 和m d a 含量。 ( 3 ) 分离肺脏，完整取出两侧肺组织，观察肺组织颜色，质地，有 无出血、水肿及梗死灶等大体病理变化；用生理盐水清洗后，滤纸吸干肺 脏表面水分；分离并剪取右肺部分组织，迅速将组织置于磷酸盐缓冲溶液 ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) 中洗去血液后，置于1 5 m l e p 管并迅速 投入液氮中速冻，后置于7 0 c 冰箱保存，用作肺组织h y p 、s o d 和m d a 含量的测定。分离左肺，沿矢状面切开置于盛有1 0 福尔马林的瓶中固定， 进行石蜡包埋组织切片，用作光镜h e 染色、m a s s o n 染色，t g f p 1 的免 疫组织化学染色检查。分离左肾置于盛有1 0 福尔马林的瓶中固定，送病 理科进行石蜡包埋组织切片，用作光镜h e 染色。 2 5 标本检测 2 5 1 血清标本检测 研究论文 2 5 1 1 血清中m d a 含量测定 按试剂盒说明配制试剂 按下表操作： 标准管标准空白管测定管测定空白管 1 0 nm o l m l 标准品( m 1 ) 0 1 无水乙醇( m 1 )o 1 测试样品( m 1 )0 1o 1 试剂一( m 1 ) 0 10 10 10 1 混匀( 摇动几下试管) 试剂二( m 1 )3333 试齐i i = ( m 1 ) l1l 5 0 冰醋酸( m 1 ) l 旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，9 5 c 水浴 4 0 分钟，流水冷却后，离心1 0 分钟( 4 0 0 0 r p m m i n ) 。取上清约2 m l ，5 3 2 n m 处，1 e r a 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。 依公式计算m d a 值 2 5 1 2 血清s o d 含量测定 按试剂盒说明配制试剂 按下表操作 试剂测定管标准管 1 号试剂( m 1 ) 1 01 0 样品( m 1 )o 0 1 蒸馏水( m 1 )o 0 5o 0 5 2 号试剂( m 1 )0 1 o 1 3 号试剂二( m 1 ) 0 10 1 4 号试剂三( m 1 )0 10 1 用漩涡混匀器充分混匀，置3 7 c 恒温水浴4 0 分钟 计算： a 定义：每毫升反应液中s o d 抑制率达5 0 时所反应的s o d 量为一 个s o d 活力单位( b 依公式计算s o d 值 2 5 2 肺组织标本检测 2 5 2 1 肺组织匀浆制备 实验方法按照试剂盒说明书提供的组织匀浆法：取组织块0 2 1 9 在冰 9 研究论文 冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入1 0 m l 的小烧杯，。 内。：用移液枪量取预冷的匀浆介质( o 8 6 冷生理盐水) ，生理盐水：组织 = 1 ：9 ，取总量2 3 的生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块( 操， 作在冰水浴中进行) 。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1 3 冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆， 用内切式组织匀浆机制备( 匀浆时间1 0 秒次，间隙3 0 秒，连续3 5 次， 在冰水中进行) 。 2 5 2 2 肺组织匀浆测m d a 、s o d 含量：方法同血清测定。m d a 加样量 为1 0 匀浆o 1 m l ，s o d 加样量为2 匀浆6 0 山( 预测试发现6 0 山样本量 百分抑制率为4 3 ，符合要求) 。 2 5 2 3h y p 测定 严格按照h y p 试剂盒说明书进行测定，具体步骤如下： 取出冻存右肺叶组织，在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，精确称取 组织湿重6 0 m g 放入有刻度的试管中，准确加水解液l m l ，混匀。加 盖后沸水浴水解2 0 分钟( 水解1 0 分钟时混匀一次，目的使水解更充 分) 。 调p h 至6 0 6 8 左右。 a ) 将各试管流水冷却后，各管加指示剂各1 滴，摇匀； b ) 各管准确加入调p h 甲液各1 0 m l ，混匀( 此时溶液呈红色) ； c ) 用2 0 0 9 l 的加样器吸取调p h 的乙液，向各管内逐滴加入调p h 的乙 液，每滴加入后均混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色，此时液体 p h 值在6 0 6 8 左右； d ) 然后加蒸馏水至1 0 m l ，混匀； e ) 取3 - 4 m l 稀释的水解液加适量活性炭( 约2 0 3 0 m g 左右，以上清液 离心后澄清无色为准) ，混匀，3 5 0 0 r p r n m i n 离心10 m i n ，取上清液l m l 作检测。 操作表 空白管标准管测定管 蒸馏水( m 1 ) 1 0 5l ag m l 标准应用液( m 1 )1 o 检测液( m 1 ) 1 0 试剂一( m 1 ) o 5o 50 5 混匀，静置1 0 分钟 研究论文 050 5 05 l试剂二( m 1 )i ij i 混匀，静置5 分钟 ( m l0505051 试剂三 ) i i i 1 l_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_-_一 按操作表上述混匀，6 0 c 水浴15 m i n ，冷却后，3 5 0 0 r p r n m i n 离心1 0 m i n ， 取上清液在5 5 0 n m 处，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 依公式计算组织h y p 含量 2 5 3 肺组织病理学检查 2 5 3 1 石蜡组织切片的制作方法 a ) 固定：取各组大鼠左肺叶用1 0 中性甲醛液固定2 4 h 。 b ) 脱水：将标本放入磷酸缓冲液内1 2 h ，入以下梯度酒精( 7 5 酒精一8 5 酒精_ 9 5 酒精i 一9 5 酒精i i 一1 0 0 酒精i 一1 0 0 酒精i i 各3 0 m i n ) 脱水。 c ) 透明：二甲苯i 一二甲苯i i 各2 0 m i n ，至标本透明( 标准：组织块颜 色加深透明，二甲苯颜色透明) 。 d ) 浸蜡：将标本浸入石蜡中置6 0 恒温箱1 2 0m i n 。 e ) 包埋：使标本的切面朝下放入装有液体石蜡的包埋柜中，室温下自然 凝固后4 。c 冰箱保存6 0m i n ，然后取出修整石蜡块。 f ) 切片：用石蜡切片机进行连续冠状位切片，厚61 1m ，4 5 。c 温水中展片， 捞三套片，置于9 0 c 烤箱烘烤1 5 m i n ，分别用于h e 染色、m a s s o n 染色 及t g f 1 31 的免疫组织化学染色。 2 5 3 2h e 染色 a ) 脱蜡水化：将6 l ar n 切片分别置于二甲苯i 呻二甲苯i i 各1 5m i n 脱蜡。 后置于梯度酒精( 1 0 0 酒精2 m i n 一9 5 酒精i 一9 5 酒精i i 一9 0 酒精 一8 0 酒精一7 0 酒精各l m i n ) 中，然后用自来水冲洗2m i n ，蒸馏水洗 3 次。 b ) 苏木精染液浸染5 1 0m i n ，自来水冲洗，蒸馏水洗3 次。 c ) 1 盐酸酒精分化1 5 s 反蓝，自来水冲洗，蒸馏水洗3 次。显微镜下观 察核的着色情况。 d ) 1 伊红染色液浸染5 m i n ，自来水冲洗，蒸馏水洗3 次。 e ) 梯度酒精( 7 0 一8 0 一9 5 一1 0 0 各5m i n ) 脱水。 f ) 二甲苯i 一二甲苯i i 各1 5 m i n 透明，中性树胶封片。 g ) 光镜1 0 1 0 倍、1 0 4 0 倍下观察组织病理学改变，照相分析。 研究论文 2 5 3 3 肺组织切片胶原纤维染色( m a s s o n 三色染色) 步骤 a ) 脱蜡水化：同h e 染色 b ) 苏木精染液浸染5 1 0 m i n ，自来水冲洗，蒸馏水洗3 次。 c ) 1 盐酸酒精分化1 5 s 返蓝，自来水冲洗，蒸馏水洗3 次。显微镜下观 察核的着色情况。 d ) 丽春红酸性品红染液染5 - 8 m i n ，蒸馏水洗。 e ) 1 磷钼酸染液中染1 - 3 m i n 。 f ) 不水洗直接亮绿染2 - 3 m i n 后冰醋酸中2 3 s 脱色，水洗，蒸馏水洗。 g ) 脱水透明：( 7 0 一8 0 一9 5 一1 0 0 各5 m i n - - - - 甲苯i 一二甲苯i i 各1 5 m i n ) ，中性树胶封片。 h ) 光镜1 0 x1 0 倍、1 0 x 4 0 倍下观察肺组织病理改变，照相分析。 m a s s o n 染色结果判定：胶原纤维、粘液、软骨、神经纤维染为蓝绿色， 肌肉、弹力纤维染为红色，神经轴索染为粉红色，纤维素染为紫红色；红 血球染为橘红色，细胞核染为蓝褐色。 2 5 3 4 肺组织t g f 1 31 的免疫组织化学染色分析 肺组织t g f b1 的免疫组织化学染色，具体参照试剂盒说明书进行操作。 曲脱蜡水化：同h e 。然后p b s 冲洗3 次，每次2 m i n 。 b ) 高温高压法抗原修复：取p h 6 0 的柠檬酸盐缓冲液于压力锅中，加热至 沸腾，将石蜡组织切片放入已沸腾的缓冲液中，加盖，继续加热至喷气后 计时2m i n ，自然冷却至室温，取出玻片。然后p b s 洗3 次，每次2m i n 。 c ) 每张组织切片各滴加1 滴3 h 2 0 2 ，室温下孵育1 0 m i n ，以阻断内源性 过氧化物酶的活性。p b s 冲洗3 次，每次2m i n 。 d ) 除去p b s 液，拭干组织周围水分，滴加一抗，4 过夜。p b s 冲洗3 次，每次2 m i n 。 e ) 拭干组织周围水分，滴) m - - 抗，3 7 孵育2 0 3 0m i n 。p b s 冲洗3 次， 每次2 m i n 。 f ) 除去p b s 液，拭干组织周围水分，滴加2 滴新鲜配制的d a b 显色溶液， 显微镜下控制，大约1 0 1 5 m i n 。自来水冲洗终止显色。 g ) 苏木素衬染1 2m i n ，镜下观察。蒸馏水漂洗后加p b s 冲洗2m i n 返蓝。 h ) 脱水透明：( 7 0 呻8 0 一9 5 一1 0 0 各5 m i n - + 二甲苯i 一二甲苯i i 各1 5 m i n ) ，中性树胶封片。 研究论文 3 统计学处理 一 ，? 采用s p s s l 3 0 统计软件包进行统计学分析。单因素方差分析进行组 间比较，有显著差异者用s - n k 法进行两两比较，其分布采用均数标 准差( x 士s ) 的方式描述。p 0 0 5 表示相差显著。 结果 l 动物的一般情况 p q 给药后2 小时大鼠即出现少动表现，1 天后症状加重，出现毛发 松散、步态蹒跚、易捕捉、少食等现象；3 天时症状明显变重，呼吸频率加 快，活动明显减少，腹泻，口唇尾端有紫绀表现；4 天后症状逐渐减轻。 2 血清中m d a ，s o d 水平变化 实验期间各时间点p q 组血清s o d 活力明显低于n c 组( p o 0 5 ) 。 随着时间的延长，p q 组血清s o d 活力下降，d 7 较d l 明显下降，差异具 有统计学意义( p o 0 5 ) 。 随着时间的延长，维生素b l 两个剂量组大鼠血清s o d 活力呈现下 降趋势。在相同时间点均高于p q 组，具有统计学意义( p o 0 5 ) 。在相 同时间点p q + h v b 组血清s o d 活力高于p q + l v b 组，第7 天时两组差 异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。 各组大鼠血清m d a 含量与s o d 活力