百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及其生物学特性的研究.doc

百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及其生物学特性的研究百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及其生物学特性的研究垄查董晓明何长民蛐划72.)度景军囊譬舻关键丝状血凝素层斩亘堕堑堕前言嘁精百日咳杆菌丝状血凝素(filamentoushemagglutinin;fha)是百日咳i相菌株分泌的一种血凝素”,它是一种直径2nm,长约4oi00nm丝状结构的蛋白质.分子量133.000d,具有高度的血凝活性,对术瓜蛋白酶敏感”,它在百et咳杆苗对呼吸遭上皮细胞的粘附中起作用,是百et咳杆菌保护性抗原之.【57有关fha纯化的资料报遭较多.arai等”采用琼脂糖凝胶层析法分离;morse用不连续氯化铯梯度离心及葡聚糖凝胶g一150柱层析进行分离;irons等采用亲合层析的方法分离.他们分离的fha均有少量pt(pertussistoxin;pt)的污染.8o年代,sato等”采用多步骤层析法可获得毫克级fha,但同样存在纯度不甚高的缺陷.综上所述的纯制方法,都存在步骤繁复,纯度不高,污染有少量pt,且收量较低等问题.为此本文采用两种不同方法.由百日咳杆菌培养液中分离纯制fha组分.以期选择出产量高,纯度好的纯制方法.为无细胞百日咳菌苗质检提供fha参考品.1材料和方法1.1菌种及细菌培养接种百日咳cs菌株于bg培养基上.37培养72小时.于stainerscholte(ss)液体培养基中静置培养5天后收获1.2hp-sepharose一4b的制备用层析法从人血浆中提纯的结台珠蛋白加入到cnbr活化的sepharose一4b中4偶联过夜偶联率为77.14.4保存备用1.3纯化方法方法r:将培养液于10.000rpm.4”0离心1小时,收上清液.调pil至8.0,以30m1/h的流速通过经0.olmpb.ph8.0的缓冲液充分平衡的羟基磷灰石柱,0.1mpb,ph70的缓冲液洗脱杂蛋白后,改用0.tmpb,ph7.0,0.5mnacl缓冲液洗脱fha组分,得fha的粗制品将该粗制品再过t-ipsepharose一4b亲和柱.收集通过瘦,即为fha纯制品,于0.impb,ph7.0.0.5mnaci,30甘油溶液中透析平衡后,一20保存.方法i:将培养液用33.3饱和度的硫酸铵两次盐析.再经pbs溶液浸提.超速离心后,进行蔗糖密度梯度离心,收集fha组分,于0.1mpb.ph7.0?0.5mnaci缓冲液中透析平衡后,进行hpsepharose一4b柱层析,以除去pt收集通过液,于0.1mpb,ph7.o,0.5mnaci鲫甘油液透析平衡后一20”(2保存.1.4蛋白质含量测定采用lowry法测定”“bsa为标准蛋白15sds-page电泳采用laemmli法进行.fha参考品由日本国立预防卫生研究所dr,yujisato赠送1.6fha活性单位测定采用fha-elisa法测定”“抗fhaigg由日本国立预防卫生研究所dr,hirokosato赠送第卷第一,展进学痊学物徵-,lf,ec0凸微生物学免疫学进展1997年第25卷第2期l3圉i方法】的层析洗脱图fig【eutionpatteofmethod【:chromatographoffhaonhydr0yhpatimatrices.(fraction3isfha)b:chromatographoffhaonhpsepharose4baffinitymatrices(fraction1isfha)图i方法i的屡析洗脱图figelminpatteofmethodi(chromatographoffhaonhp-sepharose4baffinitymatrices.fractioniisfhaj1.7血球凝集试验按常规方法,采用l(v/v)新鲜雄鸡红血球进行.i.8fha保护力试验将fha稀释至18vgpn/ml,以0.5ml/只的剂量腹腔免疫nih小鼠l0只,免疫三周后,取百日咳杆菌18323攻毒用苗悬液脑腔攻击8万个菌.攻毒二周后t统计小鼠存活个数,计算其保护率.1.9fha+pt的保护力试验将纯化的fha与纯化的pt以1:1的比例混合后,稀释至18ggpn/ml,以0.5ml/只的剂量腹腔免疫nilt小鼠l0只.免疫三周后,取百日咳杆菌18323攻毒用菌悬液脑腔攻击8万个苗,二周后计算保护力.1.1ofha被动保护力试驻抗fhaigg的制备:取纯制的fha以180gg/只的剂量背部三点皮下免疫家兔.三周启以同样剂量的fha进行加强免疫,三周之后颈动脉采血,分离血清,经de一52柱层析后获纯制的抗fhaigg.将抗fha按不同稀释倍数以05ml/只的剂量腹腔注射nih小鼠10只,2小时后用3万个百日畴杆菌18323菌悬液脑腔攻击nih小鼠,二周后计算保护力2结果2.1方法i纯化步骤及收量由方法i的纯化及收量结果可以看出,随着纯化步骤的进行,蛋白量逐步下降,而fha的活性逐步提高,比活性增高,符台纯化机理该方法纯制的fha平均收量可达34.4,纯化倍数平均达到42倍.洗脱图见图i.2.2方法纯化步骤及收量由方法i的纯化及收量结果可以看出,经过两步纯化,蛋白量下降,但fha的活性单位提高,最终纯化倍数平均达到49倍.其中培养液纯化的fha其活性单位达到9655eu/m1.但收量平均仅为12.5,洗脱图见图142.3血凝滴度血凝滴度结果见表3.用1(v/v)新鲜雄鸡血进行血凝试验,第一孔稀释倍数为1:4,室温放置(或37)二小时后判定结果,血凝滴度结果(表3)所示,方微生物学免疫学进展1997年第25卷第2期法i纯化的两批fha,其血凝滴度为1:256;方法l纯化的三批fha,其效价为1:1281:512,说明纯化的fha其血凝活性均保持良好.表方法i纯制步骤及收量table1purifiedstepsandroverymethodi表3血凝滴度结果table3theresultsagglutinationtitersampleagguti.ationtiter2.4fha的纯度方法纯制的fha经1sds降解后,于io%聚丙烯酰胺凝胶中电泳,可以分离为3条带,条带位置与日本国立预防卫生研究所赠送的参考品相符.电泳图中未见其它杂蛋自带,说明fha达到电泳纯,三条带的分子量分别为160,oo0d,120,o00d和90000d,这与comell报道的结果一致.而方法i纯制的fha,可明显见到有杂蛋物学免疫学进展1997年第25鲞箜塑白带,纯度低于方法i.2.5fha的免疫力以方法纯制的fha作抗原免疫nih小鼠,3周后用百日咳杆菌18323菌悬液攻毒,保护力为40用方法i纯制的fha免疫nih小鼠保护力可达60.说明上述二法纯制的fha能对百日咳杆菌脑腔攻击产生部分保护力.fha与pt以l:l比例混合后再免疫nih小鼠,3周后以同等毒力的百日咳杆菌18323菌悬液攻毒,保护率可达90,远远高于单独fha的免疫.将抗fhaigg以原倍,5倍和25倍3/卜不同稀释倍数稀释后腹腔注射nih小鼠,2小时之后用80000/卜百日咳杆菌18323菌悬液脑腔攻击,2周后统计保护力分别为30,20,20.3讨论从实验结果可以看出:方法i.119hydroxylapatite,hpsepharose一4b多步骤柱层析法,纯化的fha产量可达1.63mg/l,收率为34.4,纯化倍数达到42倍.而方法,fha的产量为0.45mg/l,收率为12.5.纯化倍数达49倍.因此方法1的产量较方法i高23倍.两种方法对fha的纯化倍数基本相当.从纯度上看,方法1纯制的fha,elisa法可检测出pt的存在,电泳结果可见杂蛋白带.方法纯制的fha,page电泳的样品中不含其它杂带,elisa法检测不出pt的存在.因此方法fha的纯度高于方法1.其原因可能是hydroxylapatite在ph8.0的条件下对fha是非特异吸附,同样条件下对pt也有一定量的吸附,致使层析后fha粗制品中pt含量相对比方法区带离心后fha样品中的pt量高,而hpsepharose4b亲和层析又未能将pt完全除去所致.从纯化的量来看,方法1将hydroxylapatte放在层析的第一步,限制丁纯化的样品量.因为hydroxylapatite的颗粒很细,上样和洗脱的流速极为缓慢,一次只能纯化少量的样品.在纯化的5次实验中,仅2次样品未阻塞层析柱顺利通过.如筛选较粗的hydroxy1apatite颗粒进行层析以提高流速,则纯化效果降低这与svoboda等纯化中遇到的问题相同”“.因此,如要进行大量fha的纯化,特别是用于制备fha标准品.该方法不可取.方法,因将盐析,浸提,超速离心等步骤放在纯化的第一步,能够处理大量的培养液,取浓缩,部分纯化的fha粗制品再进行精细的亲和层析,较为方便.该方法适合纯制大量的fha,为大批量制备fha标准品提供丁便利.从fha的活性及血凝效价来看,两种纯化方法fha的活性单位都较高,差别不显着.说明这两种纯化方法都能较好地保护fha的活性.但从免疫保护力结果来看,两种方法纯制的fha对小鼠保护力有差异.方法i纯制的fha对小鼠有高的保护力,这可能是因为混有部分pt缘故,是fha与pt协同保护作用.而fha被动免疫均无保护力.这与nakase”,robinson”“等人的实验结果相符.综上所述,用方法纯化fha,其样品处理量,纯度及活性均优于方法1,如进行大量fha纯化,以制备fha标准品,则方法较为适合.4参考文献1araih,eta1.separationandbaracteritionoftwodistincthemngglutjninscontainedinpurifiedleukytoslspromotingfactorfrombordetellapertussisbioebembiphysat1976,444769-7822morsesi.eta1.isolationandpropertiesoftheieukocytosisandlympbytoslspromotingfactorofbordetellapertussisjexpmed1978,143:148315023ironli,eta1.substratespecificityarpurificationbyaffinitycombinationmethods0thetmbordetellaper-tussjsbemagglufininp338349.inc.rmanclarkandjchill(ed),internationalsymposiumonpertussisdhewpublicationno.991830.u.sgmmentprimingofficewashington.d.c4tmeissaa,eta1.virulencefactorofbordetellapertusslsarevmicrobiol1986,406616869edwardskw.aeellularpertussjsvaccineasolutiontothepertusslsprlem7thejfectdis1993,168:15206sat0ydlopmemofpertussisompomentvaccinein16japanlancet1984,21:1221267何长民.筹无细胞百日咳菌苗的抗原性和免疫原性研究上海免疫学杂志.1991,11:2892938morsesi,eta1.isolationandpropertiesoftheeukytoslsandlyrephocytosispromotingfactorofbordecellapertussls.jexpmed1976,148315029ironli,eta1.isoationofthelymphocytosispromotingfactorhemaggutininofbordetellapertussmbyaffinitychromatography.biochembiophysacta1979,58017518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