聚乙二醇修饰对牛乳β--乳球蛋白的致敏性与构象变化的研究.pdf

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l a t e d l g 5 8k d a 和三点修饰产物 t r i p e g y l a t e d l g 7 8k d a 通过阳离子交换层析法 树脂为s ps e p h a r o s ef a s tf l o w 分离纯化p e g 修 饰 乳球蛋白后的产物 收集洗脱峰 经s d s p a g e 实验得到纯化的产物为两 点修饰产物 三点修饰产物 修饰产物的荧光光谱实验结果表明 p e g y l a t i o n 过程中发生荧光淬灭的现象 导致 l g 的三 四级结构发生了变化 同时伊l g 抗原性的降低伴随着相对荧光强度的降低 圆二色谱分析结果表明 p e g y l a t i o n 过程中 从 l g 到d i p e g y l a t e d f l l g 再到t r i p e g y l a t e d 伊l g f l s h e e t 含量逐 渐增加 s h e e t 含量 l g3 3 2 d i p e g y l a t e df 1 l g3 5 7 t r i p e g y l a t e d l g 4 4 6 随着结合到 l g 分子上p e g 分子的增加 a h e l i x 从1 4 3 到1 4 9 再到1 9 2 表明仅一h e l i x 略有增加 总之 由构象研究可以说明p e g 修饰 l g 后会使伊k 构象表位发生变化 导致致敏性发生降低 即p e g 修饰 l g 后可以掩盖 l g 的抗原决定簇 使蛋 白质免疫原性和抗原性产生降低 关键词 伊乳球蛋白 抗原性 聚乙二醇 聚乙二醇修饰 构象 a b s t r a c t p e g v l a t i o ni san e wt e c h n i q u e w h i c hd e v e l o p e di n t h e1 a t e19 7 0 sa n dc a n i m p r o v e t h ep h 锄a c e u t i c a lp r o t e i n s b yr e d u c i n g o r 姗o v i n g 疵1 9 e n l c l y i n c r e a s i n gw a t e rs o l u b i l i t y a n di m p r o v i n gs t a b i l i t y i n t h i sp a p e r t h e1 n l u e n c e o t p e g v l a t i o no nt h ea n t i g e n i c i t ya n dc h a n g e si n c o n f o r m a t i o no ff l l a c t o g l o b u l l nw a s s t u d i e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ea n t i g e n i c i t yo 够l a c t o g l o b u l i na n dc h a n g e sm c o n f o r m a t i o nw e r ed i s c u s s e dp r e l i m i n a r y 一 口 1 a c t o g l o b u l i ni st h em a i na l l e r g e ni n m i l k s oe l i m i n a t i n gt h ea l l e r g e n i c i t yo f 胁c t 0 9 1 0 b u l i nh a sa l w a y sb e e no n eo f t h eh o tt o p i c si nr e s e a r c ho fi n t e m a t l o n a l d a i r yp r o d u c i n g t e c h n o l o g y i n t h i sp a p e r f l l a c t o g l o b u l i n w a sm o m e db y m p e g s c 2 0 k d a a 1 1 dc h a n g e so fa n t i g e n i c i t yw a s s t u d i e db yi n d i r e c tc o m p e t l t e e l i s a t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i g e n i c i t yw a s a f f e c t e dt h em o s tb yt l m e lh e o d t i m a lm o d i f i c a t i o nc o n d i t i o nw a sp h 7 0 r e a c t i n gt i m e 8h t h em a s sr a t i oo f m p e g s ca n dp l g 3 1w i t ht h ea n t i g e n i c i t y o f5 3 6 4p m l 1 m 1 a 1 v a l u e 18 0 g m l t h er e d u c t i o nr a t eo fa n t i g e n i c i t yw a s 7 0 2 0 t h e r ew e r et w op r o d t s i ns d s p a g eo f 一l g m o d i f i e db y p e g d i p e g y l a t e df l l g 58 k d a a n d t r i p e g y l a t e df l l g 7 8 k d a t h ep r o d u c to ff l l gm o d i f i e db yp e gw a ss e p a r a t e db yc a t l o n l c e x c h a n g e c h r o m a t o 酎a p h y s ps e p h a r o s e f a s tf l o w t h ee l u t i o np e a k s w e r ec o l l e c e d s d s p a g eh a dc o n 6 肌e dt h a tt w o p o i n tm o d i f i e dp r o d u c ta n d t h r e e p o i n tm o d l t l e d d r o d u c tw e r eo b t m n e d f l u o r e s c e n c es p e c t r u me x p e r i m e n to fm o d l f i e dp r o d u c t i n d i c a t e df l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go c c u r r e dd u r i n g p e g y l a t i o nw h l c hl e d t ot h e c h a n g e si nt e r r t i a u r ys t m c t u r ea n dq u a t e r n a r ys t r u c t u r eo f f l l g i nt h em e a n w h l l e t h e r e l a t i v ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s i n g o ft h ea n t i g e n i c i t y t h er e s u i t so fc i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r u mi n d i c a t e d d u r i n gp e g y l a t i o n f r o m l gt d i p e g y l a t e d l g t ot r i p e g y l a t e d 声一l g t h ec n t e n t s 咿s h e e t i n c r e a s e d g r a d u a l l y 卢 s h e e tc o n t e n t s 一l g 33 2 d i p e g y l a t e d l g35 7 t r i p e g y l a t e d 口 l g4 4 6 w i t ht h ei n c r e a s i n go fp e g o nf l l g t h ec o n t e n t so fa h e l i xc h a n g e d a b s t r a c t f r o m1 4 3 t o1 4 9 t o1 9 2 i n d i c a t i n gg r a d u a l l yi n c r e a s i n go f a h e l i x i naw o r d t h er e s e a r c ho nc o n f o r m a t i o ni n d i c a t e dt h a t c o m f o r m a t i o n a l e p i t o p e s o fb l g c h a n g e da f t e rp e g m o d i f i c a t i o nw h i c hl e dt ot h ed e c r e a s i n go ft h ea n t i g e n i c i t y t h a t w a s a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t sw e r ec o v e r e da f t e rp e gm o d i f i c a t i o nw h i c hd e c r e a s e d t h ei m m u n i t ya n da n t i g e n i c i t yo f f l l g k e yw o r d s 8 l a c t o g l o b u l i n a n t i g e n i c i t y p o l y e t h y l e n e g l y c o l p e g y l a t i o n c o n f o r m a t i o n i v 目录 目录 第一章前言 1 1 1 聚乙二醇修饰技术的国内外研究现状 1 1 1 1 聚乙二醇修饰蛋白质 1 1 1 2 聚乙二醇修饰技术的应用 4 1 2 乳球蛋白的研究现状 6 1 2 1 牛乳过敏 6 1 2 2 口 乳球蛋白简介 7 1 2 3 牛乳蛋白致敏机理 8 1 2 4 致敏原在食品加工过程中的研究进展 9 1 3 本课题的选题意义 研究内容和创新点 1 2 1 3 1 选题意义 1 2 1 3 2 研究内容 1 2 1 3 3 创新点 13 第二章兔抗牛乳 哥l 球蛋白多克隆抗体的制备 1 4 2 1 引言 1 4 2 2 实验材料和设备 1 4 2 2 1 实验材料 1 4 2 2 2 实验仪器与设备 15 2 2 3 溶液配制 15 2 3 实验方法 1 6 2 3 1 试验动物 1 6 2 3 2 制备抗原 17 2 3 3 免疫方案 17 2 3 4 分离血清 17 2 3 5 多抗效价的测定 18 2 4 结果与讨论 18 2 4 1 抗体效价变化 18 v 目录 2 4 2 多抗的制备 1 9 2 5 本章小结 1 9 第三章聚乙二醇修饰对牛乳 乳球蛋白抗原性的影响 2 0 3 1 引言 2 0 3 2 实验材料和设备 2 0 3 2 1 实验材料 2 0 3 2 2 实验仪器与设备 2 1 3 2 3 溶液的配制 2 1 3 3 实验方法 2 4 3 3 1m p e g s c 修饰 一l g 2 4 3 3 2 间接竞争e l i s a 测定修饰产物的抗原性 2 4 3 3 3t n b s 法测定修饰度 2 5 3 3 4s d s p a g e 测定修饰产物 2 5 3 3 5 数据分析 2 6 3 4 结果与讨论 2 7 3 4 1p e g 修饰 一l g 产物的抗原性 2 7 3 4 2 修饰条件对修饰度的影响 2 9 3 4 3p e g 修饰对口一l g 相对分子质量的影响 3 0 3 5 本章小结 3 0 第四章聚乙二醇修饰伊乳球蛋白产物的纯化 3 2 4 1 引言 3 2 4 2 实验材料和设备 3 2 4 2 1 实验材料和试剂 3 2 4 2 2 实验设备 3 3 4 2 3 溶液的配制 3 3 4 3 实验方法 3 5 4 3 1p e g 修饰 乳球蛋白 3 5 4 3 2 离子交换层析法分离纯化修饰产物 3 5 4 3 3s d s p a g e 检测分离蛋白 3 5 v i 目录 4 4 结果与讨论 3 6 4 4 1 阳离子交换层析分离纯化修饰产物 3 6 4 4 2s d s p a g e 测定分离蛋白 3 7 4 5 本章小结 3 8 第五章p e g 修饰对 乳球蛋白构象的影响 3 9 5 1 引言 3 9 5 2 实验材料和设备 3 9 5 2 1 实验材料和试剂 3 9 5 2 2 实验设备 4 0 5 3p e g f 1 乳球蛋白构象分析 4 0 5 3 1 荧光光谱分析 4 0 5 3 2 圆二色谱分析 4 0 5 4 结果与讨论 4 1 5 4 1p e g 修饰对伊乳球蛋白荧光光谱的影响 4 1 5 4 2p e g 修饰对 乳球蛋白圆二色谱的影响 4 2 5 5 本章小结 4 3 第六章结论与展望 4 5 6 1 主要结论 4 5 6 1 1p e g 修饰对 乳球蛋白抗原性的分析结果 4 5 6 1 2p e g 修饰 乳球蛋白产物纯化的研究结果 4 5 6 1 3p e g 修饰对 乳球蛋白构象影响的研究结果 4 6 6 2 进一步展望 4 6 致谢 4 7 参考文献 4 8 攻读学位期间的研究成果 5 5 v i i p o l y e t h y l e n eg l y c o l p e g 缩略语与符号 缩略语与符号 m o n o m e t h o x yp o l y e t h y l e n eg l y c o l m p e g 一l a c t o g l o b u l i n 仔l g c i r c u l a rd i c h r o i s m c d e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b n e n t e l i s a c o w sm i l ka l l e r g y c m a l m m u n o g l o b u l i ne i g e f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f c a f r e u n d si n c o m p l e t ea d ju v a n t f i a t e t r a m e t h y t b e n z i d i n e t m b p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p b s p h o s p h a t eb u f f e r p b o p t i c a ld e n s i t y o d t r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d t n b s a m m o n i u mp e r s u l f a t e a p s n n n n t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t e m e d v a r i a n c ea n a l y s i so fv a r i a n c e a n o v a d a l t o n d a 聚乙二醇 单甲氧基聚乙二醇酯 伊乳球蛋白 圆二色谱 酶联免疫吸附剂测定 牛乳过敏 免疫球蛋白e 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 3 3 5 5 四甲基联苯胺 磷酸盐缓冲液 磷酸缓冲液 光密度 三硝基苯磺酸 过硫酸铵 n n n n 四甲基乙二胺 方差分析 道尔顿 m o n o m e t h o x yp o l y e t h y l e n eg l y c o l s u c c i n i m i d y lc a r b o n a t e s m p e g s c 单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯 s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s p a g e 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 v i l i 第一章引言 第一章前言 1 1 聚乙二醇修饰技术的国内外研究现状 聚乙二醇 p o l y e t h y l e n e g l y c o l p e g 修饰 1 2 又称分子的p e g 化 p e g y l a t i o n 是2 0 世纪7 0 年代后期发展起来的一项修饰技术 已用于修 饰多种蛋白质或非蛋白质分子的化学修饰p j 美国食品和药物管理局 f d a 已批准在食品 化妆品和药物等领域使用 p e g p e g 无毒 可以通过 肾脏 p e g 2 0 k d a 直接排 出体外 4 o 已有研究报道 p e g 修饰蛋白质等高分子后 能够显著降低或消除原蛋白 分子的抗原性 5 1 p e g 修饰过程中对赖氨酸的修饰将部分或完全掩盖蛋白分子 表面抗原决定簇 蛋白质分子的抗原性得到降低 某些疏水性强 缺少糖基的 蛋白质分子 在中性p h 值的环境中容易凝集 而生成的凝集物可引起机体产 生免疫应答 p e g 自身具有高度的亲水性 当修饰蛋白质后蛋白质的亲水性增 加 蛋白质的凝集物形成减少 免疫反应的发生得到降低1 6 j 1 1 1 聚乙二醇修饰蛋白质 1 1 1 1p e g 修饰蛋白质的原理 如图1 1 所示 聚乙二醇 p o l y e t h y l e n eg l y c o l p e g 分子呈线状或分枝状 不带电的聚醚 分子式为h o 一 c h 2 c h 2 0 h 分子两端的羟基具有伯醇性质 可以进行酯化和醚化反应 r o b e g s 2 0 0 2 等 7 阐述了p e g 能与赖氨酸 色氨 酸 组氨酸 半胱氨酸 苯丙氨酸 谷氨酸 丝氨酸 天门冬氨酸 精氨酸以 及n 端和c 端的羧基发生反应 p e g 在水溶液中具有高度的亲水性 是由于水分子可以结合到乙烯氧基基团 上峭j 从而具有优良的水溶性 分子两端各有一个羟基的为普通的聚乙二醇 而单甲氧基聚乙二醇 m o n o m e t h o x yp o l y e t h y l e n eg l y c o l m p e g 的一端以甲基封闭 修饰蛋白质分 子最常采用m p e g 对其分子上赖氨酸侧链n 末端的仅 氨基或 氨基进行共价偶 第一章引言 联 但是 蛋白分子不易与活性较低的普通p e g 分子反应 分子末端的羟基需 通过活化后具有更强的反应活性 可与各类蛋白分子共价偶联 活化后的聚乙 二醇扩大了聚乙二醇的应用 不同的活化方式可以对蛋白质进行氨基修饰 巯 基修饰和羧基修饰 有关研究的报道日益增加 9 如p e g 在有机合成 药物 高分子合成及多肽合成等多方面的研究 h o 一 c h 2 c h 2 0 r l o h b r a n c h e d m p e g 2 m p e g 磊ocn c c h h n h 图1 1p e g 分子结构式 f i g 1 1s t r u c t u r a lf o r m u l a eo fp o l y e t h y l e n eg l y c o l p e g m o l e c u l e s m p e g m o n o m e t h o x y p e g 1 1 1 2 聚乙二醇修饰蛋白质的反应类型 蛋白质在被p e g 修饰的过程中 修饰反应的功能基团是p e g 分子末端的羟 基 由于其反应活性低 需将p e g 转变成具有各种活性的反应中间体 从而能以 温和的条件 较快的反应速率与蛋白质进行反应 这便是p e g 的活化 活化的p e g 可偶联蛋白质分子侧链上的化学基团而进行修饰反应 目前 氨基 巯基和羧 基是p e g 与蛋白质分子上进行共价修饰的主要基团 1 氨基修饰 蛋白质分子表面的游离氨基一般由于不处于活性中心部位的原因 而且具 有较高的亲核反应活性 可以进行亲核反应 因此成为最常用的被修饰基团 被修饰氨基基团主要是赖氨酸的o 氨基 s 氨基和末端氨基 如图1 2 所示 最 常用的氨基修饰剂有 琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇 m p e gs u c c i n i m i d y l s u c c i n a t e m p e g s s 琥珀酰亚胺甲酸酯聚乙二醇 m p e gs u c i n i m i d y l c a r b o n a t e m p e g s c 琥珀酰亚胺丙酸酯聚乙二醇 m p e gs u c c i n i m i d y l p r o p i o n n a t e m p e g s p a 等 第一章引言 c l r n i 1 2 p e g 飞 图1 2m p e g 三聚氰氯对蛋白质氨基的修饰 f i g 1 2t h ea m i n og r o u pm o d i f i c a t i o no fp r o t e i nw i t hm p e g c y a n u r i cc h l o r i d e 2 巯基修饰 蛋白质表面的巯基被修饰的几率很小 是由于自由巯基数量远少于氨基 因而被修饰的几率很小 但巯基修饰特异性高于氨基修饰 可定点修饰巯基 如图1 3 最常用的修饰剂为马来酰亚胺聚乙二醇 m p e gm a l e i m i d e m p e g m a l m p e g n s h r m p e g o o 图1 3聚乙二醇 马来酰亚胺对蛋白质巯基的修饰 f i g 1 3t h et h i o lg r o u pm o d i f i c a t i o no fp r o t e i nw i t hm p e g m a l 3 羧基修饰 天冬氨酸 a s p 谷氨酸 g l u 及末端羧基为羧基修饰的主要基团 如图 1 4 所示 首先将聚乙二醇分子中的羧基转化为氨基 蛋白质分子中的羧基 再 与转化后的氨基p e g 发生修饰反应 但缺点是易产生其它的交联反应 使用较 少 h o o c r h o o c p e g p e g n h 2 卜r c o n i i p e g 图1 4 聚乙二醇对蛋白质羧基的修饰 f i g 1 4t h ec a r b o x y lg r o u pm o d i f i c a t i o no fp r o t e i nw i t hp e g 第一章引言 1 1 2 聚乙二醇修饰技术的应用 p e g 可以与蛋白质分子表面的游离的氨基酸残基发生反应 从而增强蛋白 质或酶的生物活性或稳定性 已有研究报道 经p e g 修饰后 胰蛋白酶 l o 脂肪酶 l u 2 j 及过氧化物酶 的热稳定性显著增强 z h a n g 1 9 9 9 等 1 4 峙艮道经聚乙二醇修饰胰蛋白酶后 其更d i l l 急 定 k a z a n 19 9 7 等 手艮道经p e g 修饰大肠杆菌青霉素酰化酶后 其活性增强2 0 倍 目前已经有多种经p e g 修饰的蛋白质 广泛应用于生物医药领域 已获美 国食品和药物管理局 f d a 批准上市的p e g 修饰的药物蛋白类药物 1 6 1 如表 1 1 所示 可以降低其免疫原性 延长血浆半衰期 减少变态反应发生 降低毒 副作用等 表1 1p e g 修饰技术的应h j t a b l e1 1t h ea p p li c a t i o n so fp e g y l a t e dp r o t e i n s 蛋白质等高分子经p e g 修饰后 其理化特性在一定程度上发生改变 1 降低或消除免疫原性与抗原性 a b u c h o w s k i 1 9 7 7 研究指出 牛血清白蛋白经p e g 修饰后 非常明显的 消除或降低其抗原性 1 7 1 聚乙二醇分子通过共价键与蛋白分子表面的氨基酸基 团连结形成覆盖层 使蛋白分子表面的抗原决定簇将部分或完全被掩盖 蛋白 质分子的致敏性可以降低或消除 如表2 1 所示 已获f d a 批准上市的p e g 修饰药物蛋白后可降低其抗原性 4 第一章引言 2 改变等电点 电泳行为 k a t r e 1 9 8 7 等发现 白细胞介素 2 经p e g 修饰后 在聚丙烯酰胺凝胶 电泳实验中 s d s p a g e 由于线状p e g 分子间的相互缠结导致被修饰的蛋白 质泳动速度明显减慢 p e g 修饰带正电的赖氨酸8 一n h 3 后 减少了蛋白质分子 中的正电荷 导致其等电点降低 1 8 j 3 酶学性质的改变 k a z a n 19 9 7 等报道 经4 0 0 0 d a p e g 和6 0 0 0 d a p e g 修饰后 大肠杆菌 青霉素酰化酶的活性增强2 0 倍 用p e g 修饰脂肪酶后可以改变底物的专一性 使脂肪酶可溶于有机溶剂 从而能催化有机相反应 在科研和工业生产中应用 范围得到扩大 4 提高热稳定性 h a d l e y 1 9 8 9 等研究表明 p e g 共价连接古洛糖酸内酯氧化酶后 其天 然构象产生一定不易伸展失活的刚性 分子内部基团的热振动减少了 导致蛋 白热稳定性的增加 蛋白质分子和p e g 之间的交联点数目 会使热稳定性产生 变化 单点交联热稳定性变化不明显 多点交联可使热稳定性提高 此外 蛋 白质分子经p e g 修饰后增加了蛋白质分子的亲水性 新的氢键和盐桥 5 j 在水溶 液中形成 最终导致蛋白质分子的热稳定性提高 5 提高抗各类失活因子能力 w o r k i n g 1 9 9 7 等发现 蛋白质分子经p e g 修饰后 提高了抗酸碱水解 抗抑制剂 有机溶剂和抗蛋白水解酶等变性的失活能力 19 1 由于p e g 所产生的 空间屏蔽效应阻挡了失活因子的进攻 此外 蛋白质等高分子中蛋白水解酶等 失活因子敏感基团被修饰 使其抗水解能力提高 如过氧化氢酶经p e g 修饰后 抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明显提高 6 溶解性增加 聚乙二醇分子由于其含有大量乙烯氧基 能够在水溶液中与水形成氢键 p e g 修饰蛋白质分子后 能共价结合到蛋白质分子上 使其溶解性增加 20 i 具 有良好的水溶性 7 体内半衰期延长 c l a r k 1 9 9 6 等采用p e g 修饰人生长激素后 能够提高其热稳定性 同时 抗蛋白水解酶和抗抑制剂等的能力明显得到提高 其体内半衰期比天然态蛋白 质要长 这对提高蛋白质等药物蛋白分子的生物活性具有重要意义 2 1 1 第一章引言 8 毒性减少 经p e g 修饰蛋白质分子后 可降低大多数蛋白质的毒性 且p e g 本身无 毒性 如4 0 0 0 d a 的p e g 以一定剂量注射到猴 兔和鼠等动物体内 2 2 2 3 结 果显示 不伤害实验动物的蛋白质和细胞 2 4 1 1 2 伊乳球蛋白的研究现状 乳及乳制品对人类膳食具有重要意义 是人类食物蛋白的重要来源之一 目前 f a o w h o 认定导致人类食物产生过敏的八大类食物之一为乳及乳 制品 而欧盟食品标签法中明确规定必须在食品标签中标出乳及乳制品等致敏 成分 h i l l 1 9 9 7 等 h o s t 1 9 9 5 等指出 乳球蛋白 1 a c t o g l o b u l i n 一l g 是牛乳中重要的过敏原之一 2 气2 6 j 近年来 牛乳的消费群不断增加 如果在加 工过程中 乳球蛋a 的构象表位发生变化 导致致敏性的降低或消除 使乳 蛋白过敏患者的致敏反应发生率大大降低 因此开展研究牛乳致敏的工作 具 有非常重大的意义 27 1 2 1 牛乳过敏 牛乳过敏 c o w sm i l ka l l e r g y c m a 主要发生在三岁以下的儿童 2 8 引 起过敏症状的原因是免疫系统的异常炎症导致组织间接损伤 2 9 1 c r i t t e n d e n 2 0 0 5 等指出 婴幼儿中c m a 发生率为2 6 成年人为 0 1 o 5 t 如j 约8 0 9 0 的婴幼儿在5 岁后对牛乳会自然耐受 但是 婴 幼儿长大后对接触其他过敏源后产生的 遗传过敏性生涯 如皮炎 干草热 或哮喘 影响其健康生长 牛乳中的酪蛋白 c a s e i n 一乳球蛋白 一l a c t o g l o b u l i n 一l g a 乳白 蛋白 仅一l a e t a l b u m i n 仅 l a 具有潜在的致敏性 被认为是主要的过敏原 牛乳 过敏人群对牛乳的过敏一般表现为对多个蛋白的共过敏 牛乳中的微量蛋白牛 血清白蛋白 b o v i n es e t u m a l b u m i n 免疫球蛋白 i m m u n o g l o b u l i n 乳铁蛋白 1 a c t o f e r r i n 在过敏反应中也起着非常重要的作用 有大约3 0 5 0 的牛乳过 敏者对这些微量蛋白过敏 且其中有些患者只对这些微量蛋白过敏 6 第一章引言 1 2 2 伊乳球蛋白简介 乳球蛋白不存在于母乳中 是牛乳乳清蛋白中的主要蛋白质p l l 因胃蛋 白酶无法将其消化水解可以通过胃肠道进入血液 图1 5 为伊l g 的氨基酸序列 示意图 其分子中含1 6 2 个氨基酸 两个色氨酸 t r p 图1 6 分别为三级结 构和三维结构示意图 可以看出 l g 是一个以 一折叠结构为主的折叠蛋白 折叠形成的 桶状结构 是主要的构象表位 此外仅螺旋 折叠也为重要的 构象表位 肽段v a l4 1 t r p6 0 t v r1 0 2 a r g1 2 4 和l e u1 4 9 i l e1 6 2 9 0 1 0 0 过敏 患者的血清能识别 3 2 分别占口 l g 分子致敏性的1 0 一1 5 从晶体结构上看 位于c 端的肽段1 4 9 1 6 2 构成的a 螺旋非常易变 通过氢键或二硫键 肽段4 1 6 0 和1 0 2 1 2 4 的环比较稳定 这3 个肽段位于分子表面 容易与抗体接触 发生 反应 5 2 6 5 的病人血清可识别肽段1 8 2 5 4 0 和9 2 1 0 0 肽段9 1 4 和8 4 9 1 可被4 0 的病人血清识别 3 引 肽段7 8 8 3 和1 2 5 1 3 5 很少能被人的i g e 识别 完整口 l g 分子中 不存在分子表面的肽段是8 4 9 1 肽段9 1 4 和9 2 1 0 0 抗原 性相对较低 是由于其在口一l g 分子内部且很难被酶水解 l e u 一 e v a l t h r g 1 1 1 t l i t h i e t l v s g 1 3 l e u 1 0 心d i l e g l n l v s v a l a l a g l v t h r t r p t v r 2 0 s e t l e u a l a h i e t 川a a l a s e r a s p i l e s e r 3 0 l e u l e u 一越p a g i n s e r a l a p r o l e u g 4 0 一v a l t t v a l g l u g l u l e l 1 l v s p r o t h r p r o 5 0 g l u g l v a s p l e u g l u i l e l e u l e u g l l l l s 6 0 t r p g l u a s n g l v g l u c v s 赳a g i n l y s l y s 7 0j e i l e a l a l u l v s t h r l v s i l e p r o a l a 8 0 涵l p h e l v s i l e a s p 赳a l e u a s n g l u a s n 9 0 l v s v a l l e u v a l l e u a s p t h r a s p t v r l s r lo f 1 l s t v r l e u l e u p h e c y s m e t g l u a s n s e r 11 0 赳a g l u p r o g l u g i n s e t l e u a l a v s g h a 1 2 0 一c v s l e u a 1 g t h r p r o g l u v a l 灿d a s p 1 3 l j g l u 赳a l e u g l u l v s p h e s p l v s 赳a l e u 14 0 l v s 越a l e u p r o m e t h i s i l e m g l e u s e t 15 0j p h e s n p r o t l l r g i n l e u g l u l u g h a s f1 6 0 h l s i l e 1 6 2 图1 5 伊l g 的氨基酸组成序列图 f i g 1 5t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f 口 l g 7 第一章引言 图1 6 f l l g 的三级结构和三维结构示意图 f i g 1 6t h et e r t i a r ys t r u c t u r ea n dt h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f 伊l g 1 2 3 牛乳蛋白致敏机理 由于c m a 发生的机制不同 防治牛乳致敏的方法也就随之不同 掌握c m a 的致敏机理 对防治c m a 具有一定的指导意义 1 i g e 介导c m a 速发型超敏反应 i g e 介导c m a 的过敏机理容易理解和诊断 被称为速发型超敏反应 3 4 的症 状开始非常快 过敏后持续几分钟至1 h 在免疫系统中 这类炎症反应属于靶 多细胞寄生 35 致敏反应通常发生在接触环境过敏原时 如食物蛋白等 i g e 介导c m a 的发生包括两个阶段 第一阶段为致敏阶段 乳蛋白进入机 体后 诱发b 细胞产生i g e 抗体 结合于靶细胞 肥大细胞 嗜碱性粒细胞 表面 当i g e 与靶细胞结合时 机体立即呈致敏状态 再次进入的乳蛋白 致 敏原 与已经结合在靶细胞上的i g e 发生特异反应 即进入第二阶段发敏阶段 乳蛋白刺激炎症介质的快速释放产生过敏症状 绝大多数人群发生乳蛋白过敏的机制都属于速发型超敏反应 蛋白质在加 工处理过程中 会引起结构的变化 从而可能导致蛋白质致敏性的降低或消除 乳蛋白进入机体后 不能诱发b 细胞产生i g e 抗体 即i g e 介导c m a 速发型 超敏反应也随即被抑制或消除 因此 研究乳蛋白在加工过程中过敏原的变化 对过敏人群以及乳制品的生产加工具有重要意义 第一章引言 2 非i g e 介导c m a 迟发型超敏反应 一些c m a 婴儿和成年人不发生乳蛋白与特异性i g e 结合 皮刺试验等呈 阴性 3 6 迟发型超敏反应 j 为c m a 反应趋向延迟 表现在摄入乳蛋白后的1 h 至数天 i g e 介导和非i g e 介导反应并不相互排斥 非i g e 介导c m a 的成年人 过敏后不会再对乳耐受 目前 非i g e 介导c m a 的免疫机制仍不十分清楚 非i g e 介导造成的c m a 多数儿童可自身痊愈 与成年人绝大多数因非i g e 介导而导致c m a 存在矛盾的现象 38 i 表明非i g e 介导c m a 多出现在生命的后 期 随年龄的增加 非i g e 介导的c m a 发生率增加 3 功能紊乱性耐受 防治过敏策略的核心是掌握乳蛋白耐受如何介导的 免疫耐受为免疫系统 对膳食变应原的无感应性 包括自身反应性t 细胞的无反应性和胸腺中的克隆 清除 调节性t 细胞的生成抑制了良性变应原的炎症反应 c m a 是由于不能发展成这些免疫耐受或来自于他们随后的断裂而产生的 在i g e 介导c m a 中 乳特异性影响t 细胞对t h 2 缺乏调节和极化 使b 细胞 传输信号生成乳蛋白特异性i g e 非i g e 介导c m a 通过t h l 介导发炎 被视为 影响过敏机制的一个因素 3 9 j 是功能紊乱性调节性t 细胞活性 此外 临床确诊 c m a 儿童的免疫耐受的诱发被证明与调节性t 细胞的发育相关 1 2 4 致敏原在食品加工过程中的研究进展 食品安全研究热点之一是牛乳致敏 目前乳品工业面临的挑战之一是降低 或消除牛乳蛋白质的致敏性 生产出低过敏或无过敏的乳制品 生物 化学和 物理的方法 在乳品加工过程中会导致乳制品的致敏性发生变化 40 1 1 2 4 1 加热对牛乳致敏性的影响 蛋白质热处理后在共价或非共价的条件下 分子内和分子间形成的聚合物 将致敏蛋白表位消除和掩盖 其致敏性在一定程度上可以得到降低 蛋白质的疏水性基团的活性得到提高是由于热处理会导致蛋白质分子打开 多肽链 使 一乳球蛋白分子的巯基与位于多肽链的c 端的二硫键之间发生相互转 化 从而生成 一乳球蛋白凝胶和热诱导复合物 生成的聚合物掩盖蛋白的致敏表 位 从而在一定程度上降低蛋白的致敏性 s h r i d h a r 2 0 0 5 等 4 l j 研究牛乳经0 c 7 4 及9 0 处理后 其致敏性降低 9 第一章引言 的原因是加热后的牛乳大大降低了口哥l 球蛋白与i g e 的结合 而w a l 2 0 0 4 等 4 2 j 研究 乳球蛋白1 0 0 c 下加热2 5 1 0 m i n 后 其致敏原性会降低4 0 5 0 o l d f i e l d 1 9 9 8 等利用高温处理的方法 致敏性降低是由于 一乳球蛋白 打开多肽链以及生成复合物 乳球蛋白的致敏表位被破坏 4 引 1 2 4 2 压力对牛乳致敏性的影响 氢键和离子键共同作用使 一乳球蛋白分子的三级结构得到稳定 压力处理 会破坏蛋白质分子内部的离子键和氢键并发生断裂 三级结构会遭到破坏 发 生蛋白质变性 a n e m a 2 0 0 5 等发现高压处理会使口一乳球蛋白变性 压力 温度与变性 程度有一定的关系 在时间和温度一定的条件下 压力增加则变性的程度将增 加 在压力和温度一定的条件下 作用时间增加则变性程度将增加 在时间和 压力一定的条件下 温度的升高则变性的程度会增加 消除或掩盖变性蛋白质 的致敏表位 4 4 g a u c h e r o n 19 9 7 等发现压力会使酪蛋白胶束分子分解成为小 分子 通过高压处理使蛋白分子的肽键被打断 导致酪蛋白的高压处理产物具 有低致敏性 45 1 2 4 3 糖基化对牛乳致敏性的影响 糖基化反应是蛋白质分子上的仅氨基或 一氨基与碳水化合物共价偶联 生 成糖基化蛋白的反应 该反应使乳蛋白的抗原性得到降低 同时乳蛋白的功能 特性也能得到提高 因而被广泛采用 据罗永康 3 l j 研究 糖基化反应 蛋白质分子与聚乙烯乙二醇及其衍生物产 生胶联 导致致敏原失去致敏性 如 牛血清白蛋白上结合聚乙烯乙二醇及其 衍生物可降低其免疫活性 h a t t o r i 2 0 0 0 等 4 6 j 通过糖基化反应以不同生物糖 基供体 葡萄糖 葡萄糖胺 壳戊糖和壳聚糖 即美拉德反应对 乳球蛋白进 行改性研究 结果显示 通过e l i s a 检测糖基化产物的致敏性发现 壳聚糖和 葡萄糖能使 一乳球蛋白的