（细胞生物学专业论文）人动点蛋白sgo1的功能及其调控.pdf

中谢科学技术大学博士学位论文 摘要 在有丝分裂中，染色体的分离通过纺锤体与动点之间的相互作用来调节，染色 体的正确排列与分离还依赖于染色单体之问的粘连。脊椎动物的s g o l 蛋白位于动 点上，对于防止有丝分裂染色体的早熟分离起着重要作用。s g o l 在中后期转换时 由a p c c 复合物介导降解，便于染色体在后期得以分开，因此s g o l 与存在于染色 体臂和着丝粒上的不同粘连方式有着必然的联系。s g o l 在体外与微管强结合，在 胞内具有调控动点微符的稳定性的作用。最近还发现s g o l 与p p 2 a 磷酸酶相结合 共同保护有丝分裂着丝粒处的粘连。但是，s g o l 蛋白的分子基础及其在有丝分裂 中的调控还是很不清楚。 这里我们的研究揭示了人的s g o l 蛋白( h s 9 0 1 ) 可以被n e k 2 a 激酶磷酸化， 这一磷酸化调控着h s g o l 的功能。我们利用生物信息学和质谱学的方法，找到了 h s g o l 被n e k 2 a 磷酸化的两个重要位点( s e r l 4a n ds e t s 0 7 ) ，并通过体外生化实验 结合质谱分析，证明了n e k 2 a 可以在细胞内外磷酸化h s g o l 的这两位点。通过研 究h s g o l 这两位点的模拟磷酸化和非磷酸化突变体，我们发现尽管n e k 2 a 的磷酸 化并不影响h s g o l 的动点定位，但是非磷酸化的突变体会破坏染色体的凝集及其 进程，产生较多的动点微管的错误连接，因此我们认为，n e k 2 a 对h s g o l 的磷酸 化，调控着动点与微管之间的连接，影响染色体的排列与分离。这一机制的揭示， 使姐妹着丝粒的粘连与动点微管的连接可以通过h s g o l 有机的联系起来。此外， 我们还发现，n e k 2 a 对h s g o l 的磷酸化，能够下调h s g o l 的相互结合蛋白p p 2 a 磷酸酶的活性，虽然我们还不清楚其中的机制，但是，根据已有的报道，p p 2 a 活 性的下调有利于有丝分裂后期的发生。 在这篇研究中，我们还对h s g o l 的降解机制及其在有丝分裂中的作用也作了一 些探索。我们的研究发现，位于h s g o l 的c 端的d - b o x 在h s g o l 的降解中起着很关 键的作用，突变该位点，会导致有丝分裂暂时阻断在中期，染色体排列在赤道板上 不能分开长达一小时以上，直到h s g o l 的d - b o x 突变体由于某种未知因素被降解， 染色体才得以分开，细胞一分为二，由此可见，h s g o l 的降解与染色体的分离密切 l i 中国科学技术大学博士学位论文 相关。此外，我们发现该b - b o x 突变体还使一些细胞产生较多的滞后染色体，而且 这些细胞的染色体在有丝分裂期阻断一段时间后，在还有滞后染色体存在的情况下 依然错误的分离；鉴于该d - b o x 同时也是潜在的a u r o r ab 磷酸化位点，因此我们 检测了该d b o x 突变体上a u r o r ab 的分布情况，结果发现a u r o r ab 在表达该突变 体的细胞中，动点上的量大大减少，同时在该d - b o x 突变体的细胞中，c e n 卜e 不 再定位于动点，参考a u r o r ab 与c e n p e 的功能，我们认为h s g o l 可以通过d - b o x 对a u r o r ab 和c e n p e 的调控来影响染色体排列与分离，或许h s g o l 正是通过这个 d - b o x 来感知姐妹动点之间张力。 最后，我们对h s g o l 的生化特性作了一些研究。我们发现b s g o l 的n 端和c 端 都是其定位于动点所必需的。而且n - c 端之间还存在相互作用，我们的荧光共振能 量转移( f r e t ) 实验在细胞内证明了即使在动点上h s g o l 的n - c 端之间也以相互作 用的形式存在，根据这些结论和一些预实验的结果，我们提出了一个h s g o l 保护 c o h e s i n 的作用模型，即h s g o l 是以n 吒端相互作用的方式形成同二聚体，并且形 成环状，将c o h e s i n 环包裹起来加以保护，在中后期转换时由于切割、降解、移走 等因素，使h s g o l 蛋白失活，染色体得以分开。 i l l 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t c h r o m o s o m es e g r e g a t i o ni nm i t o s i si so r c h e s t r a t e db yd y n a m i ci n t e r a c t i o n b e t w e e ns p i n d l em i c r o t u b u l e sa n dt h ek i n e t o c h o r e p r o p e ra l i g n m e n to fc h r o m o s o m e s a n dt h e i rs e g r e g a t i o ni nm i t o s i sa l s or e l i e so nc o h e s i o nb e t w e e ns i s t e rc h r o m a t i d s v e r t e b r a t es g o ll o c a l i z e st ok i n e t o c h o r e sa n di sr e q u i r e dt op r e v e n tp r e m a t u r es i s t e r e e n t r o m e r es e p a r a t i o ni nm i t o s i s s g o li sd e g r a d e db yt h ea n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x , a l l o w i n gt h es e p a r a t i o no fs i s t e rc e n t r o m e r e si na n a p h a s e i tw a st h e ns p e c u l a t e dt h a t s g oa c c o u n t s f o rt h ed i f f e r e n t i a lc o h e s i o no b s e r v e db e t w e e nt h ea r n l sa n dt h e c e n t r o m e r e so f m i t o t i cs i s t e rc h r o m a t i d s s g oi n t e r a c t ss t r o n g l yw i t hm i e r o t u b u l e si nv i t r o a n dt h a ti tr e g u l a t e sk i n e t o c h o r em i c r o t u b u l es t a b i l 耐i nv i v o ，c o n s i s t e n tw i t had i r e c t m i c r o t u b u l ei n t e r a c t i o n h u m a ns g o lb i n d st op r o t e i np h o s p h a t a s e2 a ( p p 2 a ) ，t h es g o l p p 2 ai n t e r a c t i o ni sr e q u i r e df o rp r o p e rc h r o m o s o m es e g r e g a t i o n h o w e v e r , l i t t l ei s k n o w no nt h em o l e c u l a rb a s i so fs g o ld e g r a d a t i o na n di t st e m p o r a lc o n t r o ld u r i n g m i t o s i s h e r ew es h o wt h a th u m a ns g o l ( i s 9 0 1 ) i sp h o s p h o r y l a t e db yn e k 2 ak i n a s e a n ds u c h p h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a t e sh s g o lf u n c t i o n u s i n g ac o m b i n a t i o no f c o m p u t a t i o n a lp r e d i c t i o na n dm a s ss p e c t r o m e t r i ca n a l y s i s ，w eh a v em a p p e dt h en e k 2 a - m e d i a t e dp h o s p h o r y l a t i o ns i t e s w eh a v ea l s op r o v e dt h a tn e k 2 ag a l lp h o s p h o r y l a t e h s g o l a ts 1 4 5 0 7s i t e sb yc o m b i n a t i o no fb i o c h e m i c a la s s a y s 加v i t r oa n dm a s s s p e c t r o m e t r i ca n a l y s i s w e h a v ed e m o n s t r a t e dt h a tn e k 2 a m e d i a t e d p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o no f h s 9 0 1a ts e r l 4 , 5 0 7i sn o tr e q u i r e df o rt i l el o c a l i z a t i o no f h s g o la tt h e k i n e t o c h o r e h o w e v e r ，e x p r e s s i o no fn o n - p h o s p h o r y l a t a b l em u t a n tg f p s g o i s l 4 5 0 7 a m u t a n tr e s u l t si nas i g n i f i c a n ti n c r e a s ei na t t a c h m e n te r r o r sa n dp e r t u r b e dc h r o m o s o m e e o n g r e s s i o n w ep r o p o s et h a tn e k 2 a - m e d i a t e x lp h o s p h o r y l a t i o no fh s g o li sc r i t i c a lf o r m i t o t i cp r o g r e s s i o na n dc h r o m o s o m es e g r e g a t i o na n dp r o v i d e sal i n kb e t w e e nm i t o t i c c l o c ka n ds i s t e rc e n t r o m e r ec o h e s i o na n dm i c r o t u b u l ei n t e r a e t i o n sa tk i n e t o c h o r e s m o r e o v e r , w ed e m o n s t r a t e dt h a ts u c hp h o s p h o r y l a t i o nd o w n r e g u l a t e sp h o s p h a t a s e a c t i v i t yo f p p 2 a 。t h e r e b yf a c i l i t a t i n gt h eo n s e to f a n a p h a s ei nm i t o s i s i v 中国科学技术大学博士学位论文 l nt h i sr e s e a r c h w eh a v ee x p l o r e ds o m em o l e c u l a rb a s i so fh s g o ld e g r a d a t i o n a n di t st e m p o r a lc o n t r o ld u r i n gm i t o s i s w es h o wt h a ta p c ct a r g e t sh u m a nh s g o lf o r d e g r a d a t i o nt h r o u g had e s t r u c t i o nb o xm o t i f ( d - b o x ) i ni t sc - t e r m i n u s m u t a t i o no ft h e d b o xc a u s e sh u m a nc e i l st ot r a n s i e n t l ya r r e s ti nm e t a p h a s em o r et h a nlh o u ra n d c h r o m o s o m e sw e r en o ts e p a r a t e du n t i lt h ed b o x m u t a n te n t i r e l yd i s a p p e a r e d t h e s e r e s u l t se s t a b l i s har o l ef o rd - b o xi nh s g o ld e g r a d a t i o na n df a i t h f u lc h r o m o s o m e s e g r e g a t i o n b e s i d e s ，t h ed - b o xm u t a t i o no fh s g o lr e s u l t e di ns i g n i f i c a n ti n c r e a s e si n c e l l sb e a r i n gl a g g i n gc h r o m o s o m e s ，b u ta f t e ra r r e s tf o rs o m et i m e ，c h r o m o s o m e ss t i l l s t a r t e dt ob e c o m es c a t t e r e da n dc y t o k i n e s i sw a si n i t i a t e di ns p i t eo ft h ee x i s t e n c eo f l a g g i n gc h r o m o s o m e s b e c a u s et h e r ei sa no v e r l a pb e t w e e nt h ed - b o xd o m a i na n d p h o s p h o r y l a t i o n c o n s e n s u sm o t i f so f a u r o r abk i n a s e s , w ee x a m i n e dw h e t h e rm u t a t i o no f d b o xa l t e r e dl o c a l i z a t i o no f a u r o r abt ot h ek i n e t o c h o r e a se x p e c t e d ，m u t a t i o no f t h e d b o xa f f e c t st h el o c a l i z a t i o no fa u r o r aba n dc e n p - e a c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s ，w e s u g g e s tt h a tm u t a t i o ni nt h ed - b o xl e a d st od e f e c t so fc h r o m o s o m ea l i g n m e n ta n d s e g r e g a t i o nt h r o u g hi t se f f e c to nt h el o c a l i z a t i o no fa u r o r aba n dc e n p - e o nt h eo t h e r h a n d ，h s g o im a ys e n s o rt h et e n s i o na c r o s st h es i s t e rk i n e t o c h o r et h r o u g ht h ed - b o xi ni t s c - t e r m i n u s f i n a l l y , w eh a v es t u d i e ds o m eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e ro fh s 9 0 1 w ei n d i c a t e t h a tb o t hn a n dc t e r m i n u sa r ee s s e n t i a lf o rk i n e t o e h o r el o c a l i z a t i o no f h s 9 0 1 t h e r ei s a ni n t e r a c t i o nb e t w e e nn - a n dc t e r m i n u s a n dt h i si n t e r a c t i o na l s oe x i s ti nt h eh s g o l l o c a l i z e da lk i n e t o e h o r eb yt h er e s u l t so ff r e t ( f u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ) a s s a yi nr i v e a c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s ，w ep r o p o s eam o d e lt oe x p l a i nt h e m e c h a n i s mo ft h eh s g o lf u n c t i o nf o rp r o t e c t i n gc o h e s i n h s g o lc a l lb ead i m e rt h r o u g h t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni t sn - a n dc t e r m i n a u s ，w h i c hf o r m sar i n ga r o u n dc o h e s i nr i n g t op r o t e c tt h ec o h e s i nc o m p l e x h s g o lw i l lb e c o m ei n a c t i v eb yc l e a v a g e ，d e g r a d a t i o n ， r e m o v ea n ds oo n ，a l l o w i n gt h es e p a r a t i o no f s i s t e rc e n t r o m e r e si na n a p h a s e v 巾国科学技术大学博士学位论文 a c a a p c ，c c d e c e n p d a p i g f p i f i p k t m a d m c a k m a p s m t p b s p m s f s d s 下b s 、怫 缩略词表 a n a l v h a s cp r o m o t i n gc o m p l e x c y c l o s o m e c e l ld i v i s i o nc y c l e c e n t r o m e r e - a s s o c i a t e dp r o t e i n 4 ，6 - d i a m i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n k i n e t o e h o r e m i t o t i ca r r e s td e f e c t m i t o t i ce e n t r o m e r e ，a s s o e i a t e dk i n e s i n m i c r o t u b u l e sa s s o c i a t ep r o t e i n s m i c r o t u b u l e s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n y l m e t h y l s u l p h o n yf l u o r i d e p a g es d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t r i sb u f f e r e ds a l i n e 、e s t e mb l o t 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中冒科学技术大学拥有学位论文的部分使用权， 郾：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅或借阅，可以将学位论文编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：丝j l 缝 刎7 年g 月f t 中国科学技术大学博士学位论文 卫虹拓畦 第一部分文献综述 第一节姐妹染色单体的粘连与粘连蛋白 姐妹染色单体之问的粘连既是复制后的双链d n a 损伤修复所必需的，也是双 极纺锤体形成的必要条件。这种粘连在d n a 复制时就已经存在，直到有丝分裂中 期。它的消失是后期开始时姐妹染色单体分向两极的前提条件。遗传学研究显示， 姐妹染色单体之间的粘连主要是由一个被称为粘连蛋白( e o h e s i n ) 的复合物来完 成的这个复合物由四个亚单位组成：s m c l ，s m c 3 ，s c e l 和s e e 3 ( g u a e e i e t a l 1 9 9 7 ； m i e h a e l i se ta 1 1 9 9 7 ；l o s a d ae ta 1 1 9 9 8 ；t o t he ta 1 1 9 9 9 ) 。这四个蛋白形成一个稳 定的复合物，可以从可溶性的抽提物中纯化出来，还可以和p d s 5 蛋白沿着染色体 d n a 共存于一些特定部位( h a r t m a ne t a l 2 0 0 0 ；p a n i z z ae t a l 2 0 0 0 ) 。粘连蛋白与 染色体相联系、提供姐妹染色单体之间的粘连的功能还依赖于另两个复合物：s c c 2 复合物( m i s 4 ，n i p p e db ) 和s c c 4 复合物( m i e h a e l i se ta 1 1 9 9 7 ；f u r u y ae ta 1 1 9 9 8 ； c i o s kc ta 1 2 0 0 0 ) 。研究发现有小部分的s c c 2 s c 科复合物可以和可溶性的e o h e s i n 相连( a r u m u g a ne ta 1 2 0 0 3 ) ，并在染色体上与e o h e s i n 共定位( c i o s ke ta 1 2 0 0 0 ； l e n g r o n n ee ca 1 2 0 0 4 ) 。 一、粘连蛋白( e o h e s i n ) 保证姐妹染色单体之间的粘连 在酵母中，e o h e s i n 复合物的s c c l 和s i n e 亚单位被发现紧紧结合在染色体的特 异位点上。有趣的是，沿着染色体臂的这些位点通常都与基因间隙( i n t e r - g e n i e r e g i o n s ) 有关，这些区域的左右侧翼基因( f l a n k i n gg e n e ) 都是转录集中区( f i l i p s k i & m u e h a2 0 0 2 ；g l y n ne ta 1 2 0 0 4 ；l e n g r o n n ee ta 1 2 0 0 4 ) 。与染色体臂不同，动点周 边的着丝粒区富集c o h e s i n ，跨度5 0 - 6 0 k b ，不过这种富集是由动点造成的而不是周 边着丝粒区本身的特性，动点具有刺激c o h e s i n 募集到其周边的能力( w e b e re a 1 2 0 0 4 ) 。通常认为c o h e s i n 富集于周边着丝粒区是由于动点的活性造成的，而不是 动点本身。这就引出了一个问题，到底是动点本身募集e o h e s i n 到其侧翼，还是动 中国科学技木大学博士学位论文文献综述 点在一定程度上影响了周边染色质的状态从而使其更容易募集c o l 幢s i n ? c o h e s i n 在 裂殖酵母s c h i ：删跚c h 嬲瑚y 嘲p o m b e 中沿着染色体的分布，与在s a c e h a m m y c e s c c w v i s i a e 中大致相同，不过，已经报道它富集于着丝粒的周边区域依赖于s w i 6 蛋 白，并与h i s m n eh 3 的三甲基化第九位赖氨酸结合( 图i 1 ，b e r n 锄dc ta 1 2 0 0 1 ； n o n a k ac ta 1 2 0 0 2 ) 。 图i - 1 c o h e s i n 沿染色体定位的几种模式( w a t a n a b l e , 2 0 0 5 ) 。 ( 8 ) 转录得推动，c o h e s i n 沿染色体滑动，积聚于染色体臂的某些区域。( b ) 在芽殖酵 母中，功能性动点蛋白组装加强了c o h e s i n 的募集( c ) 在裂殖酵母中，周边着丝粒异 染色质的形成募集了大量的c o h e s i n ，推测是通过c o h e s i n 与异染色质蛋白s w i 6 ( 1 i p l ) 的直接相互作用来进行的。s - i 6 在周边着丝粒区的定位依赖于h i s t o n e 鹏在第九位赖氨 酸的甲基化。而这个甲基化是受s u v 3 9 h 的墨盘蚰的同源物c l r 4 催化的。不论是跏f 还是c 1 r 4 的突变，都将破坏c o h e s i n 在周边着丝粒区的定位。 2 中国科学技术大学博士学位论文文献综述 在s c e r e v i s i a e 中c o h e s i n 的s e c l 亚单位在后期开始对麸着丝粒和染色体臂 消失，这是由于位点特异的硫基蛋白酶s e p a r a s e 将其切割所致( u h i m a n ne t a l 1 9 9 9 。 2 0 0 0 ) 。泛素连接酶a p c c 在双极纺锤体形成后被激活，促进了c y c l i nb 和s e c u r i n 的降解，而s e e u r i n 的降解解除了对s e p a r a s e 的抑制，活化的s e p a r a s e 特异性地切 割s c c l ，从而使姐妹染色单体分开( c o h e n - f i xe ta 1 1 9 9 6 ；f u n a b i k ie ta 1 1 9 9 6 ) 。但 是，突变s c c l 的s e p a r a s e 切割位点，将阻止s c c l 从染色体上消失，在s e p a r a s e 的 活性下，姐妹染色单体之间的粘连依然保持。此外。如果置换内源性s c c l 基因， 使其表达出来的s e e l 蛋白可以被外源性的t e v 蛋白酶切割，这时通过诱导t e v 蛋白酶的表达，可以使s c c l 突变体从染色体上解离，姐妹染色单体分开( u h l m a n n e ta 1 1 9 9 9 ，2 0 ) 。s c c i 在s p o m b e 中的同源物r a d 2 1 被s e p a r a s e 切割也是姐妹染 色单体得以分开所必需的。 大多数c o h e s i n 在前期或前中期从染色体上解离下来，但是到中期，依然可以 看到姐妹染色单体不仅在着丝粒而且在染色体臂上仍然有粘连，这就产生了这么一 个疑问，e o h e s i n 是否负责中期染色体的粘连( l o s a d ae ta 1 1 9 9 8 ；s u m a r ae ta 1 2 0 0 0 ) ，随后研究发现，原来还有极少量的c o h e s i n 残留在着丝粒处，不论是用抗体 检测d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 内源侄的e o h e s i n ( w a r r e ne ta 1 2 0 0 0 ；v a l d e o l m i l l o sc ta 1 2 0 0 4 ) ，还是在哺乳动物组织培养的细胞中用四环素诱导表达带t a g ( m y c 或g f p ) 的外源性e o h e s i n 到生理水平，再用t a g 的抗体检测，都发现着丝粒处的e o h e s j n 残余( w a i z e n e g g e re ta 1 2 0 0 0 ；g i m e n e z - a b i a n c ta 1 2 0 0 4 ；h a u f e = ta 1 2 0 0 5 ) 。后期开始 时，随着s c e l 的切割。着丝粒处的e o h e s i n 从染色体上消失，染色单体才得以正确 分开( h a u fe ta 1 2 0 0 1 ) 。中期染色体臂上的c o h e s i n 是很难检测的，不过已有的证据 显示，中期染色体臂上可能仍然残余e o h e s i n ，而正是这少量的e o h e s i n 将染色体臂 连在一起( g i m e n e z - a b i a ne ta 1 2 0 0 4 ) 。 这些研究暗示在哺乳动物细胞中存在两种截然不同的途径让e o h e s i n 从染色体 中解离下来。第一条途径开始于前期，包含了s a i 和s a 2 这两个亚基被p l ，k 激酶 磷酸化的过程( h a u f e ta 1 2 0 0 5 ) 。这个所谓的“前期途径”并不包含s e e l 被s e p a r a s e 切割这一过程( s u m a r ae ta 1 2 0 0 62 0 0 2 ) 。第二条途径只发生在后期启动时，包含了 s c c l 被s e p a r a s e 切割这一过程。如果用t a x o l ( 稳定微管) 或者n o c o d a z o t e h e s i n 在固定的染色质上是很难被检测的，所以，e o h e s i n 的某个亚单位没 能被检测出来，可能是它的确不存在，但也可能是抗体不好或者固定条件不佳引起 的。根据我们对s c c l 类似蛋白结构的了解，比如a ，k l e i s i n s ，它们是不可能不结合 s m c 蛋白头上的a t p 酶而起作用的( h a e r i n ge ta 1 2 0 0 4 ；# 4 7 7 3 ) 。所以，a - k l e i s i n s 不通过s m c 蛋白直接介导姐妹染色单体的粘连看起来是不可能的。 这种情况在果蝇中一样混淆，在果蝇中，一个称为c ( 2 ) m 的类似r e e 8 的减数 分裂特异性蛋自在减数分裂d n a 复制前聚集，但远在第一次减数分裂前就消失 中国科学技术大学博士学位论文文献综述 了，这种行为与它在减数分裂i 时将同源染色体连在一起的角色是很不一致的 ( h e i d m a n ng ta 1 2 0 0 4 ) 。一个最简单的解释就是有丝分裂的s c c l 类似蛋白r a d 2 1 在 果蝇的减数分裂和有丝分裂中，至少在很大程度上负责姐妹染色单体的粘连。但 是，现在还不知道，在果蝇的有丝分裂细胞中，是否真的存在r 矗d 2 l 这个蛋白。 在动物中，只有线虫是有很清楚的证据证明了c o h e s i n 是负责减数分裂的姐妹染色 单体的粘连的，在c e l e g a n s ，中，减数分裂特异性的r e e 8 类似蛋白不仅负责姐妹 染色单体的粘连，而且其分布模式与酵母中的r e e 8 相似( p a s i e r b e ke ta 1 2 0 0 1 ) ，现 在也已经证实在c e l e g a n s 中s e p a r a s e 对于交叉的解除也是必需的。( p a s i e r b e ke ta 1 2 0 0 1 ) 另一个与此相关的问题是是否e o h e s i n 在染色体上的存在一定与姐妹染色单体 的粘连相关? 答案自然是否定的，但这并不意味着c o h e s i n 不介导姐妹染色体的粘 连。在动物细胞中，e o h e s i n 通常在末期开始重新与染色体相连( l o s a d ae ta 1 1 9 9 8 ； s u m a r ae ta 1 2 0 0 0 ) ，换句话说，就是远在d n a 复制之前e o h e s i n 就上染色体了。因 此，在g 1 期细胞中，c o h e s i n 通过某种方式与染色质相连，但与姐妹染色单体的粘 连无关。甚至在芽殖酵母中，e o h e s i n 的s c c l 亚单位是在临近s 期时才合成，通过 g a l 肩动子表达的s e e i 在g 2 期与染色体稳定相连但并不形成姐妹染色单体的粘 连( u h l m a n n & n a s m y t h1 9 9 8 ；h a e r i n ge ta 1 2 0 0 4 ) 。这就意味着，如果粘连结构的确 是由c o h e s i n 形成的，那也只是在d n a 复制时形成。现在已经很清楚了，e o h e s i n 可以和染色质紧紧结合而不形成粘连的结构。这种现象可以帮助解释一些其它令人 困惑的观测结果：在芽殖酵母中，中期的姐妹动点可以被拉开2 0 0 - 5 0 0 h m ，丽此时 c o h e s i n 仍然与它们紧紧相连( g o s h i m a & y a n a g i d a2 0 0 0 ；h ee ta 1 2 0 0 0 ；t a n a k ae ta 1 2 0 0 0 ) 。有人认为，这一现象对e o h e s i n 维持姐妹染色单体的粘连这一理念提出了质 疑。尽管还未证实下面这个假设，但它是很有可能存在的：就是在酵母中，中期在 动点上检测到的e o h e s i n 实际上并不参与姐妹着丝粒的粘连，就像在g l 期的动物 细胞中，c o h e s i n 与染色体相连，或者说像在酵母中在d n a 复制后只是与染色体相 连而已的。 总之，c o h e s i n 在减数分裂和有丝分裂中的定位是与它提供姐妹染色单体的粘 连是相关的，而这种粘连又是染色体分离所需要的。但是在动物细胞的减数分裂中 中旧科学技术大学博士学位论文文献综述 c o h e s i n 的分布和作用还不是很清楚，尽管可能性很小，但下面这个观点还是不能 完全否定的：即c o h c s i n 在哺乳动物减数分裂中是否只扮演很小的角色。当然，我 们还需要知道在姐妹d n a 相连时，c o h e s i n 具体存在于哪个位置? 另一个重要的问题是：除了c o h e s i n 外，是否还有其他蛋白参与姐妹d n a 之 间的连接? 比如，f u r u y a 等( f u r u y a e ta 1 1 9 9 8 ) 曾经提出：s e e 2 和m i s 4 的蛋白同源 物形成了维持姐妹染色单体粘连的这种结构，而并不是e o h e s i n 本身。作者指出： “一个简单的模型是：m i s 4 与染色体在整个细胞周期都连在一起，通过另一个连 接蛋白，间接或直接的连接姐妹染色单体。在后期这个连接破坏，使寡聚m i s 4 裂 为两半，或者从染色体上移去连接蛋白，但m i s 4 仍与染色体相连。翻译后修饰诸 如蛋白的去磷酸化，可能在解除这个连接上起着重要作用。”由于这个原因，这类 蛋白就被叫做a d h e r i n 以区别于c o h e s i n 。然而，这个假说存在若干个闯题，首先， e o h e s i n 不仅对于在d n a 复制时建立连接是必需的，而且一直保持到后期开始，但 是不论是s e e 2 还是m i s 4 在d n a 复制完成后对于维持姐妹染色单体之间的粘连似 乎都是不必要的( c i o s ke ta 1 2 0 0 0 ) 。不过，这个结论还需进一步验证，因为使用温 度敏感型等位基因在复制后的细胞中失活s e e 2 和s e e 4 存在一个问题，就是当将复 制后的细胞转移到限制性温度时，可能并不能完全失活s c e 2 s e e 4 复合物；第二个 问题是，不论是在酵母( c i o s ke ta 1 2 0 0 0 ) 还是x e n o p u s 的抽提物( g i l l e s p i e & h i r a n o 2 0 0 4 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 4 ) 中，s c e 2 s e e 4 复合物对于e o h e s i n 定位在染色体上都是 必需的。这些发现的个最简单的解释就是，由于s e e 2 和s e e 4 的突变所导致的染 色体粘连缺陷，是由于此时不能将e o h e s i n 募集到染色体所致。最后，迄今为止还 没有证据表明在减数分裂或有丝分裂中s e e 2 s c c 4 复合物在染色体上的分布与粘连 相关，更不用说这种粘连在后期开始时是如何断裂的。 另一个被反复提及的e o h e s i n 替代物是d ，m e l a n o g a s t e r 的m e i s 3 3 2 及其在酵母 中的同源物s g o l 。l o s a d a 等( l o s a d ae ta 1 2 0 0 0 ) 指出e o h e s i n 复合物参与有丝分裂 从s 期到( 3 2 期染色体的粘连，但从前期到中期e o h e s i n 在粘连上并不扮演重要角 色，而是另一些蛋白，比如d m e l a n o g a s t e r 中的m e i s 3 3 2 在有丝分裂特异性的染 色单体粘连中起着重要作用。此外，s a l i e 等( s a l i ce ta 1 2 0 0 4 ) 也指出在脊椎动物细 胞的中期，c o h e s i n 负责着丝粒的粘连还不是很清楚的，极有可能的是在前期这种 中国科学技术大学博士学位论文文献综述 功能部分的通过另一个蛋白( 比如s g o ) 或者d n a 的拓扑结构( 比如耦合和 h o l l i d a y 连接) 来完成，因为此时大部分c o h e s i n 已经从染色体上移除。实验表明 s g o l m e i s 3 3 2 蛋白在有丝分裂期定位于周边着丝粒区，而且不论在有丝分裂还是 减数分裂i i 都与姐妹着丝粒的粘连同步消失( m o o r ee ta 1 1 9 9 8 ；s a l i ce ta 1 2 0 0 4 ) 。实 验还表明，s g o i m e i s 3 3 2 蛋白不论是在组织培养细胞的有丝分裂期( s a l i ce t a l 2 0 0 4 ； m c g u i n n e s se ta 1 2 0 0 5 ) 、还是在酵母( k i t a j i m ae ta 1 2 0 0 4 ；r a b i t s c he ta 1 2 0 0 4 ) 、d m e l a n o g a s t e r ( k e r r e b r o c ke ta 1 1 9 9 2 ) 的减数分裂i 、期，对于维持姐妹着丝粒的粘 连都是必需的。尽管有这些确凿的证据，但仍有几个原因可以说明为什么 s g o l m e i s 3 3 2 蛋白并不能形成姐妹染色单体之问连接的桥梁。首先，这类蛋白在 酵母和d m e l a n o g a s t e r 的有丝分裂中并不是必需的( k a t i sc ta 1 2 0 0 4 ；m a r s t o ne ta 1 2 0 0 4 ) i 其次，在动物细胞中，直到有丝分裂开始时，它们才出现在着丝粒区域 ( m o o r ee ta 1 1 9 9 8 ；s a l i ce ta 1 2 0 0 4 ；m e g u i n n e s se ta 1 2 0 0 5 ) ；由其他蛋白在s 期到 前期将姐妹着丝粒连在一起，s g o ! m e i