高中生物 专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离同步辅导与检测课件 新人教版选修1.ppt

课题3血红蛋白的提取和分离 dna和蛋白质技术 蛋白质是生命活动不可缺少的物质 随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成 人类跨入了后基因组和蛋白质组时代 对蛋白质的研究与应用 首先需要获得纯度较高的蛋白质 因此 从复杂的细胞混合物中提取 分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分 负责血液中o2和co2的运输 在本课题中 我们将以血红蛋白为实验材料 学习蛋白质提取和分离的一些基本技术 蛋白质电泳示意图 知识清单 凝胶色谱法 1 概念 凝胶色谱法也称作 是根据 分离蛋白质的有效方法 2 原理 大多数凝胶是由 构成的小球体 内部有许多贯穿的通道 当不同的蛋白质通过凝胶时 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离开 1 分配色谱法相对分子质量的大小2 多糖类化合物相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快 尝试应用 1 下列各项中 一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是 a 层析柱高b 层析柱的直径c 缓冲溶液d 样品的分布解析 分离度取决于柱高 为分离不同组分 凝胶柱床必须有适宜的高度 分离度与柱高的平方根相关 样品的分布也影响分离度 缓冲溶液的ph影响蛋白质所带的电荷 因此也影响分离度 只有层析柱的直径一般不会影响分离度 答案 b 2 凝胶色谱分离法分离蛋白质时 凝胶的种类较多 但其作用的共同点是 a 改变蛋白质分子通过凝胶时的路径b 吸附一部分蛋白质 从而影响蛋白质分子的移动速度c 将酶或细胞固定在凝胶中d 与蛋白质分子进行化学反应 从而影响其移动速度解析 凝胶的种类较多 但每一种凝胶内部都有孔隙 相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 答案 a 知识清单 缓冲溶液和电泳 1 作用 在一定范围内 缓冲溶液能抵制 对溶液 的影响 维持ph基本不变 生物体内进行的各种生物化学反应都是在 进行的 为了能够在 下准确模拟 的过程 就必须保持体外的 与体内的基本一致 2 配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 的缓冲液 1 外界的酸碱ph一定的ph下实验室条件生物体内ph2 1 2使用比例在不同ph范围内使用 尝试应用 人体血液中的缓冲物质都是由一种弱酸和相应的强碱盐组成 下列正确的一项是 a na2co3 nahco3b na2hpo4 na3po4c nah2po4 na3po4d h2co3 nahco3 d 知识清单 电泳 1 概念 带电粒子在 的作用下发生 的过程 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 的基团 在一定ph下 这些基团会带上 或 在电场的作用下 这些带电子分子会向着 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 的不同 使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 1 电场迁移2 多肽核酸可解离正电负电与其所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速率 尝试应用 1 电泳过程中 什么样的分子迁移速度最快 a 纤维状 大分子b 纤维状 小分子c 球状 大分子d 球状 小分子解析 电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小 形状的不同 一般来说 球形分子比纤维状分子易移动 小分子比大分子易移动 答案 d 知识清单 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 和 样品处理粗分离纯化纯度鉴定 尝试应用 1 洗涤红细胞时 离心所采用的方法是 a 低速长时间离心b 低速短时间离心c 高速长时间离心d 高速短时间离心解析 高速或长时间离心 会导致白细胞和淋巴细胞一同沉淀 得不到纯净的红细胞 进而影响后面血红蛋白的提取纯度 答案 b 2 下列试剂可用于血红蛋白释放的是 0 9 的生理盐水 甲苯 磷酸缓冲液 蒸馏水 柠檬酸钠a b c d 解析 在蒸馏水的作用下 红细胞吸水会破裂 甲苯能溶解脂质物质也有利于红细胞的涨破和血红蛋白的释放 答案 a 一 凝胶色谱法的原理 二 缓冲液及其作用原理在一定范围内 能对抗少量外来强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液通常是由一或两种化合物 缓冲剂 溶解于水中制得 调节缓冲剂的配比就可制得不同ph范围的缓冲液 缓冲溶液的作用是维持反应体系的ph不变 在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的ph下进行的 受到氢离子浓度的严格调控 为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境 就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的ph 三 电泳及其作用原理电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 许多重要的分子 如氨基酸 多肽 蛋白质 核苷酸 核酸等都具有可解离基团 它们在某个特定的ph中会带上正电或负电 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动 电泳技术就是在电场的作用下 利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小 形状等性质的差异 使带电分子产生不同的迁移速度 从而达到对样品进行分离 鉴定或提纯的目的 四 血红蛋白的提取和分离的实验操作1 样品处理 1 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白 采用低速短时间离心 吸出上层透明的黄色血浆 再加入五倍体积的生理盐水 重复洗涤三次 直至上清液中没有黄色 表明红细胞已洗涤干净 洗涤次数过少 无法去除血浆蛋白 离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 达不到分离的效果 2 血红蛋白的释放 红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂 释放出血红蛋白 3 分离血红蛋白溶液 将混合液进行离心后 会明显看到试管中的溶液的分层情况 第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液 4 透析 目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的装填 装填前 凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀 凝胶装填要均匀 色谱柱内不能有气泡 一旦发现存在气泡 必须重装 装填完后 立即用300ml20mmol l磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶 使凝胶装填紧密 2 样品的加入和洗脱 加样前 打开色谱柱下端的流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 按正确方法加样 不能破坏凝胶面 进行洗脱时 等红色蛋白质接近色谱柱底端时 采用试管收集 关于电泳的说法不正确的是 a 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程b 带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动c 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少d 用sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小 物质分离的方法原理 解析 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异 使电泳迁移率完全取决于分子的大小 答案 c名师点睛 电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小 形状不同 使带电分子产生不同的迁移速度 从而实现样品中各种分子的分离 变式训练 1 凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法 但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离 能分离的蛋白质分子之间必须 a 具有相同的相对分子质量b 相对分子质量不同 但都是相对分子量较大的分子c 相对分子质量不同 但都是相对分子质量较小的分子d 具有相对分子质量不同的蛋白质 解析 若在每种凝胶分离范围之外的分子 在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的 对于分子大小不同 但同属于凝胶分离范围内的各种分子 在凝胶床中的分布情况是不同的 分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内 而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内 这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短 分子较小的移动距离较长 于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床 这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离 分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时 按照分子量大小 排队 凝胶表现出分子筛效应 答案 d 血红蛋白的提取和分离实验操作 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入sds的作用是 a 增大蛋白质的相对分子质量b 改变蛋白质分子的形状c 掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别d 减少蛋白质分子的相对分子质量 解析 sds是阴离子去污剂 作为变性剂和助溶试剂 它能断裂分子内和分子间的氢键 使分子去折叠 破坏蛋白质分子的二 三级结构 在样品和凝胶中加入还原剂sds后 分子被解聚成多肽链 解聚后的氨基酸侧链和sds结合成蛋白 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量 这样就消除了不同分子间的电荷差异 使电泳迁移率完全取决于分子的大小 答案 c 名师点睛 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 sds 按重量比结合成复合物 使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷 消除了不同蛋白质分子的电荷效应 使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低 因此可从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的相对分子质量 变式训练 2 下列对凝胶电泳的相关认识 错误的是 a 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小b 蛋白质在sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小c sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定 还可用于蛋白质混合组分的分离d 凝胶中加入sds可以消除净电荷对迁移率的影响 解析 电泳技术就是在电场的作用下 利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小 形状等性质的差异 使带电分子产生不同的迁移速度 而sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 sds 按重量比结合成复合物 使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷 消除了不同蛋白质分子的电荷效应 使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低 答案 a 水平测试1 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 关于蛋白质的叙述 正确的是 a 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质b 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质c 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质d 二者根本无法比较 解析 在凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 而相对分子质量较大的分子无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快 答案 a 素能提高7 2011年广东理综 以下关于猪血红蛋白提纯的描述 不正确的是