PCR技术检测结核杆菌的进展.doc

pcr技术检测结核杆菌的进展第9卷天津医科大学vo1.9第4期jtmu2003no.4giotensinsystemandfibrinolyticfunctionj】.circulation,1993,87(6):196914】marrem,bernadetp,galloisy.eta1.relationshidsbetweenangiotensiniconvertingenzymegenepolymorphism.plasmalevels,anddiabeticretinalandrenalcomplicationsj】.diabetes.1994.43(3):384【15】barnasu,schmidta.illievicha.eta1.evaluationofriskfac-torsforthedevelopmentofnephropathyinpatientswithid-dm:insertion/deletionangiotensinconvertingenzymegenepolymorphism,hypertensionandmetaboliecontroljjdiabetologia,1997,40(3):32716】ohnoj,kawazus,tomonos.associationanalysesofthepolymorphismsofangiotensinconvertingenzymeandangiotensingeneswithdiabeticnephropathyinjapanesenoninsulindependentdiabeticj】.metabolism,1996,45(2):21817】marrem,bouhanickb.berrutg.eta1.renalchangesonhy-perglycemiaandangiotensinconvertingenzymeintype1diabetesj】.hypertension.1999,33(3):77518】邵咏红,黄英伟,陈劲松,等.血管紧张素转换酶基因多态型与糖尿病及其肾脏合并症发病的关系j】.中华肾脏杂志,1999,15(1):3619】levinsono.orens,yaginc.angiotensinconvertingenzyme(ace)genepolymorphisminfldiabeticcohortanddiabeticnephropathyj】.harefuah,1999,136(10):76820】fujisawat,ikegamih,kawaguchiy,eta1.metaanalysisofassociationofinsertion/deletionpolymorphismofan-giotensiniconvertingenzymegenewithdiabeticnephropathyandretinopathyjj.diabetologia,1998,41(1):4721】parvinghh,jacobsenp.tarnowl.eta1.effectofdeletionpolymorphismofangiotensinconvertingenzymegeneonpro-gressionofdiabeticnephropathyduringinhibitionofangiotensinconvertingenzyme:observationalfollowupstudyj】.bu,1996,313(7057):591【22】faras,azzopardij.ellards.eta1.acegenepolymorphismasaprognosticindicatorinpatientswithtype2diabetesandas-tablishedrenaldiseasej】.diabetescare2001,24(12):211523jgohdat,makitay,shiket.etai.associationoftheddgenotpyeanddevelopmentofjapanesetype2diabeticnephropathyj】.clinnephrol2001,56(6):47524】arazm,yilmazn,gungork,eta1.anogiotensinconvertingenzymegenepolymorphismandmicrovascularcomplicationsinturkishtype2diabeticpatientsj】.diabetesresclinpract,2001.54(2):9525】yoshidah,mitarait,kawamarat.eta1.roleofthedeletionofpolymorphismoftheangiotensinconvertingenzymegeneintheprogressionandtherapeuticresponsivenessofiganephropathyj】.jclininvest,1995,96(5):2162f26】kitamurah,moriyamat,izumim,eta1.angiotensiniconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphism:potentialsignificanceinnephrologyj】.kidneyintsuppl,1996,55:s101【27】jacobsenp,rossingk,rossingp,eta1.angiotensinconvert-ingenzymegenepolymorphismandaceinhibitionindiabeticnephropathyj】.kidneyint,1998,53(4):1002(20030107收稿)pcr技术检测结核杆菌的进展杨晶综述,张乃鑫审校(天津医科大学病理学教研室,天津300070)关键词】聚合酶链反应;结核杆菌;进展中图分类号】r52文献标识码】a文章编号】10068147(2003)04056604用聚合酶链反应(polymeraschainreaction,pcr)技术检测结核杆菌的报道国外始见于1989年ni;10多年来,应用分子生物学技术检测结核杆菌的研究工作取得了许多进展,部分已应用于临床,近年来,在一般pcr扩增技术的基础上,开发了若干更加敏感的新方法.1roche结核分支杆菌pcr实验和基因探针扩增作者简介:杨晶(1974一),女,博士研究生在读,研究方向:淋巴结病理.分支杆菌直接实验1.1roche结核分支杆菌pcr实验(rocheamplicorpcr)由瑞士roche公司开发,以生物素标记位于结核杆菌(mycobacteriumtuberculosis)l6srrna基因中高度保守区域的种特异性引物,用来扩增mbtcdna中的一段584bp大小的序列,然后,将扩增产物与种特异性探针在微孔板中进行杂交.应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定.检材需预先用naclnaoh处理(防止携带污染物).567amplicorpcr检测mbtc的敏感性,特异性分别为44%98%,93%100%【231.本方法与培养法的敏感性大致相当,但有例外,在一组痰液检测中,发现amplicorpcr法的敏感性(34%)低于培养法(37%)h1.1.2基因探针扩增分支杆菌直接实验(genprobeamplifiedmycobateriumdirecttest,amtdt)即转录介导扩增实验,由美国加州genprobe公司开发,先进行dna介导的特异性rrna等温扩增,扩增子用丫啶酯标记,然后作为化学探针进行核酸杂交,通过检测杂交探针的相对化学发光值来进行鉴定.amtdt的敏感性和特异性分另u达到63.6%83%和93.7%100%【51.1999年又开发了敏感性更高的加强amtdt(eamtdt),通常针对高度怀疑或需要排除结核病的病例,其敏感性和特异性可达85.92%88.3%和97.8%-99.1%【71.目前仅此两种方法获得美国fda认证用于直接检测呼吸系统mbtc,常用于mbtc筛选实验,较单纯pcr更敏感,这可能与有的菌株缺乏is6110插入序列有关隅】.对于痰涂阳检材,amplicorpcr和amtdt的敏感性(分别为98%和100%)显着高于涂阴的检材(分别为39.2%50%和40.5%46%)b一1,这可能与涂阴痰液中结核杆菌过少有关,因此,涂阴痰液的pcr检测应与传统方法(抗酸染色和细菌培养)相结合,并且要结合临床表现做出诊断.上述两种方法检测结果对于结核病患者的诊断和治疗具有重要意义:如果痰涂片阳性,pcr扩增阴性并且未发现抑制物,则提示患者可能并非由结核杆菌而是由其他分支杆菌感染,需要调整治疗方案,因而患者无需隔离,也避免了创伤性检查.对于痰涂阴患者,这两种pcr方法能够确定结核杆菌感染,而且比常规传统方法要快得多,一般只用3.59h【5】,为患者争取了治疗时间.2连接酶链反应(ligasechainreaction,lcx)1991年由barany建立.于lcx检测,在pcr反应体系中,含有taq连接酶,扩增靶序列位于编码蛋白抗原b的基因中(该基因为结核分支杆菌复合群所特有);扩增体系中包含两对引物并作为探针,每对引物分别用捕获半抗原和检测半抗原标ie;pcr扩增过程中,一对探针与dna一条单链上的蛋白b基因靶序列杂交时,探针之间几个寡核苷酸缝隙在聚合酶作用下填充,然后连接酶能将这对探针形成的扩增片段共价连接形成扩增产物,该产物与原有的靶序列互补,本身也可以作为下一次扩增循环的靶序列.这时的扩增产物一端含有了捕获半抗原,另一端含有检测半抗原.在lcx热循环仪中进行大约37次扩增后,扩增产物在lcx热分析仪上通过微酶联免疫测定法进行检测.lcx检测呼吸道标本的敏感性和特异性分别为75.7%97%和98.8%100%【9引,检测肺外标本的敏感性和特异性分别为53.6%86%和98%100%9-131,均稍高或显着高于培养法.对于痰液涂阳标本检测的敏感性可达100%【11,涂阴标本的敏感性为36.8%71.1%【9m.这提示对于痰涂阴标本的患者,lcx检测如果进行严谨的操作和分析,其结果也具有一定的价值.lcx的特点是:快速而简便,一般经58h可获结果,检测过程为半自动化,扩增系统完全封闭,不存在交叉污染或携带污染,对于呼吸道和非呼吸道标本的检测均有高度敏感性和特异性,对痰液涂阴标本也有一定诊断价值,可对分支杆菌种属进行鉴别u.,涂片阳性而lcx阴性时提示为非结核分支杆菌感染,结核杆菌培养阴性,lcx常可呈阳性,故不适于化疗随访u引,假阳性率和假阴性率较少.3巢式.pcr(nestpcr,npcr)在pcr反应体系中具有内,外两对引物,完成两次扩增.内引物位于靶序列两侧,具有菌种特异性;外引物则紧邻内引物而居其外侧,具有分支杆菌属特异性.外引物的退火温度高于内引物,先行pcr扩增,随后,温度降低时,内引物进行扩增.因此,在同一pcr体系中,靶序列得以成倍性扩增,提高了pcr的敏感性,且可进行菌种鉴别.npcr扩增的靶序列不尽相同,大多为is6110插入序列u,坫1,有的研究为mpb64,is986和16srrna等u,埔1.npcr适用于各种标本的检测,敏感性可达70%93.2%,特异性达85%98.6%,181.npcr较一般pcr敏感,可将同一组标本的敏感性从76.65%提高到93.04%11oi.与amplicorpcr和amtdt相比,npcr的敏感性稍差或相差不多,但是,npcr对痰液涂阴标本的敏感性则高于amplicorpcr和amtdt【1引,关键在于优化反应条件.npcr的特点是:快速(6h可获结果),价格较arnplicorpcr,amtd和lcx便宜,敏感性高,可检出100fgdnan9,尤其适用于涂阴标本,pcr阴转时间比细菌学滞后,故不适于化疗随访.可进行分支杆菌种属鉴别.4链替代扩增反应(stranddisplacementamplifi.cation,sda)这是一种等温dna扩增方法.靶序列dna加热变性后,引物与其对应dna单链杂交,在聚合酶作用下,产生具有hincii识别位点的5和3末端的靶dna序列;hincii限制性核酸内切酶切割该识别位点,依赖dna聚合酶的作用,在切割处延伸3端,进而替代另一条dna链;该替代链与引物杂交后又继续扩增,使靶序列呈指数增长;扩增产物与生物素标记的dna探针杂交,用化学发光酶联免疫实验进行检测.链替代扩增反应对于呼吸系统标本检测的敏感性,特异性,ppv(阳性预测值)和npv(阴性预测值)分别为100%,99.2%,85.7%和100%;对于涂阳标本,分别为100%,99.4%,93.4%和100%,涂阴标本分别为100%,80.8%,75%,100%f20j.它与amplicorpcr相比【2,对于培养阳性标本的敏感性分别为94.7%和89.5%,特异性分别为98.3%和100%.链替代扩增反应系统可同时扩增多份标本,整个过程仅需6h.本检测方法虽然敏感性高,但受到靶序列,引物序列,样品处理等多种因素的影响,具有一定的局限性.5q一复制酶扩增方法(qbetareplicaseamplifiedassay)噬菌体qb具有一种rna聚合酶,本方法通过特异地识别噬菌体qprna基因的二级结构进行rna基因复制,而不需要寡核苷酸引物.mdvrna是目前应用最广泛的一种小qb复制酶的非病毒模板.将一段作为探针的短序列插入mdvrna中,并不影响其复制,从而使探针序列得以扩增.qj3复制酶扩增具有较高的敏感性和特异性,提高了涂阴标本的检出率,降低了假阴性率,并可对标本中的结核分支杆菌进行半定量分析.美国已于1997年推出qp复制酶扩增仪和配套试剂盒1,使扩增在密闭的条件下进行,简化了操作,减少了污染,每次检测需36.5h,可自动分析10个样品.6探索中的分子生物学检测技术6.1分子信标技术(molecularbeacon)也称荧光定量pcr技术或实时定量pcr技术,出现于1996年,是一种能够定量的均相荧光pcr技术.在pcr扩增过程中引入了荧光标记的探针,游离单链dna探针以一种茎一环结构存在.环状结构与靶序列互补,为真正意义探针,茎状结构即探针的两臂由与靶序列无关的互补序列复性构成.两臂末端连有荧光报告基团和卒灭基团,茎环结构使两基团距离靠近,由于荧光素的共振能量转移而使荧光被吸收,从而失去荧光信号.pcr扩增过程中,探针与靶基因完全互补时,经复性可发生杂交,结果使探针5.与3端分开,卒灭作用消失而产生荧光,如果二者不互补,则探针又恢复茎环结构而发生卒灭作用,导致荧光消失.所以可以用荧光定量pcr仪在pcr过程中实时检测荧光强度或在pcr扩增结束后用荧光检测仪检测荧光强度而判定结果.1998年以来,国外渐有应用mbpcr进行结核杆菌检测的报导【2.与常规pcr技术比较,mbpcr的优点是:可定量分析,整个过程在密闭管内进行,可有效防止扩增子的污染,提高结核杆菌检测的特异性,省却pcr后处理过程,提高了样品分析速度,简化操作步骤.6.2dna指纹技术多用于结核病流行病学调查,主要对mbtc水平的鉴定.目前应用最广泛的是以is6110插入序列为基础的mbtc鉴定,is6110序列在mbtc进化中移动性小,不同来源mbtc插人序列is6110位置和数量不同,特别适于mbtc菌株水平检测,但此技术也存在一些问题,主要是有的mbtc缺失is6110序列或只有单拷贝,或一些地区mbtc指纹图谱差异小,难以对菌株水平鉴定.有学者提出应用短串联重复序列,间隔区dna或其他插入序列如is1081等为基础进行鉴定,总之这项技术还需进一步研究.另外还有限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,rflp)技术,也用于流行病学调查1.有报道通过对hsp65基因片段的分析,可以鉴别34种分支杆菌种类和亚种j.7结语总之,pcr技术引用到结核杆菌感染的诊断中来,提高了诊断效率,节省了时间,但是也存在它的一些弊端,有时会产生一些假阳性和假阴性结果.影响结核杆菌dnapcr检测的主要因素有:(1)引物,应用单一性引物和联合应用两套引物的敏感性和特异性不同.(2)检材,最常用的检材为569痰液,支气管灌洗液和胸水等,其次为来自肺外结核病较常见的器官(淋巴结,脑等),包括体液和石蜡包埋组织.少见检材有心包积液,耳瘘分泌物,肾上腺,腮腺等.造成假阳性的原因可能是:(1)pcr较传统方法敏感,易被污染,(2)引物特异性低,(3)电泳结果误判(片段大小相似所致).为了避免假阳性结果,要求实验室必须布局合理,并采取严格操作规程,重复使用物品器具必须每天用消毒液浸泡过夜等措施.假阴性结果的主要原因可能是:(1)扩增反应敏感性低,标本中细菌含量少或细菌扩散不均一,(2)标本中存在聚合酶抑制物,(3)扩增和培养所用标本体积差异巨大,(4)结核杆菌细胞生长丛集性,(5)菌株发生基因突变,缺乏所扩增的基因片段,(6)抽提dna时,细菌未破壁,(7)操作方法不当,技术不过关,实验器材不合格或试剂失效等.参考文献:【1】hanceaj,grandchampb,levyfrebauhv,eta1.detectionandidentificationofmycobacteriabyamplificationofmy-cobacteriadnaj】.molmicrobiol,1989,3:8432】gomezpastranad,torronterasr,carop,eta1.comparisonofamplicor,inhousepolymerasechainreaction,andcon-ventionalcultureforthediagnosisoftuberculosisinchildrenj】.clininfectdis,3.2001,32(1):173】lebrunl,mathieud,saulnierc,eta1.limitsofcommercialmoleculartestsfordiagnosisofpulmonarytuberculosisj】.eurrespirj,1997,10(8):18744】jatanask,nairmn,lahirikk,eta1.polymerasechainreac-tioninthediagnosisoftuberculosisj】.indianpediatr,2000,37(4):3755】gamboaf,fernandezg,padillae,eta1.comparativeevalua-tionofinitialandnewversionsofthegenprobeamplifiedmvcobacteriumtuberculosisdirecttestfordirectdetectionofmycobacteriumtuberculosisinrespiratoryandnonrespiratoryspecimensj】.jclinmicrobiol,1998,36(3):6846】bemermelchiorp,germaudp,drugeonhb.diagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyacommercialpolymerasechainreactionkitj】.patholbiol,1998,46(8):5977】bergmannjs,yuohg,fishg,eta1.clinicalevaluationoftheenhancedgenprobeamplifiedmycobacteriumtuberculosisdirecttestforrapiddiagnosisoftuberculosisinprisoninmatesj】.jclinmicrobiol,1999,37(5):14198】sethoesy,tayl,sngeh.evaluationofamplicorandis6110一pcrfordirectdetectionofmycobacteriumtubercu-losiscomplexinsingaporej】.tropmedinthealth,1997,2(11):109591browntj.powereg,frenchgl.evaluationofthreetom-mercia1detectionsystemsformycobacteriumtuberculosiswhereclinica1diagnosisisdifficultj】.jclinpathol,1999,52(3):193(10jyuenky,yamwc,wonglp,eta1.comparison6ftwoauto-mateddnaamplificationsystemswithamanualone_tubenestedpcrassayfordiagnosisofpulmonarytuberculosis【jj?11】12】jclinmicrobiol,1997,35(6):1385piersimonic,callegaroa,scarparoc,eta1.comparativee-valuationofthenewgenprobemycobacteriumtuberculosisamplifieddirecttestandthesemiautomatedabbottlcxmy-cobacteriumtuberculosisassayfordirectdetectionofmy.cobacteriumtuberculosiscomplexinrespiratoryandextrapulmonaryspecimensj】.jclinmicrobio1.1999.37(4):1236rantakokkojalavak,marjamakim,marttilah,eta1.lcxmycobacteriumtuberculosisassayisvaluablewithrespiratoryspecimens,butprovidesiittlehelpinthediagnosisofextra-pulmonarytuberculosisj】.annmed,2o01,33(1):5513】gamboaf,dominguezj,padillae,eta1.rapiddiagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyligasechainreactionamplificationj】.jclinmicrobiol,1998.36(5):132414】alonsop,ordunaa,bratosma,eta1.clinicalevaluationofacommercialligasebasedgeneamplificationmethodforde-tectionofmycobacteriumtuberculosisj】.eurjclinmicrobiolinfectdis.1998,17(6):37115】gamboaf,dominguezj,padillae,eta1.rapiddiagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyligasechainreactionamplificationj】.jclinmicrobiol,1998,36(5):132416】gomezpastranad,torronterasr,carop,eta1.diagnosisoftuberculosisinchildrenusingapolymerasechainreactionj】.pediatrpulmonol.1999,28(5):344171skotnikovaoi,s0bolevay,demkinv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