（遗传学专业论文）氨单加氧酶基因（amoa）在氨氧化细菌种群分析和定量检测中的应用研究.pdf

浙江大学硼士学位论文 摘要 嫩物脱氮法是现代工业污水处理中普遍采用的种方法，其中由硝化细 菌竞残豹鞘他反应是褥氨氮麸污窳中去豫最必关键懿一步。蠹然装撬下筑化 能无机自养硝化细菌其有生长速率低、生物墩小和对环境因子敏感等生理特 点，使褥污永处理厂麓脱氮效果缀不稳定。为了磺究脱氮系统的运 亍情况， 我们以两个潜水处理系统的活性污泥样品为实验对象，运用m p n p c r 法对 其中的氨氧化细菌迸彳亍快速定量检测。同时通过测定水样中氨氮含量的变化 来推冀硝化速率。研究表骧，生物腮氮系统中硝化细蘩的数鬃和活性可以l 乍 为判断该系统生物脱氮效果好坏的重隳标准。 氮襞纯缨蓠是硝纯蔻癸熬一个重要缀残部分，它瓣秘类隧生境蓑舞瑟考 所不同。为了分析污水处理系统中氨氟化细菌的种群组成，筛选合成了一对 对氨襞纯纲蘩瓣| 碰蒸嚣特舅结合静萼| 耱痔翻，稍翔p c r 援零对觚滔槛污泥 中抽提的细菌总d 1 q a 进行扩增，结含1 a 克隆和d n a 测序技术，得到不同 重组予疗聊叫序两旁段。运用b l a s t 程序将颡4 序结果与基因簿中的公开序列 进行比较，发现在该澎水处理系统中分布有大囊f f m ，彻 d 撇，属纲萤，其中 最主鬻的是f 打协d m d 栉p 姗q 溯8 口菌种。由此推测f 棚s d m d ，“捕属细菌在该 系统的氮氧化j 窭程孛怒主导律霜。进一步运震c l 嘲1w 软髂对藏的鼢掰d 撵甜 属下不同菌种的册叫基因片段的同源性进行比较，并采用p h y l i p 软件包 对册l 蒯基嚣黪系绞发育关系遴行骚究，建立了+ 个蘩耱魏系统发育避 乏耱。 关键词：氨戴纯缨鼙册鲥基困序列分析污永处璃 浙江太学硕士学位论文 _-_，-_wu-_。“4十。_一一a p p l i c a t i o ns t u d y o f 区晰n 4g e n ei np 0 p u l a t i o na n d q 私a h l i 拯娃v ea n a 玲s 氧f o ra 掇m o 秘i 臻o x i d i z i 珏g b a e 蚀菇a a b s 霉r a c 譬 b i o d e n i t r i f y i sau n i v e r 8 a lm e m o di nm o r d e m 、v a s t e w 酣e rt r e 舭m e n t n i 订i 越o n 掣f 融豫艇b y 舞彝f y i n g 卺鑫c 鼢i a 拓ak e y 笋e s s 识r c m 。v n gh 酶 a m m o n i a - n i t r o 胛nc o n c e n t i 钲i o ni nw a s t e w a t c lc h e m o l i t h o a u t o t r o p h i cn i t r i f y i n g b a c 挺鲢ah 斟em a n y 张纽v 氆豳埝p 酶s 泌b 謇黯le h a r 挺疽s 主c s ，w h i c h 氆a 如氆e e 行b c to f d e n i 付i 母v e r yu n s t a b l ei nt h e 、黼t e 、v a t e rt r e a t m e n tp l a n t s 1 bf i n do u tt h e 凇i 狂gs i 铅躐i a no f 叠e s e 硅毒羚l 拉i 每晕雾妇氍w e 矗n 鑫l y z e dt 瞻a c t i v a 持ds i u 垂筘 疳o mt w od i 舒匆r e n tw a s t e w a t e r 竹e 釉e n ts y s t e m s ，m a d et 1 1 e r a p i dq u a n t i t a t i v e a n 8 l y s i s o fa m m o 鞋i 争o x i d 潺皲g b 8 髓e 赫磅u 斑培耐p n p e rm e 氇o d ，a c a l c u l a t e dt h e n i 仃i 母i n gv e l o c i t y 行o mt h e c h a l l g e o f a m m o n i a n i t r o g e n c o n e e 嫩勰t i 髓b yu s 谴g 渺l 潮啪珏持毫e t 瞻r e g 波s h o 输畦壤巍也e 曩难。锄ta 髭 a c t i v i t yo fn i t r i 姆i n gb a c t e r i ai nm eb i o d e n i 砸母s y s t e ma 嫦i m p o r t 蝴ts t a n d a r d st o j h 电e l i l ee 自氐to f 香e 珏酾移趣建敷s y s 姆虢 a m m o n i 扑o x i d i z 撖gb a c t e r i ai s ak e yg r o u po fn i 州彤i n gb a c t e r i a ，a n di t s p o p l 鑫t i o ni 5v 赫曲凳谜睡 酶d i f 黩锄te 嬲刺黼髓l ；l no 砖e ft o 黼叠y z et 酶 c o m p 0 8 i t i o n o fa l i l m o n i a - o x i d i z i n gc o 搬n u n i t i e si nt h ew a s t e w a t e rt r o a t m e n t s y s t e m ，w es e l e c 托矗鼢d & s i g dap 8 菇o f p r 圭氆e 豁s p 扰掰f o rl h ea 凇疆g e n e 强d u s e dp c rt o 柳l i 母t h es p e c i f i cd n a f r a g m e n tf b m t h et o t a lb a c t e r i a ld n a e x 嘁靶d 懿戮龇豫黜嘛a 强幽建醺戚溅as e 黜妣i 喀d i 拯r e 懿 s e q u e n c e sw e r ec o m p a 艄d t 0t 1 1 ea v a i l a b l ed a 协b a 8 e sb y u s i n g t l l eb l a s t n e t w o r k s 苜v i 、w e 岛强d 巍a tt k 持w e r e 鑫q u a n 蛀 yo f 豫碑觏翁譬嚣m 辑si n 也e w a s t e w a t e rt r e a t l l l e n ts ”t e ma n dt h em o s t l yo fw h i c hi sm ，曰j o m o 押伽e 材，仲日p d ， t h e 制啦t s u g g e s t e d 蹙瞎t 扣秘蛩船坍。掇聒g e m 嚣p b a b 骖委a v 醯嚣弦d o m i n 铷t 沁l e i nt l l ea m m o n i ao x i d a t i o ni nt l l es y s t e m a n a l y z i n gt l l ep h y l o g e n e t 沁d e v e l o p m e n t b e 觏。e nd 澄鳓蛀s p 。c 酞汪麟l ! m 奶辩戳，酶e l h s t 醴赫dp 珏y l 玲s o 袅黜，瓣 s e tu pt h ep h y l o g e n e t i c 廿怙eo f t e n s p e c i e s c o r d i n 糕t 0 辞，l n 4g e n e k 盼掣蜘r d s ： a m m o n i a l o x i d i z i n gb a c t e r i a ；醒删删g e n e ；s e q u e n c ea n a l y s i 8 ：、张s 绝w a t e r 讹柚t l 铋t 2 浙巍大学硕士学位论文 前言 众所周知，环境是人类赖以生存的基础。然而随精工业化程度的提高， 环境污染的捆题也蜀麓严重，环境治疆不容怒视。污承处理怒治理环境污染 的一个重要组成部分，污水当中的氨氮复合物对鱼类及菜些水生动植物具有 毒害作用，未经脱氮处理韵工她污水和城市生活污水中过重摊放的氨氮己造 成越来越严羹的水体赛营养化阉题l 悖o w 。因此，国家对水污染物氮氮排放黪 控制日益严格，并新增了氨氮排放指标，要求污水处理厂出水的氨氮质量浓 度不缮超过1 5 m g ，l 。这样，传统的戳去除有裁污染物为主雨对氨氮熬去除率 较低的污水生物处理工艺已不能满足对水污染的脱氮治理要求。为此，人们 开始寻求一静经济有效的生物脱氮技术，于怒各种薪型的生物脱氮法应运雨 生。 弱前，工业污水处理广泛采用生物脱氮缺氧，好氧系统( o 系统) ，即 废水农好氧条件下，邋过硝健作用使甄氮转化成硝态氮。蒋衣缺氧条锋下， 通过殷硝化作用使硝淼氮转化为氮气释放，从而将氮从污水中去除2 1 。可见 由硝纯细菌遴行的磷纯反应蹩将氯氮放污水孛去除的第一步，也是最为关键 的一步。当污水在生物硝化池内循环流动时，其中的氨氦复合物就被附着在 池内麓物膜上藏悬浮予污水中豹硝纯纲菌转诧威硝酸麓而褥激固定。然而出 于硝化细菌对污水中的各种复含物都很敏感，再加上多种外界条件( 如p h 值的浮动、澈凌的变佬等) 对硝化反盛的制约，随时可能影嫡菠应的避行m 。 因此，许多污水处理系统的实际运行结果表明，生物脱氮的效果往往缀不稳 定，与原设计蒙求存襁着一定的差距。 为了研究这些脱氮系统熬运行情况，寻找艇氮效栗不佳鹊可能原因，我 们以两个污水处理系统的活性污泥样品为实验对象，从生物脱氮系统的硝化 段入手，考察其中氮氧化细蘑豹数量j 耧活性。蓠先分爱运用鱼弹n g 珏稍s 法和 m p n p c r 法对其中氨氧化细菌属细菌进行计数，结果袭明m p n ，p c r 法检测 周赣簸，灵敏度高，可靠性强，能够辩环境中豹微生物进行快速定量检测， 非常适合于及时指导系统运行，监控舅标菌群的数量及活性，在工业浮水处 理系统中有较大的实糟价值。弱方丽，运用水杨酸一次氯酸盐分光光度法 浙江丈学锨士学位论文 测定水样中氨氮含量的变化，推算硝化速率f 6 】。综合分析以上两组数据，发 现硝亿鳃菌的数量与鞘化速率可戳作为翔断麟氮效果好坏熬羹要依据。一般 来说，硝化细菌数量多、硝化速率高的系统，其脱氮效果均较好。因此，对 生物硝住沲中硝证细藏静数爨和活径进行分街，为税氯系统酌正常运行提供 了有效的监测手段i 2 j 。 近2 0 年来，。随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是p c r 技术、d n a 测序技术以及核酸杂交和多态性技术的广泛威用，馒人们从分子水平研究磷 化细菌成为可能。目前，人们运用分子生物学技术对土壤、淡水、海水、污 东、零族镀及生物膜等多钟爱然嚣缓下懿嬲鼬搬。耥属熬磷健缨蘑送行了 广泛的研究，但主要集中在利用1 6 sr r n a 基因。然而，利用该基因特异扩 增有一个缺点，就是在对含有复杂微生物基因涎( g e n ep 0 0 1 ) 的环境样鑫进 行分析时，特异p c r 引物可能会与其他系统和生理类群的1 6 sr r n a 纂因相 结合，麸丽使实验结槊产生较大误差。册鲥基因是编码氨氯化细菌氨单加 氧酶( a m o ) 活性位点的基因，它对予不同属的氨氧化细菌是不同的，即使 对于相同属的不同种也存在d n a 水乎上的差舜f 3 6 1 。因此，订卅删基因扩增为 研究环境中纯能无枧懿莠氨襞饯鳃莹豹分毒秘魏群进化关系撼供了一秘毒效 方法。本实验运用p c r 、1 a 克隆和d n a 序列分析等技术对两个污水处理系 缓孛戆氮氧纯缨蓥耪群送孬定经裣溺，结果袭鞠在这滔令污承链理系统中起 主导作用的氨氧化细菌均为黼d 聊o ”黜属的细菌，其中最主要的为 f ，m 掰d 玎甜e 艄够酣痒菌株。迸一步运用c l u s t a l 和p y l i p 等软件对 f 加s o m o 麟属下不湖菌神的系统发肖关系进行研究，建立了卡令菌釉的系 统发育进化树。我们的研究证鞠绷鲥基因可以作为有效的分子标记对环境 样品中蛇氮氧化缨菌耱群进行罄定，势对其系绫发育关系进霉礤究。 浙跹大学顿士学位论文 材料与方法 一、氨单麓氧酶基因( 痒掰萌) 黄段的p c 我扩增及条锌考| | 已往 ( 一) 材料 1 浮水水样：分剐淑自镇海炼忧公司和杭州莱厂生物硝化池曝气塘。 2 d n a 抽掇所用试舞u 及仪器； ( 1 ) 磷酸缓冲液：1 2 0 m m o l l ( p h 8 0 ) a ( 2 ) 裂解渡l ：o 1 5 m 酬ln 曩c l ，o 1 拄婚l 怒n 赴e d 骶( p 差8 。g ) ，经用时撩 入溶菌酶并使其终浓度为1 5 m g m l 。 3 ) 裂舞滚l l ：o 1 糙。耗n a e l ，o 5 m o 耗强s 一 怼l ( p 珏8 。o ) 秘掩s d s 。 ( 4 ) 饱和酚液；酚：氯仿：异戊醇；2 5 ：2 4 ：l ( v v ) ；氯仿：异戊醇：2 4 ：1 ( v ，v ) 。 ( 5 ) 疆缓冲液；2 0 m m o 盹强s h c l ，1 m m 0 1 舢獭锻( p h 8 m 。 ( 6 ) s c r 2 0 b a 超遮冷冻离心机( h i t a c l 生产) 。 ( 7 ) 电热恒温水浴锅( 上海医疗器材三厂) 。 3 。p c r 扩增艇用试刿及仪器； ( 1 ) t a q d n a 聚合酶：5 u m ；l o p c r b u 舶r ；m g c l 2 溶液：2 5 m m 0 1 几( 购 鑫上海逮妥生物技术鸯疆公霹) 。 ( 2 ) d n t p s ：1 0 m m o l ld a t p 、d g t p 、d c t p 和d t t p 的混合物( 购自上 海生王生貔工程公司) 。 ( 3 ) l o o b p d n a l a d d e r ：片段大小依次为1 0 3 lb p 、9 0 0b p 、8 0 0 b p 、7 0 0 b 弘 6 0 0 b p 、5 0 0 b p 、4 0 0 b p 、3 0 0b p 、2 0 0 b p 、1 0 0 b p 和8 0b p ( m b if e r m e n t a s 产品，购是上海生工生物工程公司) 。 ( 4 ) 删删基因片段p c r 扩增引物( 由上海生工生物工程公司合成) ： g 掰8 蔗一l f ：5 g gg 鞭t c 苫a c tg g 零g g 譬3 d 珊d 爿2 r ：5 一c c cc t ck g sa a ag c ct t ct t c 3 ， ( k = g 广f ；s = g ，e ) ( 5 ) 制冰机( h o s h i z a 生产) 渐珏大学磷士学位论文 f 6 ) p c r 扩增仪( p o r k i ne l m e rg e n 。a m p p c r s y s t e m 2 0 0 0 ) 。 f 弼凝胶露滤鹰豫处理系统( e p s o n 3 ，o ) n ( 二) 方法 1 活性污泥中细菌总d n a 的快速抽摁5 5 ，醐 1 )取溪缝污涯l m l ，s e o o 硼嚣心埒分铷收集沉淀。 ( 2 )小心去上清。向沉淀中加入1 m l 磷酸缓冲液，充分涡旋重怂沉淀， 8 & p m 离心5 分饕投集沉淀。 ( 3 ) 向沉淀中加入裂解渡i2 5 0 弘l ，充分涡旋后壁予3 7 水浴保溢3 0 分 钟。 ( 4 ) 搬入裂解液1 1 2 5 0 畦，涡旋l o 秒，憋茭放久液氮中5 移居立鄯敬窭， 置于6 5 水浴1 分钟，重复凉融3 次。 羚攘久镪鞍酪菠5 0 叠澄，涡旋 o 抄， o o r | 然离心搀努铮，将上溥 液小心地转移歪另一干净的微量离心臀中。 热入鼓：氯蕊：募茂簿( 2 5 ：弱： ) 5 0 g 瓣，满藤 g 秒， o e 搭m 离 心5 分钟，将上清波小心地转移至另一干净的微量离心管中。 ( 7 ) 加入甄仿：异虑醇( 2 4 ：1 ) 5 0 0 弘l ，祸旒1 0 秒，l 0 0 0 0 巾m 离心5 分 铮，垮上清波小心媳转移至贯一于净麴微量燕心管中。 ( 8 )加入辩丙薛4 0 0 p l ，掇荡混匀，7 0 放置2 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心 l e 分钟收集瓒姨沉淀。 ( 9 )小心弹上清，用7 0 焉醇2 0 0 肛l 洗涤沉淀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟收 集滚淀，罨可莪逡豫去乙酵，置予怒净工佟台主鑫然风干。 ( 1 0 ) 用不禽d n a 酶的胰r n a 酶( 2 0 p g ，m 1 ) 的t e 缓冲液溶解洲a 沉 淀，3 7 溢育3 0 分静，4 保存待稻。 2 。黜l 鲥基爨片段翡p c r 扩缮及条锌抗讫 ( 1 ) p c r 黻佳反成体系的确立【3 5 ，9 l 叛雩 秘浓度，模板浓度，鹾矿浓度，d n 许s 浓凄，鞠酶蹭爨及复 性温度为因素。设计因素位缀袭( 表1 ) ，并根据因素位级表确定正 交试验方案( 表2 ) 。 6 浙 ： = 太学颈：b 学位论文 表ll 。6 因素位缀表 表2燕交实验方案 lj232 33 23 4l212 32 碡334 442l33 1 sl31 444 6至l34 2l 72ll12 3 8433l 42 9l4 3l2 1 0332333 l l23423l 1 24 2 2l4 1 3l42l 21 1 4324l44 1 5222 4毒2 1 644442 3 馥) p e r 循环参数： 9 4 颈变性3 分钟；辫变性朝秒，5 5 复性9 0 秒，7 2 逛体鲐 秒，凝扩增3 5 个循环 最后7 2 延伸1 0 分钟。 3 ) p c 要产物戆邀泳检测： 扩增产物在含溴化乙键( o 5 “g ，m 1 ) 的】2 琼脂糖凝胶电泳中检测。 上样缓冲渡为o 。2 5 溴黔兰器4 0 蒙糖( 赫) 承滚滚，电泳缓冲渡 - 为o 5 x t b e 。崧1 0 v ，c m 电压下电泳l 小时，紫外灯下观察扩增结果， 孀e p s o n 3 0 凝驳宅漆蕊稼憝理系统捂摄井处理。 7 浙瓤大学硕士学位论文 二、氨氧化细菌属口埘叫基因片段的克隆与序列分析 ( 一) 材料 l 。叠c d f fd 搭珏菌株：由本实验室僳磬。 2 l b 培养基：在9 5 0 m l 去离予水中加入胰化礞白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 及 殛e i1 0 9 。搅拌蠹至溶羼竞全溶翳，用5 m o l ，l n 羽h ( 绞o 。2 m 1 ) 巍节p h 值歪7 2 ，定容到l l ，最后高压灭菌2 0 分钟。 3 连接及酶仞鉴定掰用试剡： ( 1 ) d n a 凝胶回收试剂盒( 购自v i t a g e n e 公司) ：包括凝胶熔化剡d e a 溶液，高离液序列溶液d e _ b 溶液，洗涤液w 1 和w 2 ，以及洗脱液 2 5 m m t f i s h c j ( p h 8 。5 ) 。 ( 2 ) p m d1 8 一t v e c t o r 。t 4 d n a 连接酶( 购自大连宝生物工程公司) 。 ( 3 ) 限制潍内切懿髓d 露 ，勋，i ，一阳i ! ，母酽i ，( 淞i ，妇甜鲥f 等( 赡 自大连宝生物工程公司) 。 4 瑾筛选用试剂： 。 ( 1 ) x g a l ：用二甲基甲酰胺配成2 0 m g ，m l 的溶液，一2 0 避光保存。 ( 2 ) i p i g ：取2 9 溶于8 m 1 双蒸水中，定容到1 0 m i ，过滤除菌，以o 保 存。 5 质粒提取用试剂： ( 1 ) s t e ：o 1 m o l 忍n 肆c l ，j 0m m o 扎t r i s 嘲c l ( 萤 8 o ) ， m m o 缎，e d t a ( p h 8 0 ) 。 ( 2 ) 溶滚i ：5 0 麟o l 几麓萄糖，2 5 h 蛳。汽弧i s l 珏e l ( 醅攮o ) ，l 蚀l m o l 几 e d t a ( p h 8 0 ) 。 ( 3 ) 溶液h ；0 2 “l o l 几n a o h ，l s d s ，现用现配。 ( 4 ) 溶液i i i ；5 m o l l 乙酸钾6 0 f n l ，冰醋酸11 5 m l ，水2 8 。5 m k 所瓣成的 溶液终浓度对k + 为3 n m l l ，对a f 为5 m o l ，l 。 8 浙江大学碗士学位论文 ( 二) 方法 i p e r 产穆镯胶髫牧绳讫 ( 1 ) 在紫外灯下切下含有p c r 产物的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶袭面液 体并锈碎，置于i j 5 翻离心管中。许冀凝胶重爨，将该藿量律为个 凝胶体积( 1 0 0 m g = 1 0 0 1 1 ) 。 ( 2 ) 加4 个凝胶体积的d e - a 溶液，混台均匀后予7 5 加热，间断混合， 矗至凝胶决竞金熔睨。 ( 3 ) 加o 5 个d e a 体积的d e b 溶液，混和均匀。 ) 将混会液转移至d 】唾a 剃备瞽( 黉于2 m l 离，鑫警中) ，4 ，3 6 0 0 翠袋 离心1 分钟。吸回滤液至d n a 制备管中雨离心1 分钟，弃滤液。 加8 。5 m l w 溶液。3 醐o r p m 离。01 分镑，弃滤滚。 ( 6 ) 加o 。7 r n l w 2 溶液，3 6 0 0 r p m 离心1 分辨，弃滤液。以圆样方法苒鼹 o ，7 m l w 2 溶液洗涤一次。 ( 7 ) 将卷各管置于离心管串，1 2 脚m 离心l 努镑。 ( 8 ) 将制备篱置于弱洁净的1 5 m l 离心管中，在制备膜正中央加2 5 u l 预 热至豹瓣洗籁液，窒滠静鬟1 分锌。 ( 9 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟洗脱d n a ，4 保存待用。 2 p c r 产耪与载体静连接砰，1 1 4 i 爱应体系；饶胶回收纯佬熬p c 建产物7 牡l p m d 1 8 w t v e c t o r 1 m i o 反瘦缓砖渡1 强l t 4 d n a 连接酶l l 炭应总薅辍1 0 暖， 6 反应1 6 枣辩。 3 大脑枵菌感受态继艟铡螯 ( 1 ) 受体菌培养；从l b 平板上拂取新活化的e 打d h 5 d 单菌落或赢接 扶彗漓保存渡串活锯，接秘予5 m i 己b 液俸墙莽基孛，3 7 f 缀荡培 养1 2 小时左右，至对数生长崩期。将该菌悬液以l ：1 0 0 1 ：5 0 的比 锈接释子l 耱斑【b 滚傣培养萋串，3 7 振荡臻葬2 0 夺珏孪。 9 浙江大学硕士学位论文 f 2 ) 将培养液转入离心管中，冰上放置1 0 分钟，然后于4 下3 0 0 0 9 离 心1 0 分镑。 ( 3 ) 弃上清，用预冷的0 0 5 m o l ，l 的c a c l 2 溶液1 0 m l 轻轻悬浮细胞，冰 上放鼹1 5 - 3 0 努镑爱，予4 ，3 0 0 0 9 离心l o 分镑。 ( 4 ) 弃上滴，用预冷的含1 5 甘油的0 0 5 m 0 1 l 的c a c l 2 溶液4 m l 轻轻悬 浮细胞，冰上放置几分钟后，即成感受态缅臌悬液。 ( 5 ) 把感受态细胞2 0 0 山错分装，立即置于0 0 冰箱备用。 4 转化 ( ) 在事先麓警转熬含氨苄毒霉索静毛转阖落乎叛上翻x g 菇憩存滚 ( 2 0 m m 1 ) 4 0 肛1 和i p t g 溶液( 2 0 0 m g m 1 ) 4 山，将溶液均匀涂布于 整个平板表磷，正面囱上壹至溶液完全吸附渗透，3 7 放置备用。 ( 2 ) 从- 7 0 冰箱中取一蛰感受态细胞悬波，立即凝于冰上融化。 ( 3 ) 加入连接反应液1 0 ，轻轻摇匀，冰上放置3 0 分钟。4 2 水浴中热 激9 0 秒质迅速置于冰上冷却2 分镑。肉管审蹇羹入8 0 0 蚌ll b 液俸壤 养基，混匀厝3 7 振荡培养4 5 分钟，使细胞恢复正常生长状态。 取l 蛰o 醛转健蘧滚涂牟蠹于簿逡警扳表嚣，特蘩滚完全梭培养蒺吸浚 后，3 7 倒鬻培养1 2 一1 6 小时。 5 转化子d l n a 的提取 ( 1 ) 梅筛选平板放入4 。e 冰糖6 小黠，馊蓝色充分显理。封l 选自魏肇蓉 落接种于5 m l 含有氨苄青霉素的l b 培养基，千3 7 ，1 5 0 r m i n 培 养 雯凌。 ( 2 ) 取3 m l 菌液，于4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 分钟收集菌体沉淀。 ( 3 ) 小心弈上清，强s 程7 5 0 番鬟悬沉淀，予4 ，1 2 0 0 0 9 离心1 分钟 收集沉淀。 ( 4 ) 小心夯上清，加入溶液i1 0 0 肛i 。重悬沉淀，爨温放篱5 分钟。 ( 5 ) 加入毅配制骢溶渡i l 2 0 0 p l ，滋和势充分地上下魏转滋会均匀，使莹 体充分裂解，直至形成透亮的溶液，冰上放簧5 分钟。 ( 6 ) 燕入禳溶鞭冷戆溶液l l l1 5 0 箨l ，渥帮并充分戆上下翻转混合均匀， 1 0 浙江大学硕士学位论文 直至形成紧实的凝集块，冰上放置5 分钟。 ( 7 ) 予| ，1 2 0 e o g 离心5 分镑，将上瀵渡小，醚魄转移至贯一予潦的微 量离心管中，加入等体积酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，振荡混合。 ( 笱予4 ，1 2 0 g 离，2 分释，将主瀵液小心缝转移至舅一干净静徽 量离心管中，加入0 6 倍体积的异围醇，颠倒混匀，一2 0 静置2 0 努锋。 ( 9 ) 于4 ，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟收集沉淀。 ( 1 0 ) 弃上清，用7 0 乙醇2 0 0 山洗涤沉淀，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟收蒙沉淀， 尽可能地除去乙醇，置于超冷工作台上塞然风于。 ( 1 1 ) 用不含d n a 酶的胰m q a 酶( 2 0 “g ，m 1 ) 的t e 缓冲液溶解d n a 沉 淀，3 7 渥寅3 分镑。- 2 0 保存待孀。 6 羹组克隆的鉴定 ( 1 ) p c r 法鉴定：取2 “l 转化子d n a 为模板，按优化的反应体系进行 p c r 扩增。 ( 2 ) 双酶切鉴定：用d 霹i 和船，i 对提取出的转化子d 时a 进行双酶 甥，势竣载体测a 俸袭对照。 反应体系；转化子d n a5 u l l o 反应缓冲液( h )2 h l 互沦。置il n l 勋，i1 u l 无落水l l 畦 反应总体积2 0 h l ，3 7 温育l 小时，加入2 “1 1 0 l o a d i n gb u 腩r 终 止反应。酶甥爱应产物在o 8 戆骧鏊耱凝黢毫泳串检溅，势棱蕹 1 0 0 b pd n al a d d e r 选择出带有外源d n a 片段的重组予。 ( 3 ) 萃酶切鍪定：分疑焉蠢糌强，嚣g ? i ，o 白i 和s 函鲥i 对已鉴定的重 组子进行进一步区分，选择宥代表性的克隆进行测序。 7 p c r 产物的序列分析 ( 1 ) d 】q a 痔裂测定工终娄话上海游耍生携技寒考羧公霉承毽。 濒泼丈学磷士掌链娩文 娃)遮爨b l a s 善程彦褥溯穿缝裂与g e 蠛融k 秘嚣m b l 拔羧数疆摩中豹 公开窿列避嚣e 较，捺瓣该系统警氮襞能镶蘩麴耱瓣缝戏。 舀逡惩s l h s 键l 黼软捧魄较嬲# 抛。粼属下l 令不鞠薮秘溯i 酬嫠 谶冀段懿溺源性。 f 添蔫p h y l 撑较僚链瓣甜? 蒯基蹰静系统发霄关系遂孬磷究，建：茳 了十个蘸种鹣系统发商逡佬树。 三、耐黼p 诺法对奎翔磷纯撼审氮氯张缨蕊熬幸 数 ) 穗辩 1 滔性澎溅零撵；势测取壹镇海炼镪公霸3 稳糖删袋厂生物硝她浊曝气塘。 2 。m 羚 一聪基e s 冀法掰臻抟试裁： ( 1 ) 鬣氧技缨蘧诗数壤莽饕；烈 撵强s 镰2 9 ，鹣毯p 礅l g ，蛾s 瓯7 玛o 器5 9 ，辩拣1 2 9 tf e s 钺? 麓2 0 筑2 鬈，e 茈锡s g 。豫国c 岛磐，将英 稳残势溶解予拳中，豢嚣热天e a c 锡，调肇p 珏至7 。2 ，寇签黧 l 。 萄蕊e s s 试麓： 、 g r i e $ s a 液；将0 ，s g 瓣鳃蒺攀磺酸洛予l s 翻1 l 靛l o 稀醋酸溶液孛 鞠戚。 好妊e s s 转液；将 g 淞茶较溶予1 5 0 艏懿l 蛰稀醮羧溶滚中，搏饿a 2 0 嬲涎楚拳书靼戏。 ( = 蠢法 l 、鲥p _ n 黼誊s s 法随嘲 ( 1 )耀芡慧垒毽熬承对i 辍l 海淀拳撵避稽1 8 嵇撵壤耩释，猿次缮翼l o 、 l 扩、l 扩、l 驴饕一缍遮续臻释凄熬徉菇，其骧粼盛傻羲藩一个稀 释凄虢襻鑫羧静麓嚣磷往缨蘩受长。穰豢我稻静经羧，般遥敬 扩、1 0 堪、l 、l 扩、i 扩甄个褥释度。 ( 2 ) 采雳蕊次簦整法，将上露各稀释度榉蘸矜鄹鼗l 斌凌耱瑟j 含9 m l 甄挈e 化细菌计数培养簇蔚试管中，2 8 麟培券1 4 天。 醴) 甄每一秘铎培养繁孛取惑培棼液3 瀵，翅列岛毽魄琶授瓣翅糖中， 浙江大学硕士学位论文 再向各凹槽中滴加g r i e s s a 液和g r i e s sb 液各2 滴。若变红色，则 说明有亚硝酸盐生成，视为阳性；若不变色，则为阴性。 ( 4 )根据出现的阳性管数得到m p n 数量指标，查m p n 表( 表3 ) ，推 算每毫升污泥水样中氨氧化细菌的数量。 2 m p n p c r 法m 1 ，2 4 ，3 2 】 ( 1 )对来自不同曝气塘的活性污泥水样进行细菌总d n a 的快速抽提。 ( 2 )对总d n a 溶液进行l o 倍梯度稀释，选用1 0 、1 0 一、l o 一、1 0 、 1 0 4 等各个不同稀释度样品作模板。 ( 3 )采用四次重复法进行p c r 反应，根据扩增产物的电泳结果计数各 样品的阳性反应数，确定数量指标。 ( 4 )根据反应结果查m p n 表，推算每毫升水样中硝化细菌的数量。 3 m p n 数量指标的确定方法 ( 1 )数量指标由三位数字组成，分别表示三个连续的稀释度反应呈阳性 的样品数。 ( 2 )数量指标的第一位数字为四个平行反应都为阳性的最高稀释度，例 如： 稀释梯度 1 0 。11 0 2 1 0 。31 0 41 0 。5 阳性数量 4 4320 数量指标4 3 2 ( 3 )如果在四个平行反应都为阳性的最高稀释度之后仍有三个数字，则 将最后一个数字加到前一个数字上，例如： 稀释梯度1 0 。11 0 。21 0 。1 0 41 0 。5 阳性数量43210 数量指标4 3 3 ( 4 )如果出现下列情况，则所取数量指标应使反应呈阳性的稀释度位于 中间，例如： 稀释梯度 l o 。1l o 之 1 0 。31 0 。4 1 0 5 阳性数量 0 10 0o 数量指标0 1 0 浙江大学硕士学位论文 ( 5 ) ( 6 ) 根据确定的数量指标从m p n 表中查出相应的细菌近似值。 细菌近似值乘以数量指标第一位数字的稀释倍数，再乘以样品的稀 释倍数即为每毫升水样中的硝化细菌近似值，按此值报告测定结 果。例如：数量指标为4 3 2 ，查表得细菌近似值为2 0 o ，数量指标 第一位数字4 对应的稀释度为1 0 ，则硝化细菌数量( 个m 1 ) = 2 0 o 1 0 2 = 2 o 1 0 3 表3m p n 表 0 0 00 o1 1 31 32 3 12 04 0 2 5 o 0 0 l0 2 1 2 00 82 4 02 o4 0 37o 0 0 20 51 2 l1 12 4 13 04 1 0 35 0 0 30 71 2 21 33 0 0 1 14 1 15 5 0 l o0 21 2 31 63 0 l1 64 1 2 8 o 0 1 10 51 3 01 13 0 2 2 o4 1 3l l0 0 1 20 71 3 11 43 0 3 2 54 1 41 4 o 0 1 3o 9 1 3 21 63 1 01 64 2 0 6 o 0 2 00 51 4 01 43 1 1 2 04 2 19 5 0 2 10 71 4 l1 73 1 2 3 04 2 21 3 o 0 2 2o 92 0 0 o 63 1 33 54 2 31 7o 0 3 00 72 0 lo 93 2 0 2 04 2 42 0 o 0 3 10 92 0 2 1 23 2 l3 04 3 01 1 5 0 4 00 92 0 31 63 2 2 3 54 3 l1 6 5 0 4 11 22 1 01 6 3 3 03 o4 3 22 0 0 1 0 00 32 1 11 3 3 3 l3 54 3 33 0 o 1 0 l0 52 1 21 63 3 2 4 04 3 4 3 5 o 1 0 20 82 1 3 2 o3 3 35 o4 4 0 2 5 o 1 0 31 o2 2 0 1 33 4 03 54 4 l 4 0 0 1 1 00 52 2 11 63 4 1 4 54 4 27 0 o 1 1 10 82 2 22 0 4 0 02 54 4 3 1 4 0 0 1 1 21 02 3 0 1 74 0 13 54 4 4 1 6 0 0 4 浙江大学硕士学位论文 四、水杨酸一次氯酸盐法测定氨氧化细菌的硝化速率 ( 一) 材料 1 n h 4 + n 标准溶液：将在5 5 6 0 烘至恒重得( n h 4 ) 2 s 0 4 准确称取o 4 7 1 7 9 溶于水后定容至1 l ，此n h 4 + 一n 液为l o o m l 储备标准溶液。此液再用 水稀释1 0 倍即为n h 4 + 一n1 0 “g m l 操作标准溶液。 2 5 水杨酸溶液：称取1 2 5 9 水杨酸和1 2 5 9 柠檬酸钠溶于适量水中，再 加2 m 0 1 m 1 n a o h 溶液4 5 “，加热至完全溶解( 不可过热) ，冷却后加水 定容至2 5 0 m l 。 3 1 亚硝基铁氰化钠溶液：称取0 2 9 亚硝基铁氰化钠 n a 2 【f e ( c n ) 5 n o 】2 h 2 0 溶于2 0 m 1 水中，盛于棕色瓶中，存于冰箱( 或 即用即配) 。 4 4 次氯酸钠溶液：取含有效氯为5 2 的次氯酸钠溶液7 7 m l ，溶于水后 定容至l l 。 5 7 2 2 光栅分光光度计( 上海第三分析仪器厂) 。 ( 二) 方法 1 绘制n h 4 + n 标准曲线【6 1 分别吸取1 0 p g m l 的n h 4 + - n 标准溶液l 、2 、3 、4 、5 、6 、7 m l 于5 0 m 1 容量瓶中，依次加入3 m lo 2 m o l l n a 0 h 溶液，5 m l5 水杨酸溶液，o 5 m l 1 亚硝基铁氰化钠溶液，加水约至4 5 m l ，再加0 4 m l4 次氯酸钠溶液， 用水定容，摇匀，静置。1 小时后，在6 9 8 m 处，以试剂空白作参比， 在分光光度计上测定吸光度，绘制标准曲线。 2 氨氧化细菌硝化速率测定2 l ( 1 ) 取污泥水样6 0 0 m l ，室温曝气2 0 分钟后，向其中添加硫酸铵固体o 3 9 ， 搅拌混匀，调节p h 至8 o ，记为o 时刻。立刻取水样1 5 m l ，加入浓 硫酸1 0 0 “l ，使水样p h 值小于2 ，达到终止硝化反应的目的。将水样 过滤后放于4 冰箱保存。然后对水样继续进行磁力搅拌和曝气处 理，分别在1 0 分钟、2 0 分钟、3 0 分钟、4 5 分钟、l 小时、1 5 小时、 浙江大学硕士学位论文 2 小时和3 小时分别取水样过滤，4 冰箱保存。 ( 2 ) 吸取各时刻水样3 m l 于5 0 m l 容量瓶中，依次加入3 m l0 2 m 0 1 ln a 0 h 溶液，5 m 15 水杨酸溶液，o 5 m 1 1 亚硝基铁氰化钠溶液，加水约至 4 5 m l ，再加0 4 m 14 次氯酸钠溶液，用水定容，摇匀，静置。1 小时 后，在6 9 8 m 处，以试剂空白作参比，在分光光度计上测定吸光度， 参照标准曲线，求得各时刻氨氮含量的变化。 ( 3 ) 在o 时刻和3 小时各取水样2 5 m l ，混匀，离心，小心去上清。再加 蒸馏水，混匀，离心，重复操作3 次，将剩余污泥烘干至恒重，计算 污泥浓度。 ( 4 ) 用公式n h 4 + 一n ( i ) = n h 4 + - n 。0 ) + k d n x t 处理数据( 其中n h 4 + 一n 为t 时刻水样中的n h 4 + - n 浓度，n h 4 + 一n 。o ) 为0 时刻水样中的n h 4 + 一n 浓度，k 为硝化强度，x c 为时间) ，结合污泥浓度，求得样品的硝化 速率。 浙扛大学硕士学位论文 结果 、氯单加氧酶基因 拉燃鲥基嚣奠菠戆系绞进毯分辑 根据口卅叫基因的核苷黢差异性建立了氨氧化细菌f 脚s o m d 辩属下1 0 个菌种的系统发育避化树( 图1 5 ) 图l s删叫基因系统发育进化树 浙江大擎磷士擎婉论文 三、m p n ，p c r 法对生物硝化池中氨氧化细菌属细菌的计数 ( ) m p n 。g r i e s s 法检测结果 斧j 用m p n g r i e s s 法辩镶海炼纯公司鍪物硝化池曝气塘承样中的氨氧化 缨萤进行计数检测，结果如袭6 所承。用灭菌生理盐水对l m l 活性污淀水样 迸行1 0 倍梯度稀释，采用四次重复法将稀释样品接种到计数培养基中，培养 1 4 d 薅检测氨氧化缨萤阳性管鼗。 表6m p n g r i e s s 法检测结果 样品稀释度l o 1l o 2l 矿l o 。41 0 5l 扩l o 一7 阳性管数44444lo 从表6 可以看出，该榉凝的数蹩指标必4 4 l ，查m p n 褒褥l 旷稀释发 l m l 水样中氨氧化细蔼个数为4 0 o ，则每毫升水样中氦氧化细菌个数为：4 0 ，o xl 酽雀。q e 0 5 ( 令) 。 ( = ) m p n - p c r 法检测结聚 利用m p n p c r 法对镇海炼化公司生物硝化池姆气塘水样中的氮氧化细 藩避行诗数捡溅，结果虹鹜1 6 蕊示。把从l m l 活往海淀承样中擒提褥翳翳缨 菌总d n a 溶于1 0 0 扯lt e 缓冲液中，取5 “1d n a 样黼进行1 0 倍梯媵稀释之 蓐，采薅程次重复法，曩铡稚基医片段髂特异性葶；耱对穰稃模板箨 m p n 。p c r 扩增，扩增时的蠛板用量均为2 “l 。 扶蘑1 6 中可疆看出，l 萨、i 扩和l 酽稀释度麓4 个平行样晶都能扩增 出祭糖，其余稀释发均无扩增条带出现。根撼m p n 数量攒标确定方法，该 d n a 样品p c r 扩增辅果的数最指标为4 4 0 。焱m p n 袭得l o d 稀释度2 “id n a 模攫所对应盼氨氧锯细蘸个数惫2 5 ，鲻每毫舞农样中氮氧倪维蓬豹个数鸯： 2 5 1 0 。1 0 0 2 = 1 2 5 1 0 6 ( 个) 。根据文献搬道，由于m p n m g r i e s s 法本身存 在一定懿臻麓，箕诗数结栗往往要低予实琢氆。毙较两秘方法兹检测结栗， 发现m p n - p e r 法高于m p n * g d e s s 法说明前者的计数效翠离，准确性强。 辩扛大学硕士学位论文 翻1 6肼p c 获法检测绩果( 镇海练化水祥) 1 、1 8 ：1 0 0 b p d n a l a d d e r 2 5 ：lo _ l 稀释度；6 9 ：l 酽稀释发 1 0 一1 3 ：l o j 稀释发 1 4 一1 7 ：1 0 4 稀释度 1 9 2 2 ：1 0 。稀释魔：2 3 2 6 ：l o 。6 稀释度 2 7 3 0 ：lo - 稀释发；3 一3 4 ：1 0 4 稀释度 熙1 7 醐p n 粕l t 法检渭结粱( 杭媸菜广水样) 1 1 0 0 b p d n a l a d d e r 2 5 1 0 4 稀释度 6 9 l 矿稀释魔1 0 一1 3 ：l o 。稀释度 1 4 一1 7 ：1 矿稀释度：1 8 2 l ：l 稀释度 3 4 辩江大挚硕士掌经论文 利用m p n p c r 法对杭州某厂生物硝化池曝气塘水样中的氨氧化细菌进 行计数检测，结果如翁1 7 薪示。把飘1 蕊活性污混冰样中摘提得蓟韵细菌想 d n a 溶于s o l l t e 缓冲液中，取5 p l d n a 群品进撑l o 倍梯度稀释之后，袋 用翻次重复法，用疗m 鲥基因片段的特异健引物对稀释模极作m p n ，p c r 扩 增，扩趱对瓣模援掰量均为2 m 。 从图1 7 中可以稽出，1 0 - 2 、1 0 d 和1 0 4 稀释度的4 个平行样品都能扩增 邕祭带，冀余稀释度均无扩增条带爨埂。蔽据m p n 数量豢辍确定方法，该 d n a 样品p e r 扩增结果的数鼠指标为4 4 0 。套m p n 液得1 0 4 稀释度2 “l d n a 模蔽所对应盼氨氧诧缅蘸个数为2 5 ，则每毫井水榉中氨氧纯细菌静个数为t 2 5 l0 3 5 0 ，2 = 6 2 5 1 0 5 ( 个) 。 四、水杨酸一次氯酸盐法测定氨氧化细菌的硝化速率 分别暖鞭一定爨的l o h m l 韵n h 4 + - n 标准溶液，按实验方法在分光光 度诗上依次测定吸建度，绘锩标准魏线( 鹫1 8 ) 。搽难垂线毯癌方程淹：y 一 0 0 1 2 4 x 一0 0 0 2 7 ，r 2