高中生物 52多聚酶链式反应扩增DNA片段配套课件 新人教版选修1.ppt

课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 课程标准尝试pcr技术的基本操作和应用 课标解读1 理解pcr技术的基本原理 2 知道pcr技术的基本操作过程 3 讨论pcr技术的应用 1 生物体内dna分子复制的条件 1 四种是合成子链的原料 2 提供了dna复制的模板 3 打开了dna双链 4 催化合成dna子链 5 使dna聚合酶能够从开始连接脱氧核苷酸 pcr技术的原理及反应过程 脱氧核苷酸 dna母链 解旋酶 dna聚合酶 引物 引物的3 端 2 pcr扩增的原理及条件 1 概念pcr即 是一种迅速的技术 它能以极少量的为模板 在短时间内复制出上百万份的 2 原理 dna的热变性 在的温度范围内 dna双螺旋结构解体 双链分开 这个过程称为 当温度缓慢后 两条彼此分离的dna链又会重新 子链的合成 a 需要 b 合成方向总是从子链的端向端延伸 多聚酶链式反应 体外 扩增dna片段 dna dna拷贝 80 100 变性 降低 结合成双链 引物 5 3 3 条件 模板 分别与模板dna两条模板链相结合的两种 a t g c四种 耐热dna聚合酶 一般用 需要一定的和能严格控制的温控设备 dna 引物 脱氧核苷酸 耐高温的taqdna聚合酶 缓冲溶液 温度 3 pcr反应过程pcr一般要经历次循环 每次循环可以分为 和三步 1 当温度上升到以上时 双链dna解聚为单链 2 温度下降到左右 通过与两条单链dna结合 3 温度上升到左右 溶液中的四种脱氧核苷酸在的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 三十多 变性 复性 延伸 变性 90 复性 50 两种引物 碱基互补配对 延伸 72 dna聚合酶 思维激活1 dna复制缘何必须有引物 提示dna聚合酶不能从头合成dna 而只能以3 延伸dna链 故dna合成时 必须加入引物 其3 游离 以作为延长dna子链的 引子 1 细胞内dna复制和细胞外pcr扩增的比较 见下表 2 pcr过程 1 变性当温度上升到90 以上时 双链dna解聚为单链 2 复性温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 3 延伸温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 特别提醒 1 72 左右时 taqdna聚合酶有最大活性 可使dna新链由5 端向3 端延伸 2 dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dna序列 使该段固定长度的序列呈 指数式 扩增 巩固1 标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 94 55 72 b 72 55 94 c 55 94 72 d 80 55 72 解析当温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 称为延伸 答案a 1 实验用具 1 pcr仪 该仪器能自动调控 实现dna的扩增 如果没有pcr仪 可用3个代替 操作时按程序在3个中pcr反应的微量离心管 2 微量离心管 总容积为 实际上是进行的场所 3 微量移液器 用于 pcr技术的实验操作及评价 温度 恒温水浴锅 水浴锅 来回转移 0 5ml 多聚酶链式反应 转移pcr配方中的液体 2 操作步骤准备 混合 反应 3 操作提示 1 为避免等因素的污染 实验中使用的一些用具在使用前必须进行 2 所用的和应分装成小份 并在储存 3 在中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须 加入组分 设置pcr的循环程序 外源dna 高压灭菌 缓冲液 酶 20 微量离心管 更换 思维激活2 pcr操作中模板dna是否需解旋 需要旋转酶吗 提示pcr操作中 模板dna仍需解旋 但该解旋过程不是dna解旋酶催化的结果 而是利用dna热变性的原理 在80 100 温度范围内 dna双螺旋结构将解体 双链分开 以此达到解旋的目的 1 pcr仪 pcr自动化程度较高 参照下表设计程序即可 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的是使反应液集中在离心管底部 3 实验中dna含量的测定dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna的含量有关 可以利用dna这一特点进行dna含量的测定 具体方法如下 稀释 2 lpcr反应液 加入98 l蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 测定 取dna稀释液100 l至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 dna含量 g 50 260nm的读数 稀释倍数特别提醒若没有pcr仪 可进行水浴扩增dna设置3个恒温水浴锅 温度分别为94 55 和72 在3个水浴锅中依据pcr仪的处理时间来回转移pcr反应的微量离心管即可 巩固2 聚合酶链式反应 pcr技术 是体外酶促合成特异dna片段的一种方法 由高温变性 低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期 循环进行 使目的dna得以迅速扩增 其简要过程如图所示 下列关于pcr技术叙述不正确的是 a pcr技术是在实验室中以少量dna制备大量dna的技术b 反应中新合成的dna又可以作为下一轮反应的模板c pcr技术中以核糖核苷酸为原料 以指数方式扩增d 应用pcr技术与探针杂交技术可以检测基因突变 解析pcr技术是人工合成dna的方法 原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸 答案c 例1 2011江苏 请回答有关问题 1 利用pcr技术扩增目的基因 其原理与细胞内dna复制类似 如下图所示 图中引物为单链dna片段 它是子链合成延伸的基础 pcr技术的原理 从理论上推测 第四轮循环产物中含有引物a的dna片段所占的比例为 在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的dna片段 2 设计引物是pcr技术关键步骤之一 某同学设计的两组引物 只标注了部分碱基序列 都不合理 如下图 请分别说明理由 第1组 第2组 3 pcr反应体系中含有热稳定dna聚合酶 下面的表达式不能正确反映dna聚合酶的功能 这是因为 思维导图 归纳提升 pcr技术特点 1 pcr不需要解旋酶 而生物体内dna复制时需要解旋酶 2 pcr需要耐热的dna聚合酶 而生物体内dna聚合酶在高温时会变性 3 pcr一般需经三十多次循环 而生物体内dna复制需要生物体自身的控制 例2 使用pcr仪具体实验操作顺序应为 设计好pcr仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行pcr反应 离心使反应液集中在离心管底部a b c d 思维导图 pcr技术实验操作及注意事项 深度剖析pcr反应的操作步骤一般分为准备 包括配制配方及将各配方放于实验台上 移液 混合 离心 反应 因pcr仪是一种自动控制温度的仪器 设计好循环程序就可以进行反应了 答案c 单击此处进入随堂达标检测 教材p631 提示绘图可参考教科书中图5 9 pcr反应中的dna片段一般以2n的方式积累 其中n为反应循环次数 一个dna片段在