丹宁_聚乙二醇法提取纤维素酶的研究.docx

丹宁2聚乙二醇法提取纤维素酶的研究吴慧清黄小茉李剑英吴清平(广东省微生物研究所 , 广州 , 510070)摘 要 木霉经固态发酵制成纤维素酶湿曲 ,按曲水体积比 15 加入 40 去离子水 ,保温 60min 后 ,过滤获得粗纤维素酶液 。在酶活为 f pase 2216 u/ ml 的稀酶液中 ,加入丹宁至 510 g/ l 时 ,粗酶液中纤维素酶接近完全沉淀下来 ,将沉淀分散于 p h416 的 011 mol/ l 柠檬酸缓冲液中 ,加入分子质量为 6 000 u 的聚乙二醇 ( p e g) 至丹宁含量的 116410 倍 ,酶活回收率达到210 %245 % ,可将纤维素酶浓缩 7 8 倍 。p e g 对纤维素酶有激活作用 ,采用丹宁作为纤 维素酶的沉淀剂 , p e g 可将纤维素酶从酶2丹宁复合物中解析出来 。丹宁 、p e g 的用量与酶液中的蛋白质含量有关 , p e g 超过解析酶用量的一定范围 ,因激合纤维素酶使酶活回收率超过 100 % ,过多 p e g 会使系统发生相改变 ,从而使酶失活 ,使得酶活回收率急剧降低 。关键词 纤维素酶 丹宁聚乙二醇 提取法丹宁是一种多酚类物质1丹宁酸 (简称丹宁) :分析纯 ,中国遵义市第二化工厂 ,贵州 ; 聚乙二醇 ( p e g) : 分子质 量 8 000 u 、6 000 u ,进口分装 ; 羧甲基纤维素钠 ( cmc) : 上 海 长 虹 塑 料 厂 产 品 , 粘 度 ( p h611) 013 016 pa s ; 滤纸 : 新 华 1 号 定 性 滤 纸 ;纤维素酶曲 :木霉菌种 ,经固态发酵制成 。1 . 2纤维素酶活力的测定纤维素酶活力单位定义为 : 60 min 水解 生成 1 mg 葡萄糖的酶量为 1 个活力单位 。1 . 2 . 1羧 甲 基 纤 维 素 酶 ( cmcase) 活 力 测定12 ,13取待 测 稀 释 酶 液 015 ml , 加 入 5 g/ l cmc 溶液 115 ml , 50 酶解 30 min ,加入 3,能与蛋白质结合生成不溶于水的复合物 。在找到一种将酶或蛋白质从这种复合物中解析出来的方法 以前 ,丹宁对酶来说是一种失活剂 。因此丹宁沉淀法作为酶的提取方法 ,一直未能获得大规模的工业应用 。后来 ,人们找到了几种 将酶从 丹 宁 与 酶 的 复 合 物 中 解 析 出 来 的 物 质 ,这些物质主要为聚乙二醇 ( p e g) 、聚乙烯氮戊酮 ( pv p) 、聚氧化乙烯或山梨糖醇的甘油油酸酯 ( po esmo) 或硬脂酸 ( po esm s) 2 ,这为丹宁沉淀法的工业应用开辟道 路 。用丹宁沉淀法制备的酶制剂不含盐 ,纯 度高 ,不但符合食用的要求 ,而且可以作为口服药用酶制剂3 ,亦可用于纺织加工和发酵13ml dn s 试剂,沸水浴 10 min ,在波长 530nm 比色测定还原糖的含量 。1 . 2 . 2滤纸糖酶 ( f pase) 活力测定4 , 51 ml 稀释的待测酶液 ,加入 0105 mol/ lp h416 的柠檬酸缓冲液 1 ml 和 1 条 1 cm 6 cm 新华 1 号滤纸 , 50 酶 解 60 min , 加 入 3ml dn s 试剂 ,沸水浴 10 min ,在波长 530 nm比色测定还原糖的含量 ,扣除空白后计算酶 活力 。113制备浓缩液态纤维素酶制剂的工艺过工业等4 9。迄今为止 ,丹宁沉淀法已用于2淀粉酶 、酸性蛋白酶 、糖化酶 、脂肪酶 、果胶酶等水解酶的提取 ,但酶活损失大3 ,10 。本 研究在利用丹宁沉淀纤维素酶后 ,采用聚乙二醇解析和激活纤维素酶 ,可以有效地提取 粗酶液中的纤维素酶 。1材料和方法1 . 1材料第一作者 :硕士 ,工程师 。收稿时间 :2000 - 11 - 20 ,改回时间 :2001 - 04 - 0642vol127 no18食品与发酵工业food and fermentatio n indust ries程2 . 2丹宁酸对纤维素酶的沉淀作用取 6 份 100 ml 经浸提 、离心后 f pase 为2216 u/ ml 的稀酶液 ,按稀酶液量加入 110 ,210 ,310 ,410 及 510 g/ l 的丹宁酸 ,搅拌后 ,在室温下放置 3 h ,离心 ,收集上清液和沉淀 物 ,测量上清液中的酶活力 。结果表明 ,当丹宁加量达到 510 g/ l 时 , 粗酶液中纤维素酶几乎可以完全沉淀下来 (表 2) 。表 2 丹宁加量对纤维素酶沉淀的影响将固态的纤维素酶浸提液经压榨或离心制得粗酶液 ,加丹宁酸将酶沉淀下来 ,离心 , 弃去上清液 ,将沉淀用介质将其分散 ,加入适 量的解析剂 ,搅拌均匀 ,作用一定时间后 ,离心 ,收集上清液 ,加防腐剂 、稳定剂 ,制得浓缩 液体酶制剂 。2实验结果2 . 1 纤维素酶浸提工艺参数测定称取 120 g 含水量在 500 700 g/ kg 纤 曲 3 份 ,分别按曲水体积比为 1 3 、1 5 、1 7 加入 40 无 离 子 水 , 于 40 水 浴 中 保 温 60 min ,另取同量的湿曲 ,按 1 5 的比例加入室 温下 (16 ) 的冷水 ,于室温下提取 60 min ,作为对照 。选择 1 5 的曲水比 , 40 提酶温度 做为提酶工艺参数 ( 表 1) 。若提酶材料为干 曲粉 ,则应加大水与曲的比例 1910 。表 1 不同加水比例和浸提温度对提酶效果的影响丹宁加量/ gl - 10110210310410510上清液酶活16181315613215015010- 1fpase/ uml2 . 3 解析过程中介质的选择在解析实验中选择 p h416 的 011 mol/ l 柠檬酸缓冲液 、纯水 、011 mol/ l 碳酸钠溶液 作为分散介质 。结果表明 : ( 1 ) 以 p h416 的011 mol/ l 柠檬酸缓冲溶液和纯水为分散介 质效果较好 ,说明了酶解析试验适合在中性和弱酸性介质中进行 。( 2) 聚乙二醇的分子 质量为 6 0008 000 u ,对酶解析试验中的酶 得率影响不大 (表 3) 。曲水体积比13151715浸提温度/ 压榨后酶体积/ mlfpase/ uml - 1 总 fpase/ u 过程损失 fpase/ u fpase 损失/ 10 - 240390201447 97116- 81215- 91340650131999 09315+ 30914+ 31540880101999 67112+ 88711+ 101091665011147 41010- 13714- 1516214聚乙二醇对纤维素酶沉淀的解析作用取 6 份 550 ml f pase 为 2216 u/ ml 的稀酶液 ,加入 510 g/ l 丹宁 ,搅拌 ,离心后 ,将获得的沉淀物用分散介质分散 ,按稀酶液量注 : 120 g 湿曲总 fpase 为 878411u 。加 入 1 8 g / l 分 子 质 量 为 6 000 u 的 p e g ,分散介质对酶解析的影响表 3丹宁加量/ gl - 1p e g 分子质量/ up e g 加量/ gl - 1分散介质( 酸 、碱浓度 011 mol/ l )酶液总体积/ ml浓缩酶液酶活力fpase/ uml - 144448 0006 0006 0008 0004454柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 柠檬酸缓冲液 水101102100102156155190188 4 6 000 4 碳酸钠溶液101 1 搅拌 ,于冰箱中放置过夜 ,离心 ,收集上清酶液 ,测定其 f p 酶活力 。试验表明随着 p e g 用量的增加 ,浓缩酶液中酶活增加 ,并且具有 一种较强的激活趋势 (表 4 ,图 1) 。215 增加 peg 用量对纤维素酶解析效果的 影响取 10 份 40 ml f pase 为 3810 u/ ml 液体纤维素酶 , 加质量百分含量为 0 . 5 %的丹宁于 4 冰箱过夜沉淀 ,于 10 000 r/ min , 4 冷冻离心 10 min ,收集沉淀 ,加 4 ml 纯水分 散 ,加 不 同 量 p e g6000 于 4 冰 箱 解 析 过夜 ,第 2 天采用转速 10 000 r/ min , 4 冷冻 离心 10 min ,收集浓缩液并补充纯水至体积 均为 715 ml ,测量 f pase 酶活 。吴慧清等 :丹宁2聚乙二醇法提取纤维素酶的研究43第 27 卷 第 8 期表 4解析剂聚乙二醇用量对纤维素酶解析效果p e g 加量/ gl - 10134568酶液体积/ ml酶活力/ uml - 1总 fpase/ ufpase 损失率/ 10 - 2 酶活得率/ 10 - 2 浓缩倍数/ 倍550221612 43074101117 481- 39186011714741561011 544- 71139219714742031015 022+ 201812018714742191816 265+ 301813018714742581719 143+ 541015410714743911328 956+ 1321923219714出某一数值 ( 本试验中为 1 4) 时 , 纤维素酶的回收率急剧降低 (表 5 ,图 2) 。图 1 p e g 对丹宁酶复合物的解析效果试验表明 , 当 p e g 和丹宁的比值在一 定范围内增加时 ,纤维素酶的回收率增大 ,超图 2 增加 p e g 对 p e g2丹宁的解析效果表 5 增加 peg对纤维素酶的解析效果1116p e gtannin111314151617fpase/ uml - 1总 fpase/ u酶活得率/ %1781 33587131881 41092183142 355154194263 159210121721 29084191431 0721570151128405513216peg 对纤维素酶的激活作用取 6 份 10 ml fpase 为 3810 u/ ml 的液体 纤维素酶 ,分别加入 0 ,0125 ,015 ,110 和 310 % peg6000 (w/ v) 测定其酶活 (结果见表 6) 。表 6 peg对纤维素酶的激活作用217丹宁用量和 peg 用量的相关性取 800 ml f pase 为 2216 u/ ml 的 稀 释酶液 4 份 ,分别加 4 ,5 ,6 ,8 g/ l 的丹宁 ( 按稀释酶液体积比加) ,搅拌并离心后 ,获得的沉 淀 物 在 分 散 介 质 中 再 加 与 丹 宁 等 量 的p e g6000 解析 ,另外 ,取 3 份 550 ml 上述稀 酶液 ,加丹宁至 5 g/ l 搅拌离心后 ,获得的沉 淀物 在 分 散 介 质 中 再 分 别 加 4 、5 、8 g/ l 的 p e g6000 解析 ,离心后 ,收集上清酶液 ,并测 定其 f pase 活力 。表 5 结果表明 ,同样的稀酶液 ,用相同的 丹宁沉淀 ,不同量的 p e g 解析 ,随着 p e g 的 用量 增 加 , 得 率 也 增 大 。另 外 , 丹 宁 增 加 , p e g 不变时 ,酶的得率减少 ,因此 p e g 用量 和丹宁用量之间存在一种相关性 。p e g/ %00125015110310fpase/ uml - 1384418501150135018数据分析 : 几次实验数据之间有一些差异 ,这是由于用于提酶的纤维素酶原液其蛋 白含量不一致 。丹宁 、p e g 和蛋白质含量之间应还存在一种相关性 ,即蛋白质含量大 ,用于解析的 p e g 需要的越多 。p e g 在一定浓 度范围内可激活纤维素酶 ,但溶液中的 p e g 含量太多时会使系统发生变化 ,使酶失活 。44food and fermentatio n indust ries vol127no18食品与发酵工业表 7 丹宁用量和 peg用量的相关性浓酶液酶活/ uml - 1丹宁加量/ gl - 1p e g 加量/ gl - 1浓酶液体积/ ml总 fpase/ u酶活得率/ 10 - 2浓缩倍数/ 倍原始酶液/ mlcmcasefpase1771124815259173031815618219184568554568459999999978787 42017 44211 116131 60011 48012 37617 53325 71024 60230 07612 23017 1449714213616698138888877800800800800550550 5 8 78 18 900 39113 30 521 246 7 550 注 :稀酶液的酶活 , fpase 2216 u/ ml ,体积 800 ml ,总 fpase 为 18 080 u 。若体积为 550 ml ,总 fpase 为 12 430 u 。参 考 文 献1 邱姆巴洛夫 t. k. 著 ,徐德祥译 . 植物鞣质化学基础 (25) . 北京 :科学出版社 ,19602 小林时夫 . 日特公昭 41 - 7833 ,19663 张树政主编 . 酶制剂工业 . 北京 : 科学出版社 ,19844 顾贷芳 ,卞殿明 . 食品科学 ,1998 ,19 ( 7) : 27305 capek p et al . int . j . biol . macro molecules ,1995 ,17 (6) ,337406 kobayashi t et al . macro molecules , 1996 , 29 (7) ,2 6982 7007 林开江 ,阮丽娟 , 王农英 . 生物技术 , 1996 , 6 (3) :45488 贺志勇 . 印染 ,1992 ,18 (3) :40429 庄梅芳 ,宗 复 . 印染 ,1993 ,19 (5) :222510 陈 声主编 ,胡学智编 . 酶制剂生产技术 .北京 :化学工业出版社 . 199411 张海 , 冯 成 刊 等 . 标 准 化 报 道 , 1995 , 16(4) :3738 ,443讨论丹宁提取法用于制备纤维素酶制剂既浓缩了酶液 ,同时 ,在提取过程中不但没有损失 酶活 ,反而能激活酶活 。聚乙二醇既是解析剂 ,同时也是酶的激活剂 。该法比盐析法简 单 ,得 率 更 高 , 且 不 含 盐 , 不 用 经 脱 盐 处 理 。 因此 ,应用此法制备纤维素酶较盐析法有效 。丹宁沉淀法中丹宁用量 ,受酶液中蛋白 质含量 、种类及 p h 等因素的影响 ,试验时应 当根据 实 际 测 绘 的 沉 淀 曲 线 来 决 定 其 添 加量 。此外 ,利用丹宁沉淀纤维素酶 ,采用聚乙 二醇做解析剂的酶浓缩法 ,也有美中不足之 处 。聚乙二醇将酶从丹宁 - 酶复合物中置换 出来时 ,生成树脂状的复合物 ,附着在容器壁 上 ,较难除去 ,虽可用洗洁精或酒精洗涤 ,但如果能找到一种解析剂避免形成这种树脂状 的物质 ,将会更好 。12mandels m et al . biotechnol . bioeng.symo . ,1976 , (6) :1713 蒋传葵等 . 工具酶活力测定 . 上海 : 上海科 学出版社 ,1982 . 8287cell ula se extract ion using tann in2peg methodwu huiqi nghuang xiao moli j ianyi ngwu qi ngpi ng( guangdo ng instit ute of microbiology , guangzhou , 510070)cellulase was ext racted f ro m t he solid state cult ure medium in w hich a st rain ofabstractt richode r m a was grow n . af ter t he cult ure medium was steeped in 40 io n2f ree water fo r 60minutes ,t he crude cellulase liquid was made by filtering t he steeper , w hen t he co ntent of tannin in t he enzyme liquid up to 5 . 0 g/ l and t he enzyme - tannin co mpo und was dispersed in p h 4 . 6 cit rate buffer , cellulase co uld be liberated by p ut