乳酸链球菌10193抑菌条件的优化研究例文毕业论文.doc

毕业论文(设计)题目名称：乳酸链球菌10193抑菌条件的优化研究目 录毕业论文（设计）任务开题报告指导教师评审意见评阅老师评语答辩会议记录中文摘要英文摘要1前言11.1乳酸链球菌和乳酸链球菌素（Nisin）的简介11.2国内外的研究现状及发展趋势21.3本课题研究的目的和意义32材料与方法42.1试验材料42.2试验主要药品及试剂42.3试验的主要仪器及设备42.4菌种的预处理52.5乳酸链球菌10193培养基优化的单因素试验52.6抑菌试验62.7正交试验83结果与分析83.1菌种活化93.2镜检结果93.3温度对菌株发酵液抑菌效果的影响93.4碳源对菌株发酵液抑菌效果的影响103.5氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响123.6金属离子对菌株发酵液抑菌效果的影响133.7正交试验结果144讨论与结论16参考文献16致谢18乳酸链球菌10193抑菌条件的优化研究 摘要 乳酸链球菌主要存在于生牛奶和奶制品中,它和其他的乳酸菌一样营养要求高,需要复合的培养基供良好生长。乳酸链球菌素为乳酸链球菌在生长过程中的代谢产物，是一类生物防腐剂。对乳酸链球菌素的特性，抑菌范围，抑菌机理，抑菌影响因素在国内外都有一定研究，但是直接利用乳酸链球菌对于食品保鲜的研究很少。本试验对冻干状态乳酸链球菌10193进行优化培养，并研究其抑菌特性。为以后进行生物食品保鲜提供试验基础。结果表明，乳酸链球菌生长迅速，但产酸速度快，后酸化程度高。采用12%脱脂乳，0.5%酵母膏，0.5%葡萄糖活化培养基可明显提高菌株活力。抑菌试验通过单因素试验，初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围，然后采用正交试验L9(33)优化后得到的乳酸链球菌抑菌的最佳发酵条件：3.0%葡萄糖，4%蛋白胨，2%酵母膏，1%牛肉膏，0.005mol/L MgSO4。本研究为应用乳酸链球菌进行工业化生产乳酸链球菌素提供了必要的参数指标。关键词 乳酸链球菌，抑菌条件，营养要求Research on Optimize Bacteriostasis Conditions of streptococcus lactis 10193Student:Zhang Jing, College of Life Science,Yangtze UniversityTeacher:Li Zhenshun, College of Life Science,Yangtze UniversityAbstract streptococcus lactis mainly consist in raw milk and dairy products, is the same as other lactic acid bacteria as high nutritional of requirements,which is of complex media for growth of high quality. Nisin is the metabolic product in the process of the lactic acid streptococcus growth ,which is a class of biological preservatives.There had certain study at home or abroad on the properties of Nisin, the scope of and antibacterial mechanism of inhibitory and the the factors of antimicrobial effects, but it was rarely that the direct used of nisin on the study of food preservation. In this paper, freeze-dried state of streptococcus lactis 10193 and their antibacterial properties were studied, which provision ground for future biological test that based on the food preservation. The results showed that it is rapid growth that of streptococcus lactic acid, but acidic fast, a high degree of post-acidification.First,by single factor experiments,optimal carbon source、nitrogen source and metalion in culture medium used and their concentration or ratio of the scope for Nisin-producing were detemined.Namely,carbon source was glucose; nitrogen source was mixed nitrogen source;metalion was Mg2+,and potimal concentration of each component was ascertained.Finally,by orthogonal experiments,the optimum culture medium and pitimal fermentation conditions of producing Nisin wre obtained as follow: 3.0% glucose, 4% peptone, 2% yeast extract, 1% beef extrac, 0.005mol / L MgSO4. In this study, the application of nisin was provide necessary parameters to the industrialized production of nisin .Key words streptococcus lactis, bacteriostasis conditions，nutrition requirement乳酸链球菌10193抑菌条件的优化研究1前言1.1乳酸链球菌和乳酸链球菌素（Nisin）的简介乳酸链球菌素（Nisin），又称乳球菌肽或乳链菌肽，分子式为C143H228N42O37S7，分子量为3510Da。Nisin 在自然状态下主要有两种形式，分别为NisinA和NisinZ1，是由某些乳酸链球菌（Streptococcus lactis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）在代谢过程中合成、分泌的具有很强杀菌作用的多酚化合物，是一种世界公认的安全的天然的食品防腐剂。早在1928年，Rogers和W hittier就发现乳酸链球菌10193的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年Mattick和Hirsch发现血清学N群中的一些乳酸链球菌10193能产生蛋白类抑菌物质，命名为N-inhibitory Substance,即N群抑菌物质，简称Nisin(尼辛) 2 。Nisin 能够抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长与繁殖， 如葡萄球菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌, 特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。在一定条件下，如冷冻、加热、降低pH 值、EDTA处理等，Nisin 亦可抑制一些革兰阴性菌的生长， 如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等。是世界上公认的安全防腐剂，并极易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶降解 3 。乳酸链球菌10193（Lactococcus Suhleifer等，1984）归属于硬壁菌门（Firmicutes）杆菌纲（Bacilli）乳杆菌目（Lactobacillales）链球菌（Streptococcaceae）。细胞呈球形或卵圆形，（0.5-1.2）um（0.5-1.5）um，在液体培养基中成对和短链。不生芽孢，革兰氏阳性。不运动，吴无荚膜。兼性厌氧。化能异养菌，发酵代谢，以一些碳水化合物发酵产酸，以L-（+）-乳酸为主，不产气。营养要求复杂，接触酶阴性，氧化酶阴性。最适温度30，能在10生长，在45、0.5%NaCL条件下不生长。通常为Lancefield血清群N。发现于乳制品和植物产品。模式种:乳酸乳球菌（Lactococus lactis）。该属未包括在伯节氏系统细菌学手册中。Schleifer等（Int J SystBacteriol，1986，36：354-356；有效发表；Syst Appl Microbiol，1995，6：183-195）将乳酸链球菌包括乳酸乳球菌、棉籽糖乳球菌和一些乳杆菌霍氏乳杆菌（L.hordniae）和木糖乳杆菌（L.xylosus）与一些新描述的种归在一起，新成立了乳球菌属4。 乳酸乳球菌酸亚种主要存在于生牛奶和奶制品中，它和其他的乳酸菌一样营养要求高，需要复合的培养基供良好生长 。在合成培养基 中乳球菌的所有菌株都需要氨基酸类 ，如亮氨酸、异亮氨酸、撷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸和脯氨酸以及维生素类如烟酸、泛酸和生物素。 1.2国内外的研究现状及发展趋势乳酸链球菌素是乳酸乳球菌产生的一种细菌素，能抑制大部分G十菌及其芽孢的生长和繁殖，其本身易被人体消化道中的一些蛋白酶所降解，并且对食品的色、香、味等无不良影响，为防止金黄色葡萄球菌对食品的污染，延长食品的货架期，人们希望的是使用天然食品防腐剂来取代化学防腐剂抑制金黄色葡萄球菌。因此，它作为一种天然的新型食品防腐剂，已被世界50多个国家和地区批准使用。国外对乳酸链球菌素的研究己有五十多年，而我国则始于1989年，起步较晚，乳酸链球菌素的实际应用需进一步普及。朱俊晨，魏展饶5对研究乳酸链球菌素金黄色葡萄球菌的抑制条件及其影响因素，为在具体实践应用中进一步掌握乳酸链球菌素抑制金黄色葡萄球菌的推广应用提供依据。前人研究发酵培养基一般选用，蔗糖，蛋白胨，酵母膏，KH2PO4，NaCl，MgSO4，Tween 80等，pH6.9。Tween 80作为一种表面活性剂，是耐热的水溶性长链脂肪酸的醋类物质，可降低细菌菌体与培养基接触面之间的表面张力，能刺激多种胞外酶的产生，可影响某些微生物细胞的膜通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外。关于Tween 80对细菌素产生的影响，Garver等注意到在MRs培养基中若不添加Tween80，尽管菌体生长得非常好，弯曲乳杆菌素(Curvaticin)FS47却几乎不产生，这是第一次研究Tween对细菌素产生的刺激作用。的研究表明，Tween 80对乳酸链球菌10193J46产生细菌素有明显的刺激作用，并使发酵单位有了大幅度提高6 。早在1928年,国外学者L.A. Rogers 已注意到乳酸链球菌10193产生的代谢产物可有效地抑制某些细菌的生长。1947年Mattick等制备出此种多肽， 并命名为Nisin(Group Ninhibitory inhibitory substance)。1950年Hirsch 等首先 将 其 用 作 食品添加剂成功地抑制了引起Emmental Cheese膨胀腐败的肉毒梭菌。1953年,Nisin 的第一批商品化制品在英国面世。1969 年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会确认 Nisin可作为食品防腐剂。自1953年首次应用以来，至今已在五十多个国家得到应用，广泛用于乳酪产品加工、各种液态乳制品加工、酒精饮料、 罐装蔬菜、汤类、酱油等，也可用于啤酒、葡萄酒、酒精生产来控制乳酸菌腐败， 还可用于低 PH值食品。我国于1990年开始批准使用。到目前为止,全世界约有50 多个国家和地区广泛使用Nisin ,英国已有40 多年的应用历史,并实现了工业化生产7 。乳酸链球菌10193为兼性厌氧菌，多采用分批发酵方法进行生产，国外报道中较高的菌体产率为7.479/L(干重)。近年来随着膜材料和膜分离技术的迅速发展，使得细胞培养工程中的一项新技术过滤培养越来越诱人。它利用能截留细胞的微孔或超滤膜材料进行培养，通用性强，可使细胞浓度提高几十倍，并已在培养动物细胞产生干扰素，培养微生物生产乙醇等方面得到了应用8。近年来，对于乳链菌肽的研究，虽然在分子水平和应用上取得很大进展，但因其容易失活，从微生物发酵液中分离纯化的难度较大，造成目前分离纯化效率仍不理想，尤其是在工业化生产中，由于分离成本高，从而使产品价格昂贵，成为乳链菌肽广泛应用的限制因素。1.3 本课题研究的目的和意义Nisin 能够抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长与繁殖， 特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。是世界上公认的安全防腐剂，并极易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶降解。Nisin作为一种生物防腐剂,其重要实用价值和理论价值得到了各国科研机构的重视。同化学防腐剂相比，Nisin作为一种纯天然生物防腐剂具有许多优点队目前制约Nisin应用的主要因素有两个，一是生产成本太高, 二是纯品提取困难传统上Nisin发酵所用的培养基如MRS,M17,TGE 等有机氮含量都比较高, 这一方面增加了生产成本,另一方面由于培养基中含有较高浓度的多肽, 影响了的分离提纯虽然前人研究了各种因子对产生Nisin的影响, 但仅以提高产量为最终目的，忽略了各种因子之间的交互作用对产Nisin的影响。我国目前乳链菌肽的生产由于成本较高,还没有进行产业化生产,从而限制了乳链菌肽的应用。为了降低成本,形成规模化生产,必须对乳链菌肽发酵的各方面作深入研究。为了降低生产成本,形成规模化生产，必须对乳链菌肽发酵的各方面作深入研究，尤其是乳酸链球菌培养基优化方面至关重要。本文通过中心组合试验设计方法克服了以上缺点优化后的发酵培养基, 一方面在降低原料成本的同时提高了发酵单位, 另一方面由于发酵液中残留的杂蛋白的减少可以降低其对提取的干扰, 间接地降低了成本9。2材料与方法2.1 试验材料冻干的乳酸链球菌10193菌种：来源于中国菌种保藏中心。脱脂乳粉：完达山牌脱脂乳粉金黄色葡萄球菌 由长江大学生命科学学院试验室提供2.2 试验主要药品及试剂 蔗糖，葡萄糖，乳糖，可溶性淀粉，蛋白胨，酵母膏，牛肉膏,琼脂，Na2HPO412H2O，NaCI ，MgSO4，KH2PO4 ，吐温 80，NaOH，无菌水。CM1培养基（g/L）：蔗糖1O、蛋白胨1O、酵母膏1O、KH2PO4 10、NaCI 2、M gSO4 0.2 ，pH 6.810。检测培养基（g/L）：蛋白胨8 、酵母膏5 、葡萄糖5 、NaCI 5、Na2HPO412H2O2 、吐温80 10 mL、pH值6.8 11。活化培养基（乳酸链球菌10193） ：12% 脱脂乳，0.5% 葡萄糖，0.5 %酵母膏12。活化培养基（金黄色葡萄球菌）：牛肉膏蛋白胨培养基。2.3 试验主要仪器及设备HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司80-1型离心机 上海手术器械厂722 S 可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司PL303电子天平 上海精密科学仪器有限公司显微镜 上海精密科学仪器有限公司2.4 菌种的预处理2.4.1菌种活化及传代培养（1）冻干乳酸链球菌10193活化13用酒精棉将菌种管玻璃表面擦拭消毒，而后于酒精火焰处打开管口（事先用玻璃刀或小砂片割出刻痕），以灭菌铂耳环取之转移至入灭菌脱脂乳试管中。将上述接种完毕的脱脂乳试管置于30恒温培养箱中，培养12-24h，传代培养直至恢复活力，即使乳达到在6小时内凝固为止。本试验采用两种活化培养基，第一种为为12%脱脂乳，第二种为12%脱脂乳，0.5%葡萄糖，0.5%酵母膏，选择出最佳培养基。（2）金黄色葡萄球菌的活化在无菌状态下用接种环接金黄色葡萄球菌于灭菌后的蛋白胨酵母膏斜面培养基中，于37培养箱中培养。2.4.2镜检 每次活化之后均要涂片，Grams染色镜检，如菌种纯一活力恢复，即可继续试验。若污染杂菌，则必须采用乳酸链球菌10193活化培养基（12%脱脂乳）重新分离培养，镜检无杂菌才可使用。2.4.3培养方法和条件用移液管移取1%传代好的乳酸链球菌10193于100 mL CM1培养基中, 150 r/min摇床培养,30，24 h。培养完毕后以体积百分数为10%的接种量将种子液接种到发酵培养基中,30静置培养24 h ，定时取样, 检测样液OD620nm值及pH，并以杯碟法测乳酸链球菌10193素的抑菌圈平均直径。2.5 乳酸链球菌10193培养基优化的单因素试验以检测培养基为基础，以碳源、氮源、金属离子、培养温度为考察对象，以10%接种量,进行单因素试验测定发酵液的pH值，吸光度值OD620nm,并以杯碟法测定发酵液的抑菌圈直径，确定培养试验菌株培养基的最优组合。试验方案如下：碳源种类对试验菌株生长量的影响试验：葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，乳糖氮源种类对试验菌株生长量的影响试验：牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，混合氮源温度的影响试验：25，30，32，35，37金属离子种类对试验菌株生长量的影响试验: K+, Mg2+, Zn2+, Ca2+，Ba2+，Cu2+按照上述 3.1.2的培养方法, 改变单一培养条件即培养温度、发酵培养基中碳源，氮源，金属离子种类, 探讨乳酸链球菌10193菌株的适宜抑菌条件。2.6 抑菌试验 2.6.1发酵液预处理将培养一定时间的乳酸链球菌10193发酵液，5 400 r/min离心12 min，除去沉淀，收集上清液备用。2.6.2抑菌试验方法采用杯碟法和滤纸片法。用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。（1）杯碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将已知效价的标准样品和待测样品的溶液分别加入试验菌平板上的特制不锈钢管（牛津杯）中，结果在抗生素抑菌浓度范围内，试验菌不生长，出现透明的抑菌圈。测量其抑菌圈的大小，得到试验指标。（2）纸片法：利用扩散原理，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，在培养基上通过扩散在一定范围内形成抑菌浓度，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，测量其抑菌圈的大小，得到试验指标11。2.6.3金黄色葡萄球菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上充分活化，注入10ml 9%的生理盐水，并用接种环轻轻刮拭，将菌悬液移入灭菌试管中，备用。2.6.4采用杯碟法或滤纸片法（1）杯碟法：取无菌培养皿，加入融化的20 ml牛肉膏蛋白胨培养基作为底层，凝固。将融化并冷却至50-60的牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）加入金黄色葡萄球菌菌液3-5ml，充分混匀，立即取5ml均匀平铺子已凝固的底层培养基上，凝固成为上层培养基。放置牛津杯(内径60 mm，高80 mm)，注意间距相等，每只牛津杯加入离心好的乳酸链球菌发酵上清液0.1ml，每一因素更换移液管,使用游标卡尺测量抑菌圈直径。（2）纸片法：以牛肉膏蛋白胨培养基作为底层，凝固。取0.2mL制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液于培养基中，用涂布棒涂布均匀。将纸片沾取处理过的发酵液，均匀摆放于培养基之上，培养。2.6.5培养在每个培养皿内衬一层无菌滤纸，盖上平板盖，置30下培养24h。2.6.6测量抑菌圈直径培养结束后取出平板，移去牛津杯或滤纸片，用游标卡尺测量各抑菌圈直径。每组做3个重复，计算各组抑菌圈的平均值13。2.6.7抑菌方法的选择采用杯碟法与纸片法进行平行试验，两者抑菌效果相同，但滤纸片法误差较小，结果更为明显，方法简单，因此采用纸片法作为抑菌试验方法。如图1所示。 图1 杯碟法与纸片法对Nisin抑菌效果的比较2.7正交试验在单因素试验的基础上，以抑菌效果为主要指标，选择碳源、氮源、和金属离子为影响因素，确定各正交因子的水平，设计正交试验L9(33) 14，碳源浓度 2%，3%，4%, 氮源为混合氮源（蛋白胨：酵母膏：牛肉膏），金属离子浓度为 0.002mol/L，0.003mol/L，0.004mol/L 来进行正交试验,每次处理时间仍为24小时,其优化培养的工艺参数如下表1所示。表1 正交试验因素水平表水平因素A葡萄糖浓度/%B混合氮源浓度配比/%C 硫酸镁浓度/(mol/L)12.0a (3%蛋白胨+1%酵母膏+1%牛肉膏)0.00323.0b（4%蛋白胨+2%酵母膏+1%牛肉膏）0.00434.0C（2%蛋白胨+2%酵母膏+1%牛肉膏）0.005在正交试验后，能够确定出最佳提取条件，而且能够找出对Nisin产生量影响最大的因素。3 结果与分析3.1 菌种活化试验结果如图2所示，采用第二种培养基，即12%脱脂乳，0.5%酵母膏，0.5%葡萄糖可明显提高菌株活力，从第二代开始，活化时间明显缩短，变化量较大，酵母膏和葡萄糖的添加有益于乳酸链球菌10193的生长，使活化传代培养时间大大减少。活化10代后菌种活力已达到6h内凝固，并于2-4下保存，保存超过7天要重新活化。图2 乳酸链球菌10193培养基配方比较3.2 镜检的结果镜检的结果见图3，乳酸链球菌10193为革兰氏阳性菌，其细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的紫色15。由图3可以看出在100倍油镜下观察乳酸链球菌10193的菌株形态为球形和卵圆形，成对和短链存在，细胞体积较小。 图3 油镜下的乳酸链球菌101933.3 温度对菌株发酵液抑菌效果的影响以改良的检测液体培养基为基础，分别将其置于25，30，32，35，37下培养 24h 后测定其OD620nm，抑菌圈直径。表2 试验号及温度对pH的影响试验号12345 温度（）pH254.6304.3325.6355.1374.6温度对pH的影响，见表2， 温度在30时，其pH最低，抑菌效果越好（如图3），随温度升高， pH逐渐升高，在37时pH有所降低，抑菌圈平均直径开始增大，这说明乳酸链球菌10193产酸能力与Nisin抑菌效果有直接影响，成正相关。图4 温度对菌株抑菌效果和生长量的影响3.4 碳源对菌株发酵液抑菌效果的影响以检测液体培养基为基础，按1.5的比例分别加入乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖等4种碳源。于发酵24h后测定其OD620nm，pH,抑菌圈平均直径。表3 试验号及碳源对pH的影响试验号1234碳源种类pH乳糖5.1蔗糖4.5可溶性淀粉4.8葡萄糖4.4碳源对pH的影响，见表3，结果表明，在以蔗糖和葡萄糖为碳源时，pH最低，抑菌效果（见图4）最好，以乳糖和可溶性淀粉为碳源时，其pH较高，产酸能力弱，抑菌效果较差，说明乳酸链球菌10193产酸能力对乳酸链球菌产Nisin有直接影响。图5 不同碳源对试验菌株抑菌效果和生长量的影响以不同碳源代替检测培养基中的葡萄糖，试验了不同种类碳源对乳酸链球菌的生长及Nisin生物合成的影响，结果（图5）表明，以葡萄糖作为碳源时细菌生长量最大，而以蔗糖作为碳源时，其Nisin抑菌效果最好，其原因可能为乳酸链球菌与其他产Nisin的乳酸链球菌一样，有一个有效的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统作为蔗糖的吸收，运输，代谢的途径，从而蔗糖作为碳源时有利于乳酸链球菌产Nisin。综合考虑葡萄糖和蔗糖对乳酸链球菌发酵产物细胞生长量和Nisin效价的影响，选择葡萄糖为最佳碳源。 3.5 氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响按3.0的比例分别在培养基中加入蛋白胨、混合氮源(酵母膏：蛋白胨：牛肉膏=1:1:l)、酵母膏、牛肉膏、柠檬酸三氨等5种氮源15。发酵24 h，测定其抑菌圈直径，OD620nm，pH16。结果如下：表4 试验号及氮源对pH的影响试验号12345氮源种类pH蛋白胨7.6酵母膏5.7柠檬酸三氨7.5牛肉膏8.4混合氮源4.8氮源对pH的影响，见表4，结果表明，在以混合氮源为氮源时，pH最低，抑菌效果（见图6）最好，以牛肉膏蛋白胨以及柠檬酸三氨为氮源时，其pH较高，产酸能力弱，抑菌效果较差，说明乳酸链球菌10193产酸能力对乳酸链球菌产Nisin有直接影响。图6 不同氮源对菌株抑菌效果和生长量的影响试验不同种类氮源对乳酸链球菌10193的生长及其Nisin生物合成的影响，结果（图6）表明，以混合氮源作为氮源时其抑菌圈直径最大的，而无机氮源（柠檬酸三铵）则不能够被利用，除去混合氮源影响，酵母膏作为氮源时细胞生长量和抑菌效果最好，牛肉膏则相对影响最小，5种氮源产Nisin的抑菌效果的次序为：酵母膏混合氮源蛋白胨牛肉膏柠檬酸三铵。混合氮源为乳酸链球菌10193细胞生长和合成Nisin的最佳氮源。3.6 金属离子对菌株发酵液抑菌效果的影响以检测液体培养基为基础，按0.001mol/L的比例分别加入K+，Mg2+， Zn2+， Ca2+，Ba2+ 5种金属离子。发酵24 h，测定其抑菌圈直径，OD620nm，pH17。 结果如下表5 试验号及金属离子对pH的影响试验号123456金属离子种类pHK+6.5Mg2+5.2Zn2+6.2Ca2+5.4Ba2+5.4Cu2+6.3金属离子种类对pH的影响，见表5，结果表明，在以Mg2+，Ca2+，Ba2+为金属离子时，pH最低，抑菌效果（见图7）最好，K+，Cu2+时，其pH较高，产酸能力弱，抑菌效果较差，说明乳酸链球菌10193产酸能力对乳酸链球菌产Nisin有直接影响。图7 不同金属离子对菌株抑菌效果和生长量的影响试验不同金属离子对乳酸链球菌10193的生长及其Nisin生物合成的影响，结果（图7）表明，6种金属离子产Nisin的抑菌效果的次序为：Mg2+ Zn2+ K+ Ba2+ Ca2+ Cu2+ ,而细胞生长量在不同金属离子之间的变化趋势与抑菌效果趋势大致相同，即以Mg2+作为金属离子加人培养基时，较之其它金属离子相比，其菌株生长量也达到最大，如图6所示。综合考虑，确定Mg2+ 为最适金属离子。3.7 正交试验结果培养基的成分和含量影响着Nisin的产生和产量。采用正交试验正交试验L9(33)对不同碳源，氮源和金属离子浓度下产Nisin最佳条件进行优化，结果试验见表6。由表6可见，3个因素的极差大小顺序为：硫酸镁浓度混合氮源浓度配比葡萄糖浓度，可见金属离子浓度是影响Nisin产生和产量的主要因子，其次是混合氮源浓度和葡萄糖浓度。最优的营养条件组合为A2B2C3 。正交试验于单因素试验的结果存在一定的出入，根本原因在于单因素试验是在固定其他因素的前提下只考虑由某一因素的变化而带来的影响；而正交试验则是同时考察多个因素的影响，最终得到一组包含有各个因素的最优组合，结果全面，信息量大18。表6 正交试验结果及其极差分析试验号因素A葡萄糖浓度/%B混合氮源浓度配比/%硫酸镁浓度/(mol/L)抑菌圈平均直径/cm11（2.0）1（a）1（0.003）1.207212（b）2（0.004）1.043313（c）3（0.005）1.10642（3.0）121.04552231.46762311.38573（4.0）131.15683211.13593321.015K13.3563.4083.727K23.8973.6443.103K33.3063.5073.730k11.1191.1361.242k21.2991.2151.034k31.1021.1691.243R0.1970.0790.209最优水平A2B2C3因素主次CAB 4 讨论与结论（1）乳酸链球菌10193生长迅速，产酸速度快，后酸化程度高。采用12%脱脂乳，0.5%酵母膏，0.5%葡萄糖活化培养基可明显提高菌株活力。（2）乳酸链球菌10193产酸能力对Nisin抑菌效果有直接影响，产酸能力越强抑菌效果越好。（3）通过单因素试验，确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比，分别为2.5%葡萄糖，1%蛋白胨+1%酵母膏+1%牛肉膏、0.003mol/LMg2+。 （4）采用正交试验优化后得到的乳酸链球菌10193产Nisin的最佳营养条件：3.0%葡萄糖，4%蛋白胨，2%酵母膏，1%牛肉膏，0.005mol/L MgSO4 .本研究为应用乳酸链球菌10193进行工业化生产乳酸链球菌素提供了必要的参数指标。本试验研究表明，Nisin的生物合成与乳酸链球菌10193菌体生长成正相关，表现出一种初级代谢动力学特征，乳酸链球菌10193生长和Nisin生物合成的最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和混合氮源，浓度分别为3%和7%，0.005mol/L的硫酸镁对乳酸链球菌的生长及其Nisin生物合成有极大促进作用。 本试验有较大的研究空间，由于试验室条件和时间有限没有进行深入研究，今后工作可以从以下几点入手。第一，缩小温度差距，考察温度对菌株生长的影响21。第二，关于碳源的选择，可以考虑混合碳源，即蔗糖与葡萄糖的混合物，乳酸链球菌10193有一个有效的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统作为蔗糖的吸收，运输，代谢的途径22，主要考察葡萄糖在其发酵过程中发挥的效用与菌株本身的结构的关系23。本试验为以后的微生物型食品防腐剂的研究提供基础。参考文献1李江阔,张鹏,岳喜庆,纪淑娟,张平.乳酸链球菌素研究现状及在畜产品加工中的应用J.保险与加工,2008,9(1):58.2黄明发,刘君.乳酸链球菌素在肉制品中的应用J.肉类研究,2005,(5):3942.3缪存影.天然食品防腐剂乳酸链球菌素J.中国食物与营养,2008,(4):3032.4张刚.乳酸细菌基础、技术和应用M.化学工业出版社,2007:6066.5朱俊晨,魏展饶.乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌抑制条件的研究J,微生物学通报,2005,(1):164166.6庄绪亮,张洪勋,马桂荣,孔健.不同发酵条件下Tween80对乳酸链球菌SM526产Nisin的影响J,化工冶金,2002,1(1):145148.7张春江,罗欣,王海燕.Nisin的特性及其在肉制品中应用J,肉类研究,2002,(3):3133.8陈婕,李东.乳酸链球菌过滤培养的研究J,研究科学,1996,(2)42:68.9焦中高,陈海昌,刘茵.营养因素对乳酸乳球菌DL203生长及其Nisin生物合成的影响J, 微生物学通报,2003,(11): 2224.10庄绪亮,张洪勋,马桂荣,孔健.乳酸菌肽发酵的影响因子J.化工冶金,2000,(1):9397.11赵斌,何绍红.微生物学试验M.科学出版社,2004:3840.12刘慧,冯一兵.酸奶生产的菌种保藏、活化及其扩培技术J.食品工业,1996,(1):2122.13陈秀珠,何松,龙力红,还连栋,薛禹谷.乳链菌肽AL2的发酵条件研究J.微生物学通报,1995,(22)4:215218.14明道绪.生物统计附试验设计M.第三版.北京:中国农业出版社,2001:303311.15朱会霞,孙金旭,魏淑珍,李长文.Hs5乳酸链球菌发酵培养基优化研究J.酿酒科技,2008,(6):3537.16张秀明,张文生,李慧,乔明强,高才昌.培养条件对乳酸乳球菌N302 合成乳链球菌素的影响J.研究科学,2008,(6):3745.17白泽朴,吕淑霞,林英,郝宇涵,姜萍萍.乳酸乳球菌T0625菌株产Nisin最佳培养条件的研究J.科学研究,2008,29(6):3745.18焦中高,陈海昌,刘茵.乳链菌肽高产菌株的选育及其生理特性J.大连轻工业学院学报,1997,(12):576119吴疆,金红,童应凯,韦东胜.乳酸链球菌发酵培养基的优化J.中国酿造,20079(12):2325.20JAN R M S, ROLLEMA H S. Influence of amino acid substitu-tions in the Nisin leader peptide on biosynthesis and secretion of Nisin by Lactococcus lactisJ.Bio Chem, 1994, 269 (5) :35553562.21吴琼,生英涛,唐名山,谷体华,葛庆燕.乳酸乳球菌发酵液中乳链菌肽的分离纯化J,酿酒科技,2003,24(9):103106.22 JAN R M S,ROLLEMA H S.Influence of amino acid substitutions in the Nisin leader peptide on biosynthesis and secretion of Nisin by Lactococcus lactisJ.Bio Chem,2004,269（5）：35553562.23 Cutter C N,Siragusa G R.Population Reductions of Gramnegative Pathogens Following Freatments with Nisin aiid Chelator Under Various ConditionsJ.J Food Pml,1995,58(9):977983.致谢在本试验的设计、操作和论文的撰写过程中，得到了长江大学生命科学学院李真顺老师的悉心指导。自选题以来，李老师对我的论文进程倾注了很大的期望，也给了我很多宝贵的意见。在论文的选题、实施和成文的整个阶段，李老师在百忙之中给予了精心的指导。李老师求实的科研精神，严谨的治学态度让我受益匪浅，在此谨向李真顺老师致以最诚挚的谢意！本试验的完成是在生命科学学院食品科学与工程试验室完成的，在试验完成的过程中，得到了试验室曾凡梅、王襄宾老师的帮助和指导，在试验过程中，在试验设备、仪器、试剂等方面给予了很多帮助；同时也得到了许多同学的的帮助，在此一并表示感谢。最后，对长江大学生命科学学院的所有老师献上我最真诚的祝福，感谢你们在大学四年来对我的关怀和指导。 学生: 2009年6月袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈