（化学工艺专业论文）大豆脂肪氧合酶催化合成氢过氧化油脂.pdf

摘要 摘要 氢过氧化油脂是非常重要的合成中间体，可用来制备环氧化合物，羟基化合物， 酮类及多官能团物质：还可使其裂解形成醛、醛酸和二元酸。脂肪氧合酶能专一催化 含有c 括，c 括1 ，4 戊二烯结构的直链脂肪酸、脂肪酸酯及其醇生成对应的氢过氧化物。 本文研究了脂肪氧合酶精酶催化合成氢过氧化玉米胚芽油、脱脂豆粉分别催化合成氢 过氧化玉米胚芽油及氢过氧化大豆油的反应，并优化了亚硫酸钠还原氢过氧化大豆油 制备羟基大豆油的工艺条件，主要内容和结果如下。 1 、研究了脂肪氧合酶精酶催化合成氢过氧化玉米胚芽油的反应，在实验条件下， 最佳工艺条件为：5o c 、溶剂乙醇浓度4 ( v v 体系) 、玉米胚芽油浓度1 0 0g l 、硼酸 硼砂缓冲液( p h9 o ) 、氧气流量1 5m l m i n 、脂肪氧合酶( 酶活为3 0 5 x 1 0 5u m l 酶 液) 4 5 ( v v 体系) 、反应1 5h 。氢过氧化玉米胚芽油得率达5 3 8 。 2 、直接用脱脂豆粉催化合成氢过氧化玉米胚芽油，在实验条件下，最佳工艺条 件为：8 0 目脱脂豆粉、1 5o c 、玉米胚芽油浓度1 0 0g l 、脱脂豆粉浓度2 0 0g l 、p h 9 0 、 乙醇浓度6 ( v v 体系) 、b h t 浓度o 1 3g l 、体系内缓冲液含量8 3 ( v v 体系) 、反应3h 。 氢过氧化玉米胚芽油得率达7 2 1 。 3 、直接用脱脂豆粉催化合成氢过氧化大豆油，在实验条件下，最佳工艺条件为： 8 0 目脱脂豆粉、1 5o c 、大豆油浓度1 5 0g l 、豆粉浓度2 0 0g l 、p h 9 0 、乙醇浓度6 ( v v 体系) 、b h t 浓度0 1 4g l 、体系内缓冲液含量8 3 ( v v 体系) 、反应3h 。氢过氧化大豆油 得率达7 5 1 。重复使用脱脂豆粉三次所得产物得率分别为7 5 1 、7 0 9 及3 9 1 。 4 、用亚硫酸钠还原氢过氧化大豆油制备羟基大豆油。在实验条件下，最佳工艺 条件为：1 5o c 、以8 8 2 ( v v 体系) 的乙醇为溶剂、n ( n a 2 s 0 3 ) ：柞( o o h ) = i 2 ：1 、反应1 5 h 。氢过氧化大豆油的转化率达9 5 8 。 关键词t 大豆脂肪氧合酶，玉米胚芽油，大豆油，氢过氧化物 a b s t r a c t a b s t r a c t o i lh y d r o p e r o x i d e sa r ev e r yi m p o r t a n ti n t e m e d i a t e so fp h a r m a c e u t i c a ls y n t h e s i so r c h e m i c a ls y n t h e s i s t h e yc a nb eu s e dt op r e p a r ee p o x i d e ，h y d r o x y lc o m p o u n d ，k e t o n e sa n d p o l y f u n c t i o n a lc o m p o u n d a l s o ，o i lh y d r o p e r o x i d e sc a nb ed e c o m p o s e dt oa l d e h y d e s ， a l d e h y d ea c i d sa n dd i c a r b o x y l i ca c i d s l i p o x y g e n a s e ( l o x ) ( 1 i n o l e a t e ：o x y g e nr e d u c t a s e ； e c1 13 11 12 ) i sad i o x y g e n a s e w h i c hc a t a l y z e st h eo x i d a t i o no fl i n o l e i ca c i da n do t h e r p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sa n df a t t ya c i de s t e r s ，c o n t a i n i n gac s ，c s 1 ，4 - p e n t a d i e n em o i e t y , i n t oh y d r o p e r o x i d e s t h er e a c t i o no fs o y b e a nl i p o x y g e n a s ec a t a l y z i n g - o - x i d i z i n gc o r no i l a n ds o y b e a no i lw e r es t u d i e d t h ep r o c e s sc o n d i t i o n so fs o d i u ms u l f i t er e d u c i n gs o y b e a n o i lh y d r o p e r o x i d ew e r eo p t i m i z e d t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep r o c e s sc o n d i t i o n sw h i c ha f f e c tt h ey i e l do fc o r no i l h y d r o p e r o x i d ew e r e i n v e s t i g a t e d ay i e l do f5 3 8 w a so b t a i n du n d e rf o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：5o c ，4 ( v v 体系) o f s o l v e n t e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n , 10 0g lo fc 0 1o i lc o n c e n t r a t i o n , b o r a t eb u f f e r s o l u t i o n ( p h 9 o ) ，15m l m i nf l o wr a t eo fo x y g e n ，3 0 5 x10 u m lo f s o y b e a nl i p o x y g e n a s e a c t i v i t y , a n dr e a c t i o nt i m e1 5h 2 t h es y n t h e s i so fc o r no i lh y d r o p e r o x i d ec a t a l y z e db yd e f a t t e ds o y b e a nf l o u rw a s s t u d i e d ay i e l do f7 2 1 w a so b t a i n e du n d e rf o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：10 0g lo fc o lo i l c o n c e n t r a t i o n , 8 0m e s ho fd e f a r e ds o y b e a nf l o u r , 2 0 0g lo fd e f a r e ds o y b e a nf l o u r c o n c e n t r a t i o n , 15q c ，p h 9 0 ，6 ( v v 体系) o fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n d0 13g lo fb h t c o n c e n t r a t i o n ，8 3 ( v v 体系) o fb o r a t e b u f f e rc o n c e n t r a t i o n ，a n dr e a c t i o nt i m e3 h 3 t h es y n t h e s i so fs o y b e a no i lh y d r o p e r o x i d ec a t a l y z e db yd e f a a e ds o y b e a nf l o u r w a ss t u d i e d ay i e l do f7 5 1 w a so b t a i n e da f t e r3hu n d e rf o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：15 0g l o fs o y b e a no i lc o n c e n t r a t i o n , 8 0m e s ho fd e f a t t e ds o y b e a nf l o u r , 2 0 0g lo fd e f a r e d s o y b e a nf l o u rc o n c e n t r a t i o n ，15o c ，p h 9 0 ，6 ( 讥体系) o fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，0 14g lo f b h t c o n c e n t r a t i o n ，8 3 ( v v 体系) o f b o r a t eb u f f e rc o n c e n t r a t i o n t h ed e f a r e ds o y b e a nf l o u r w a sr e u s e df o rt h r e et i m e sa n dt h ey i e l d so fs o y b e a no i lh y d r o p e r o x i d ew e r e7 5 1 ，7 0 9 a n d3 9 1 ，r e s p e c t i v e l y 4 s o y b e a no i lh y d r o p e r o x i d e sw e r er e d u c e dt oh y d r o x ys o y b e a no i lb ys o d i u ms u l f i t e s o l v e n tt y p e ，s o l v e n tc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，t h ed o s a g eo fs o d i u ms u l f i t ea n dr e a c t i o n t i m ew e r ei n v e s t i g a t e d ac o n v e r s i o no f9 5 8 w a so b t a i n e du n d e rf o l l o w i n gc o n d i t i o n s ： 15o c ，8 8 。2 ( v v 体系) o fs o l v e n te t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，n ( n a 2 s 0 3 ) ：n ( - o o h ) i s1 2 ：1 ，a n d r e a c t i o nt i m e1 5h k e y w o r d s ：s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ，c o r no i l ，s o y b e a no i l ，h y d r o p e r o x i d e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 关于论文使用授权的一说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 氢过氧化油脂的合成与应用 1 1 1 氢过氧化油脂的合成 油脂是食物中三大产能营养素之一，具有重要的生理作用【l 】。酶法合成氢过氧化 油脂的过程如下：将含有顺，顺1 ，4 戊二烯结构的油脂与脂肪氧合酶酶液混合，一 定温度和p h 下，通入氧气反应一定的时间，即生成氢过氧化油脂【2 】。化学法则用f e c l 3 氧化油脂【3 一，反应的持续时间为1 2 7 8h ，温度为一2 0o c 到4 0o c ，在大气压下或在减 压下合成氢过氧化油脂。 1 1 2 制备风味物质 利用生物合成法外源催化合成风味物质是一条经济可行、逐渐被重视的路线【5 。 氢过氧化油脂经裂解可以制备风味物质。w h i t e h e a d 等r 7 】以大豆脂肪氧合酶粗酶液催 化合成氢过氧化物，氢过氧化物再经氢过氧化物裂解酶裂解制备风味物质。利用该法 生产1 己醇、顺3 己烯1 醇、反2 己烯1 醇、反2 己烯醛及己醛，产率分别为3 5 1 、 4 1 9 、1 5 2 、2 3 8 及3 5 8 。n o o r d e r m e c r 等1 8 j 以水解红花油和水解亚麻籽油为原 料，利用脂肪氧合酶催化合成氢过氧化物，氢过氧化物经氢过氧化物裂解酶裂解生产 己醛，总产率为5 0 。k o h l e n 等【9 】以黄油为原料，经大豆脂肪氧合酶氧化生成氢过氧 化黄油，再经加热裂解生产风味物质( z ) 4 庚醛、( e ) 一2 壬烯醛及( e ，z ) 2 ，6 壬二烯 醛，这种方法制得的香味物质适合作为牛奶香料。m u l l e r 等【l o 】以大豆粉催化葵花籽油 制备氢过氧化葵花籽油，氢过氧化葵花籽油经番石榴叶氢过氧化物裂解酶催化裂解， 制备出纯度达9 6 的己醛；他们还以水解亚麻籽油作为原料，在同样的条件下，制备 出3 ( z ) 己烯醛。2 0 0 2 年m a r c z y 等【l l 】以水解葵花油为原料，利用大豆脂肪氧合酶催 化生产氢过氧化物，以从菠菜叶中提取的氢过氧化物裂解酶为催化剂，催化氢过氧化 物裂解合成己醛。其中，生成氢过氧化物的产率为7 2 ，生成己醛的产率为5 4 。 2 0 0 4 年a g n e s 掣1 2 j 以大豆脂肪氧合酶( l o x 1 ) 为催化剂，催化水解亚麻籽油合成氢过 氧化亚麻酸，底物浓度为1 0 0m m o l l ，生成氢过氧化亚麻酸的产率为6 2 ，再用青 椒氢过氧化物裂解酶裂解氢过氧化亚麻酸合成己烯醛，产率为3 7 。此外，2 0 0 5 年 k e r l e r 1 3 j 分别以黄油、柑橘油、亚麻籽油、葵花籽油为原料，以豆粉作为脂肪氧合酶 来源生产氢过氧化油脂，生成的氢过氧化油脂在酸性条件下( 柠檬酸) 加热裂解，温度 控制在9 0 - 1 8 0o c 。主要得到了己烯醛、己醛、2 - ( e ) 壬烯醛、2 ，6 ( e ，z ) 壬二烯醛及 4 - ( z ) 庚烯醛等香味物质。 1 1 3 氢过氧化油脂还原制备羟基油脂 氢过氧化油脂经还原可生成含有不饱和双键的羟基油脂【4 1 ，其支链上含有羟基和 不饱和双键，因此可以发生水解、酯化、加成、氧化、裂化、环氧化、酰胺化及脱水 江南大学硕士学位论文 等反应。进而可制得多种改性化学产品。 中国专利c n1 3 4 2 1 9 3 a t 3 】用三氯化铁氧化油脂制备氢过氧化油脂，再用n a b i - 1 4 作为还原剂还原氢过氧化油脂制备羟基油脂，硼氢化钠的乙醇溶液被分成几份逐渐加 入到制得的氢过氧化油脂中，将混合物的温度保持在4o c 和2 5o c 之间。当温度恒定 时，结束反应。然后用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥有机相，在真空状态下蒸发滤液。 得到的产品是一种淡黄色的油状液体，并带有轻微的香味。 n a h s 0 3 也可以还原氢过氧化油脂，反应方程式如式( 1 1 ) ，另外在酸性条件下， 氢过氧基能与发生定量反应，i 被氧化成碘单质，氢过氧基则被还原为羟基，如 方程式0 - 2 ) 。含有氢过氧基的油脂和三苯基磷发生定量反应，生成三苯基氧磷i l 制， 氢过氧基被还原成羟基，如式( 1 3 ) 。 r - c h 2 0 0 h + n a h s 0 3 - - - r c h 2 ( n a s 0 3 ) o h + n a h s 0 4式( 1 - 1 ) r o o h + 2 i - + 2 h + 1 2 + r o h + h 2 0式( 1 2 ) t + 一吊 1 1 4 其它工业应用 氢过氧化油脂除了可用于产生许多风味物质外，也可用于涂料、染料、洗涤剂、 聚氯乙烯增塑剂的工业化生产，还可以作为药物合成的中间体1 1 5 , 1 6 。例如目前增塑剂 绝大部分以石油为原料来制备，若利用脂肪氧合酶对脂肪酸或其酯进行选择性催化， 形成特定的脂肪酸或其酯的氢过氧化物衍生物，再将之环氧化，生成环氧化脂质。则 可以减小对石油的依赖。p i a z z a 掣1 7 】研究了大豆脂肪氧合酶氧化甘油酯和磷酸甘油酯 的反应，在p h 8 时氧化反应的速率最大。磷酸甘油酯的氧化依赖其极性头基的结构， 其氧化速率较低，是亚油酸氧化速率的7 2 8 。二甘油酯的氧化速率是亚油酸氧化 速率的4 0 。 1 2 脂肪氧合酶的结构及催化机理 脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ，e c l 1 3 1 1 1 2 ，简称l o x ) 属氧化还原酶，能专一催化 含有c 括，c 捃1 ，4 戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯，使其通过分子内加氧， 形成具有共轭双键的氢过氧化物【i 8 - 2 0 1 ( 见图1 - 1 ) ，这些氢过氧化物是非常重要的合成 中间体4 , 1 6 , 2 1 ，2 2 1 。 2 第一章绪论 八，= 、，= 、 、一一、一，c o o h l i n o l e i ca c i d o o h 、纱、= ，m c o o h 9 。h y d r o p e r o x y l i n o l e l ca c i d1 3 。h y d r o p e r o x y l i n o l e i ca c i d 图1 1l o x 催化亚油酸加氧反应的两种初级产物【1 6 】 f i g 1 - 1t w op r i m a r yp r o d u c t so fd i o x y g e n a t i o nc a t a l y z e db yl o x 1 9 3 2 年a n d r e 和h o u 2 3 】首先发现大豆蛋白制品产生豆腥味是因为其中多元不饱 和脂肪酸发生酶促反应的结果，其中关键的酶就是脂肪氧合酶。1 9 4 7 年t h e o r e l l 等【2 4 】 首次从大豆中获得了脂肪氧合酶的结晶，分子量为1 0 2 k d a 。在随后的2 5 年里，有 关脂肪氧合酶的研究进展缓慢。自1 9 7 2 年c h a r t 2 5 】在国际会议上宣布每摩尔大豆脂肪 氧合酶( l o x 1 ) 含有1 摩尔铁后，有关脂肪氧合酶的研究迅速升温。豆科植物种子如 大豆、蚕豆等中富含脂肪氧合酶。大豆中蛋白含量为4 0 左右，成熟的种子中，脂肪 氧合酶占总蛋白含量的1 2 。大豆中的脂肪氧合酶活性高于其它植物中提取的脂肪 氧合酶，从大豆中提取脂肪氧合酶的效率较高。因此大多数的研究都以大豆脂肪氧合 酶为模型来进行 4 , 1 6 , 2 1 】。 1 2 1 脂肪氧合酶活性中心结构 脂肪氧合酶分子中的非血红素铁处于一种八面体配位环境中【2 剐。在一定的条件 下，铁原子从高自旋的f e 2 + 休止态转变为具有催化活性的高自旋的f e 3 + 激活态。通过 确定大豆脂肪氧合酶( l o x 1 ，l o x 2 ) 的初级结构，可以观察到一个富含组氨酸( h i s ) 残基的区域。进一步的研究表明：铁原子中心活性位点包括5 个内源配体( 1 i g a n d ) 和 一个外源配体。对大豆l o x 1 ，l o x 3 来说，内源配位体由一个i l e 8 3 9 残基末端碳原 子上的羧基，三个h i s 残基( h i s 4 9 9 ，h i s 5 0 4 ，h i s 6 9 0 ) ，以及a s l l 6 舛残基上的8 氧原子组 成。h i s 4 9 9 ，h i s 5 0 4 以及h i s 6 9 0 ( l o x 1 ) 对键合铁原子很重要。以h i s 、a l a 、s e r 代替 a s n ，仍可以与铁键合，但以a l a 、s e r 代替a s n 将会导致l o x 3 失活。外源配体可 能是水分子，它占据的位点是催化机制的关键( 见图1 2 ) 【2 饥。当f e 2 + l o x 被激发为 f e 3 + l o x 后，其催化中心的水配体离子化，形成一个羟基配体，该键长较短，仅为 1 8 8a ，而其余5 个配体的平均键长为2 11a 。在l o x 表面存在两个空腔，分别通 至内部催化位。空腔i 是非常疏水的，是0 2 渗透进入酶内部的路径；空腔是脂肪 酸进入的路径【2 引。 江南大学硕士学位论文 图1 - 2 大豆脂肪氧合醇( l o x 1 1 的活性中心哪 f i g 】2 a c t i v ec e f i t e r o f s o y b e a nl o x 。1 1 2 2 腊肪氧合酶催化机理 关于脂肪氧合酶过氧化催化机制的途径四l ，主要包括两种假设：好氧反应和厌 氧反应，它们可能同时发生。氢过氧化物的生成需要三个步骤t ( 1 ) 脂肪氧合酶被最初 生成的微量氢过氧化物激活；( 2 ) 脂肪氧台酶从活化亚甲基中移去一个氢原子；( 3 ) 将 氧接入底物分子中产生氢过氧化物 3 0 1 。每分子脂肪氧合酶都含有一个高自旋的非血 红素铁原子，常以f d + ( i b 活性形式l 和f 以活性形式) 中一种状态存在。在绝大多数 脂肪氧合群接触催化反应中，铁在f e 2 + 春i l 眦间变动，但铁原子一般不会离开大豆 脂肪氧合酶j 。 脂肪氧舍酶的作用机制也可用大豆脂肪氧舍酶的同工酵l o x - i 作用于底物亚油 酸( 1 u g ) 的机制来解释( 图i - 3 尸。脂肪氧合酶处在未活化状态时，酶分子中的铁以还 原态f 一的形式存在1 3 3 1 。微量的1 3 也氢过氧化亚油酸与脂肪氧合酶作用将其激发为 活化态，此时酶分子中的铁以f 矿形式存在。如图1 - 3 所示，活化态脂肪氧台酶正f i 卅) 作用于亚油酸的第一步是从亚油酸的g l l 位上立体有择地取走一个氢唧。在图1 3 中所指出的脂肪氧合酶同工酶l o x - 1 的催化机制中，腊肪氧台酶取走了h ，产生黄 色的亚油酸自由鲞酵络合物匝- f ，_ r ，口”，这时脂肪氧台酶分子中的矽被还原成 f e 卦。 接下来的反应可分为两种途径；( 1 ) 在有氧条件下，啦接至4 亚油酸自由基酶络 合物( e - f ，r ) 上去。有可能伴随着发生0 2 被活化成嘶的过程，啦通过反面( o p p o s i t e 枷e ) 机制接到亚油酸分子上被取走的 r 所在位置的相反一侧。亚油酸自由基o 被氧 化成氢过氧化亚油酸游离基皿o o ) 。氢过氧化亚油酸游离基从酶分子中的f e 上取走 一个电子并从介质中得到一个质子形成1 3 - , 氢过氧化亚油酸( 1 3 - l - r o o h ) t 同时脂 肪氧合酶中的铁m - - 价变为三价继续催化反应。在1 3 也喜过氧化亚油酸( 1 3 - l - 氢过 氧化顺9 ，反1 1 十八碳二烯酸) 形成时，取键从c - 1 2 转移到c 1 1 ，构型从顺式变成 第一章绪论 反式。在p h9 0 时，大豆脂肪氧合酶的同工酶l o x 1 催化亚油酸合成的主要产物是 1 3 三r o o h 。此外，还可能产生其它三种异构体：1 3 - r r o o h ( 1 3 r 氢过氧化反9 ，反 一l l - 十八碳二烯酸) 、9 r - r o o h ( 9 r - 氢过氧化反1 0 ，顺1 2 十八碳二烯酸) 和 9 l - r o o h ( 9 一l - 氢过氧化反1 0 ，反1 2 十八碳二烯酸) 。除了酶的特异性外，还有许 多其它因素决定了脂肪氧合酶作用的产物究竟是哪一种异构体或哪几种异构体及异 构体的比例。 ( 2 ) 在没有氧气存在的条件下，亚油酸自由基酶络合物( e f e + + ”r ) 分解成亚油酸 自由基( r ) 和酶( e f e ，酶( e f e + + ) 与1 3 也r o o h 作用产生自由基r o e 与o h o 。同 时，酶( e - f e 抖) 变成酶( e f 1 ，自由基r o e 及o h e 与亚油酸自由基作用生成二聚体， 聆戊烷及氧代二烯酸等。 图1 3 脂肪氧合酶作用的机制【3 2 】 r h 亚油酸r o o h 氢过氧化亚油酸 f i g 1 3 m e c h a n i s mo fl o x c a t a l y s i s 1 3 脂肪氧合酶的制备及影响其催化反应的因素 江南大学硕士学位论文 1 3 1 脂肪氧合酶的制备 19 4 7 年t h e o r e l l l 2 4 】等首次从大豆中获得了分子量为10 2 k d a 的脂肪氧合酶结晶 2 , 4 , 1 6 , 3 6 1 。此外，在许多其它天然物如马铃薯、芦笋、西红柿、玉米、苹果、海藻、鱼 翅及一些真菌类中也发现了脂肪氧合酶 1 9 , 3 7 , 3 8 】。2 0 0 4 年王辉龙等【3 9 1 从番茄果实中提 取脂肪氧合酶，提取液为含o 1 t r i t o n x 1 0 0 的磷酸盐缓冲液( o 1 m o l l ，p h 6 8 ) 。2 0 0 5 年蔡琨等m l 用水浸提法从大豆中用提取脂肪氧合酶。成熟的大豆种子中l o x 约占种 子蛋白含量的1 2 1 3 6 j ，且在大豆酶系统中，脂肪氧合酶的活性最高。 提取脂肪氧合酶的方法主要有水浸提法、盐析法及共沉淀法3 种 2 , 4 , 1 6 3 6 。( 1 ) 水 浸提法得到的是粗酶液。将大豆粉浸入水中，搅拌一定时间后，离心取上清液即得脂 肪氧合酶粗酶液。水浸提法的蛋白质溶出率可达8 5 ，所得酶液中含有较多的杂蛋白。 但此方法过程简单，减少了操作过程对酶活的损伤，因此得到粗酶液的总酶活较高。 蔡琨等【3 6 】用脱脂豆粉先加水搅拌，再进行离心分离，得到脂肪氧合酶粗酶液的总酶 活为6 7 1x1 0 1 7 u 1 0 9 豆粕，比酶活为8 6 1x1 0 5 u m l 粗酶液。( 2 ) 盐析法是一种比较 古老的方法，目前仍广泛采用。盐析法的优点是简便、安全、重现性好，缺点是分辨 率低、纯度提高不明显。它的原理是：根据酶和杂蛋白在高盐浓度下的溶解度不同进 行分离纯化。低盐浓度下，酶的溶解度随盐浓度升高而增加，当盐浓度升高到一定值 后，酶的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使酶沉淀出来【4 0 。最常用的中性盐 是硫酸铵，这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分 离效果好，而且价廉易得。二次盐析法是用较低盐浓度除去杂蛋白，再用较高盐浓度 进行分离纯化。f i n a z z i 等】先将脱脂豆粉放入1 0 0m l 烧杯中，加入p h 6 8 的磷酸盐 缓冲液，搅拌1 5h ，用双层纱布过滤，滤液用硫酸铵调饱和度至o 5 0 ，用0 5 0m o l l 的氢氧化钠溶液调滤液到p h 6 8 ，静置，再用4 0 0 0r r a i n 的离心机离心1 0m i n ，沉淀 物用1 0 0m l 磷酸盐缓冲液溶解，再用硫酸铵调饱和度至0 3 0 ，调p h 至6 8 ，静置， 离心分离，沉淀物即为大豆脂肪氧合酶，于4o c 储存备用。( 3 ) 共沉淀法的原理：在 一定条件下，非离子型聚合物如聚乙二醇( p e g ) ，离子型表面活性剂如十二烷基硫酸 钠等，与蛋白质直接或间接地形成络合物，从而将蛋白质沉淀析出，然后再用适当方 法溶解出脂肪氧合酶，除去杂蛋白和沉淀剂，进而纯化脂肪氧合酶。聚7 , - - 醇( p e g ) 无毒、溶解时放热少、形成沉淀的平衡时间短，一般当p e g 的浓度达到3 0 时，就 可以使大部分蛋白质沉淀出来。这也是一种较好的提取方法，操作简便，但成本相对 于盐析法较高。蔡琨等【3 6 】也曾用此法提取酶液：脱脂豆粉加水并用1m o l l 盐酸调至 p h 4 5 ，搅拌5 0m i n ，过滤，滤液中加入5 0 的p e g 6 0 0 0 至p e g 浓度达3 0 ，继续 搅拌4 0m i n ，离心分离2 0m i n ，用p h 9 0 ，0 2m o l l 的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，滤去 不溶物得到酶液。利用此法得到的酶液总酶活为2 4 1x1 07 u 1 0 9 豆粕。 1 3 2 脂肪氧合酶酶活测定 1 3 2 1 量磁( w a r b u r g 呼燃, a a c c 方法) 6 第一章绪论 量压法的测定原理是【4 2 】：脂肪氧合酶催化底物与氧结合形成氢过氧化物，使得 一定体积的密闭体系内氧气的量减少，在温度恒定的条件下，体系的气体总压下降。 根据密闭体系的总气体体积和测定得到的气体压力变化值，运用气体状态方程就可以 计算出反应的耗氧量。耗氧量与酶反应强度线性相关。该法的主要优点是测定参数与 反应体系浊度无关，因而既适用于纯酶也适用于粗酶酶活力的测定，但由于测定时需 不断振动反应瓶以保持底物的乳化和温度的恒定，酶活力会因振动而部分损失。 1 3 2 2 分光光度法 脂肪氧合酶催化多不饱和脂肪酸产生氢过氧化物，这些氢过氧化物具有共轭双键 的结构，在2 3 4 n m 处有特征吸收，通过测定反应体系在2 3 4n m 处的吸光度来推算出 脂肪氧合酶酶活力。用分光光度计测定的体系需清亮透明，不能有浊度，因此本方法 不适用于浊度较高的粗酶液酶活力的测定，例如未脱脂的大豆提取液降2 4 3 朋】。 1 3 2 3 淀粉法 淀粉法测定的基本原理是【4 2 】：脂肪氧合酶催化底物( 如亚油酸) 反应生成的氢 过氧化物在酸性条件下可氧化i 。形成1 2 ，而1 2 遇淀粉显色，此有色物质在4 7 0 n m 处有 特征吸收，吸光度的大小直接反映生成的碘单质的量，进而可推算出生成氢过氧化物 的量，最后推算出脂肪氧合酶的酶活力。本方法运用了分光光度计来测定吸光度，所 以也要考虑反应体系的浊度，此显色反应是在酸性条件下进行的，而酶液中存在的蛋 白质和脂肪酸在酸性条件下会絮凝，若离心，可除去絮凝物质，但同时有色物质也会 有少许沉淀，给测定带来误差。所以，本方法适用于无浊度的精酶液酶活力的测定。 1 3 2 4 氧电极法 在底物浓度一致的情况下，一定的时间内反应体系中氧的浓度与酶活力的大小呈 线性相关，即脂肪氧合酶催化底物反应时消耗氧，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力 的大小成正比。利用氧电极可以精确地测定脂肪氧合酶的活性。此方法无需限制反应 体系的浊度，适用于粗酶液和精酶液的酶活测定。但是此方法对温度的控制及仪器密 闭性的要求较严格，因此限制了此方法的使用1 4 3 卅】。 1 3 3 影响脂肪氧合酶催化反应的因素 酶是生物催化剂，是具有生物催化活性的蛋白质。其显著特点为专一性强，催化 效率高和作用条件温和等，脂肪氧合酶催化油脂氢过氧化反应也具有以上特点。在反 应过程中，影响脂肪氧合酶催化的因素一般包括底物浓度效应，温度效应，p h 效应 岔由 气子o 1 3 3 1 底物浓度 有些酶的催化反应存在底物抑制效应。底物抑制属于反竞争性抑制，表现为 减小，降低。产生底物抑制的原因有很多，其中之一可能是由于底物浓度很高时， 7 江南大学硕士学位论文 两个或两个以上底物分子分别占据了酶分子的部分活性位点，导致他们都无法按正常 方式接受酶的催化作用，从而表现为高底物抑制。蔡琨等f 4 0 】考察了底物浓度对脂肪 氧合酶催化合成氢过氧化亚油酸的影响，证实了其中的底物抑制效应。实验中底物亚 油酸的最佳浓度为4 1 l g l ，相应氢过氧化亚油酸产率为8 0 t 2 ，2 1 1 。 1 3 3 2 温度 温度对酶促反应的影响是比较显著的【2 ，4 ，2 1 1 。反应开始时，温度升高，反应速度 加快；随着温度的不断升高，酶蛋白会因为逐步变性而失去活性，从而反应速度随之 下降。因此，找到酶促反应的最适温度就显得尤为重要。酶的最适温度与实验条件有 关，因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但 温度升高后，酶活性又可恢复。蔡琨等【4 0 】在相同条件下考察了温度对脂肪氧合酶催 化合成氢过氧化亚油酸反应的影响，得出该反应的最适温度为5o c ，此温度下产物得 率最高。 1 3 3 3p h 酶促反应要在合适的p h 下进行，p h 过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶 催化活性最高时溶液的p h 值就称为酶的最适p h 。酶的最适p h 不是酶的特征性常数。 蔡琨等【柏1 配置了一系列不同p h 值的缓冲液，加入到反应体系中，考察p h 值对反应 进程的影响。实验得出p h 9 0 处吸光度最大，在较低或较高p h 条件下，吸光度均有 所下斛2 ，4 ，2 n 。 1 4 氢过氧化油脂的定量分析 氢过氧化油脂中氢过氧基里的氧具有较强的氧化能力，利用这一性质可以检测其 形成的量。常用的测定方法有如下几种【4 】： 1 4 1 碘量法 1 9 6 5 年，h 锄m 改进了碘量法测定油脂中氢过氧化物的含量的方法。该法的原 理是油脂中的氢过氧化物与碘化钾作用产生碘，再用硫代硫酸钠滴定生成的碘，指示 剂为淀粉。这样可以通过测定碘的含量间接求出氢过氧化油脂的含量【4 6 a 7 , 4 8 】。其反应 方程式如下： 一c h 2 一g h c h = c h c h r 一+ k i - 6 0 k 式( 1 4 ) 一c h 2 一c h c h = c h c h 厂+ 1 2 + k 2 0 占h 1 2 + n a 2 s 2 0 3 _ + n a i + n a 2 s 2 0 4 式( 1 5 ) 此方法也有一些缺点，强酸性条件下，硫代硫酸根易分解，且若有氧气存在，易 8 第一章绪论 发生碘离子被氧气氧化成碘单质的反应。给测定结果带来了正误差。另外，在碱性介 质中，一方面，硫代硫酸根会将碘单质还原成碘离子；另一方面碘单质会分解生成碘 离子和碘酸根。这就给测定结果带来了负误差。因此碘量法的精确性还需要改进，也 可以配合其它测定方法综合评价。 1 4 2 硫氰酸铁法 硫氰酸铁法的原理是【4 6 ，4 8 】：氢过氧化物将二价铁离子氧化成三价铁离子，其反应 式为：f e 2 + + 2 w + o - - f e 3 + + h 2 0 ，然后j n ) 硫氰酸铵，f e 3 + 可以与硫氰酸铵形成红色的 硫氰酸铁。接下来通过比色法测定氢过氧化物的含量，该法虽然简便，易于掌握，但 因有氧的存在，常发生明显的干扰。s t i n e t 4 9 l 用非离子表面活性剂破坏乳化改进了硫 氰酸铁法，该法对乳制品中氢过氧化脂肪的测定具有重现性好和灵敏度高等优点。 1 4 3 高效液相色谱法( h p l c _ ) 原节子【5 0 】等人用非选择型对检测器测定氢过氧化脂肪酸，而p 破和m a t s u s h i t a s t 】 用u v 检测器测定氢过氧化植物油，其定量范围在1 0 5 0m e q k g ，但样品中氢过氧化物 含量低时不能充分分离，其检测下限为0 1ue q 。 1 4 4 二甲酚橙指示剂法 二甲酚橙指示剂法也可测定氢过氧化物的含量 4 , 1 6 , 2 1 1 。指示剂组成【5 2 】：1 0 0l u n o l l 的二甲酚橙，2 5 0 眦n o l l 的六水合硫酸亚铁铵，2 5m m o l l 的硫酸及4m m o l l 的2 ，6 叔 丁基- 4 甲基酚( b h t ) 的甲醇水( 9 0 ：1 0 价筋厕溶液。其原理是在氢过氧化物的存在 下，f e 2 + 在酸性条件下迅速被氧化形成f e 3 + ，f e 3 + 与二甲酚橙形成生色团，于5 9 0n n l 处有强吸收。 1 5 立题依据和主要研究内容 1 5 1 立题依据 脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ，e c1 1 3 1 1 1 2 ) 属氧化还原酶，可催化含c 括，c 括1 ，4 一 戊二烯结构的不饱和脂肪酸及脂肪酸酯形成氢过氧化物，生成的氢过氧化物具有高度 的反应能力【1 8 锄】。脂肪氧合酶在动植物界中广泛存在，来源广，易提取，活力高。成 熟的大豆种子中脂肪氧合酶含量很高，约占种子蛋白含量的1 2 ，是大豆中活性 最高的酶。脂肪氧合酶可以从低温脱脂豆粕中提取，成本不高 4 , 1 5 , 1 6 2 1 3 6 , 4 0 】。 氢过氧化油脂的应用前景广阔。它可用于染料、涂料、洗涤剂、聚氯乙烯增塑剂 的工业化生产。增塑剂绝大部分以石油为原料来制备，若利用脂肪氧合酶对脂肪酸或 脂肪酸酯进行选择性催化，形成特定的氢过氧化脂肪酸及其酯的衍生物，再将之环氧 化，生成环氧化油，则可以减小石油用量；氢过氧化油脂经还原得到羟基油脂，经过 氧化物酶裂解得到不饱和醛酸及醛，再进一步反应可以得到二元酸，这些物质在食品、 化工、生物技术等领域都有重要用趔4 ，1 5 , 1 6 , 2 1 , 3 6 , 4 0 , 5 3 - 5 5 。 9 江南大学硕士学位论文 目前国内主要是利用脂肪氧合酶催化脂肪酸合成氢过氧化脂肪酸，而未见脂肪氧 合酶直接催化油脂合成氢过氧化油脂的报道。另一方面，目前大多数研究都是从脱脂 豆粉中提取酶液来催化合成氢过氧化物【1 1 , 5 6 1 ，但是提取纯化等工序会降低酶活【5 7 】，同 时增加了酶的成本，使其作为催化剂工业化生产氢过氧化油脂存在较大的困难。为了 降低酶法催化剂成本，我们使用脱脂豆粉直接催化反应，免去了上述提酶工序。国外 关于采用脱脂豆粉直接催化合成氢过氧化油脂的研究并不多【5 8 】。 目前国内对氢过氧化脂肪酸的研究主要集中在利用其产生醛类等风味物质方面， 而不多见利用氢过氧化油脂产生羟基油脂及风味物质的报道，医学上可接受的含羟基 的油脂可添加于食品，药物，化妆品中，具有很好的减肥效果【3 1 。因此研究脂肪氧合 酶催化合成氢过氧化油脂及还原氢过氧化油脂制备羟基油脂具有重要的现实意义。 1 5 2 本文主要研究内容 基于上述目标，本论文拟在以下几个方面展开研究： 1 、脂肪氧合酶精酶催化合成氢过氧化玉米胚芽油的研究 2 、脱脂豆粉催化合成氢过氧化玉米胚芽油及氢过氧化大豆油的研究 3 、氢过氧化大豆油还原制备羟基大豆油的研究 1 0 第二章大豆脂肪氧合酶精酶催化合成氢过氧化玉米胚芽油 第二章大豆脂肪氧合酶精酶催化合成氢过氧化玉米胚芽油 2 1 引言 油脂价廉、来源广泛，以油脂为原料采用酶法制备相关化合物的工艺路线具有无 三废、经济可行、产品绿色天然、高附加值的优点。 酶催化氧化油脂是由脂肪氧合酶参加的氧化反应【4 1 。脂肪氧合酶能催化含c 旭 c 捃1 ，4 戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯，形成氢过氧化衍生物。目前关于酶 促合成氢过氧化亚油酸的研究比较成熟，而对以油脂作为底物的研究甚少。玉米胚芽 油中亚油酸含量较高，因此，本章选用玉米胚芽油作为该酶促反应的底物。 本章考察了溶剂种类、溶剂量、温度、底物浓度、反应时间等因素对该酶促反应 的影响，并对氢过氧化玉米胚芽油的稳定性及脂肪氧合酶在几种p h 值下的稳定性进 行了研究。 2 2 主要试剂与仪器 2 2 1 试验试剂 玉米胚芽油( 当地超市购买) ；硼酸( a r ，中国上海云岭化工厂) ；硼砂( a r ，无 锡市民丰试剂厂) ；乙酸、无水乙酸钠、无水乙醇、乙醚、硫酸铵、9 5 乙醇、浓硫 酸、氯化钠、甲醇、石油醚( 6 0 9 0o c ) 、三氟化硼、酚酞、氢氧化钠、正己烷( a r ，国 药集团化学试剂有限公司) ；邻苯二甲酸氢钾( 基准试剂，国药集团化学试剂有限公司) ； 吐温2 0 ( c p ，国药集团化学试剂有限公司) ；氢氧化钾( a r ，无锡东湖塘化学试剂厂) ； 亚油酸( 生化试剂，9 8 ) ；盐酸( a r ，宜兴市洋溪镇徐滨化工厂) ；n ，n 二甲基甲酰胺 ( d m f ) ( a r ，宜兴市化学试剂厂) ；二甲酚橙( a r ，上海试剂三厂) ；六水合硫酸亚铁铵 ( a r ，上海试四赫维化工有限公司) ；过氧化氢异丙苯( 8 0 ，s i g m a ) ；2 , 6 叔丁基- 4 甲基酚( b h t ) ( a r ，上海试剂站) ；大豆脂肪氧合酶( 实验室自制) 。 2 2 2 实验设备与仪器 s h i m a d z ug c - 2 0 1 0 气相色谱仪检测器；多功能食品粉碎机( s q 2 1 3 0 d ，上海帅佳 电子科技有限公司) ；恒温磁力搅拌器( 8