新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用硕士论文.pdf

山东农业大学 硕士学位论文 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 姓名 王兆升 申请学位级别 硕士 专业 农产品加工及贮藏工程 指导教师 董海洲 20050520 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文 是在导师指导下 独立进行科学研 究所取得的成果 对在论文研究期间给予指导 帮助和做出重要 贡献的个人或集体 均在文中明确说明 本声明的法律责任由本 人承担 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定 同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可 以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 日期 翻嘏p 舒 i 本文所用缩写说明 英文 c e n t i m e t e r d e x t r o s ee q u i v a l e n tv a l u e d e g r e eo fp e l y m e r i z a t i o n d e g r e eo ff r e e d o m g r a m h o u r 1 i t r e m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m i l l i m e t e r m p a ns q u a r e n n n o m e z e r d o w e ro fh y d r o g e n r a n g e s u mo fs q u a r e j n i t 中文说明 厘米 葡萄糖值 聚合度 自由度 兄 小时 丌 毫克 分钟 毫升 毫米 均方 纳米 酸碱度 极差 平方和 单位 缩 l三j叶抒o o鸣 以m船 州o 山东农业大学硕士学位论文 摘要 在玉米淀粉制备结晶葡萄糖的过程中 液化 糖化工艺是影响葡萄 糖的转化率 葡萄糖质量以及生产周期的关键环节 其中 淀粉酶的应 用对液化 糖化工艺起着决定性作用 本研究立足国内丰富的玉米淀粉 资源 以提高葡萄糖转化率 改善糖液的过滤性 缩短生产周期为目标 采用双酶法加工技术 以新型耐高温a 一淀粉酶为液化酶 曲霉葡萄糖 淀粉酶和新型普鲁兰酶为糖化酶 研究了影响玉米淀粉液化 糖化的因 素 同时优化了玉米淀粉液化 糖化的工艺参数 主要研究结果如下 利用新型耐高温n 一淀粉酶可以缩短液化时间 改善液化液中蛋白 质等杂质的凝聚性 提高液化液的质量 葡萄糖淀粉酶和新型普鲁兰酶协同作用进行糖化 可以缩短糖化时 间 提高葡萄糖转化率 以新型耐高温a 一淀粉酶为液化酶 葡萄糖淀粉酶为糖化酶 用玉 米淀粉制备结晶葡萄糖过程中 液化d e 值控制在1 5 2 0 时 葡萄糖 最终转化率最高 低于1 5 或者高于2 0 最终糖化d e 值都会下降 通过液化单因素试验 确定出影响液化的各因素最佳取值范围为 粉浆浓度在2 0 3 0 之间 液化时间6 0 分钟左右 耐高温d 一淀粉酶用 量3 2u g 自左右 液化温度在9 1 以上 液化p h 值在5 6 6 2 之间 以影响液化各因素最佳取值范围为依据 利用正交试验确定出液化 最佳工艺参数为 温度9 7 c p h 6 0 粉浆浓度2 5 n 液化时间6 0 分钟 耐高温d 一淀粉酶用量2 4 u g 验证试验证明 利用优化参数进行液 化 最终液化d e 值达到1 8 0 0 透光率3 0 o 液化液中蛋白质等杂 质凝聚良好 通过糖化单因素试验 确定出影响糖化的各因素最佳取值范围 结 论如下 糖化温度在6 0 左右 糖化p h 值在4 0 4 5 之间 糖化时间 在3 6 6 0 小时之间 葡萄糖淀粉酶用量在3 0 0 u g 左右 普鲁兰酶用 量0 1 0 a s p u g 糟左右 以影响糖化各因素最佳取值范围为依据 利用正交试验确定出糖化 最佳工艺参数为 糖化温度6 0 c p h 值4 5 糖化时间4 8 小时 葡萄糖 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 淀粉酶用量2 5 0 u g 粉 普鲁兰酶用量0 1 0a s p u g 粉 验证试验证明 利用优化参数进行糖化 最终糖化d e 值达到9 8 8 0 从而进一步提高 了葡萄糖转化率 为玉米淀粉制备结晶葡萄糖生产提供了新的理论依据 关键词 玉米淀粉 结晶葡萄糖 液化 糖化 淀粉酶 2 山东农业大学硕士学位论文 a p p l i c a t i o no f n o v e l a m y l a s e s i nt h ep r o c e s s i n go f c r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o r l ls t a r c h a b s t r a c t t h et e c h n o l o g i e so f l i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i e a t i o na r et h ek e yf a c t o r s w h i c hd e t e r m i n et h ed ev a l u e t h eq u a l i t yo fg l u c o s ea n dt h ep r o d u c t i o n p e r i o d i nt h ep r o c e s s i n go fc r y s t a l l i n ed e x t r o s ef r o mc o r ns t a r c h a n dt h e a p p l i c a t i o no fa m y l a s ep e r f o r m sad e c i s i v ef u n c t i o n i no r d e r t om a k ea g o o d u s eo ft h ea b u n d a n td o m e s t i cr e s o u r c eo fc o r ns t a r c h e n h a n c et h e g l u c o s e c o n v e r s i o nr a t ea n di m p r o v et h ef i l t e r a b i l i t yo fg l u c o s es o l u t i o n a f f e c t i n g f a c t o r so fc o r ns t a r c hl i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i c a t i o nw e r es t u d i e di nt h i s p a p e rw i t ht h el i q u e f y i n ge n z y m e o fn o v e lt h e r m o s t a b l e o a m y l a s ea n dw i t h t h e s a c c h a r i f y i n ge n z y m e o f g l u c o a m y l a s e a n dn o v e l p u l l u l a n a s eb y d u a l e n z y m em e t h o d a tt h es a m et i m e t h et e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so fc o m s t a r c hl i q u e f a c t i o na n ds a c c h a r i f i c a t i o nw e r ea l s oo p t i m i z e d t h em a i nr e s u l t sf i r ea sf o l l o w s t h el i q u e f a c t i o n p e r i o d w a ss h o r t e n e da n dt h e q u a l i t y o fl i q u e f y l u g s o l u t i o na sw e l la st h ec o h e r e n c yo fi m p u r i t i e ss u c ha sp r o t e i ni nl i q u e f y i n g s o l u t i o nb o t hc o u l db ei m p r o v e dw i t ht h ea i do ft h en o v e lt h e r m o s t a b l e d a m y l a s e s a c c h a r i f y i n g w i t ht h e c o o p e r a t i o n o f g l u c o a m y l a s e a n dn o v e l p u l l u l a n a s e s a c c h a r i f i c a t i o np e r i o d c o u l db es h o r t e n e da n d g l u c o s e c o n v e r s i o nr a t ew a sa l s oe 1 1 l a n c e d d u et ot h en o v e ll i q u e f y i n ge n z y m e t h et h e r m o s t a b l e 1 2 一a m y l a s ea n d w i t ht h eh e l po ft h es a c c h a r i f y i n ge n z y m e g l u c o a m y l a s ea n d p u l l u l a n a s e t h e f i n a lc o n v e r s i o nr a t eo fg l u c o s er e a c h e dt h et o pw h e nt h el i q u e f a c t i o nd e v a l u ew a sc o n t r o l l e db e t w e e n15 a n d2 0 i nt h ep r o c e s s i n go fc r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o r ns t a r c h a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo f g l u c o s ed e c l i n e dw h e n t h ed ev a l u ew a sl o w e rt h a n15 o rh i g h e rt h a n2 0 t h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r s a f f e c t i n gl i q u e f a c t i o n w e r e o b t a i n e da sf o l l o w sb ys i n g l ef a c t o rt e s t c o r ns t a r c hc o n c e n t r a t i o n2 0 3 0 l i q u e f a c t i o np e r i o d6 0m i n u t e so rs o d o s a g eo f t h e r m o s t a b l e a a m y l a s e a b o u t3 2u gs t a r c h t e m p e r a t u r ea b o v e 9 1 p h v a l u e5 6 6 2 3 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 a c c o r d i n g t ot h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao f a l lf a c t o r sa f f e c t i n gl i q u e f a c t i o n t h e o p t i m a tp a r a m e t e r so fl i q u e f a c t i o n w e r eo b t a i n e db o r t h o g o n a lt e s t t e m p e r a t u r e9 7 c p h6 0 c o r ns t a r c hc o n c e n t r a t i o n2 5 l i q u e f a c t i o np e r i o d 6 0m i n u t e s d o s a g eo ft h e r m o s t a b l e a a m y l a s e2 4 u gs t a r c h t h e p r o v i n gt e s tg r o u n d e d o nt h e s eo p t i m a l p a r a m e t e r ss h o w e dt h a t t h ef i n a l l i q u e f a c t i o nd e v a l u er e a c h e d1 8 0 0 a n dt h a tt h et r a n s m i t t a n c ea c h i e v e d 3 0 o m e a n w h i l e t h ei m p u r i t i e ss u c ha sp r o t e i ni nl i q u e f a c t i o ns o l u t i o nw e r e c o h e r e dw e l ld u r i n gt h el i q u e f a c t i o np r o c e s s t h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r sa f f e c t i n gs a c c h a r i f i c a t i o nw a g o b t a i n e d b ys i n g l e f a c t o rt e s ta s f o l l o w s t e m p e r a t u r e a b o u t 6 0 s a c c h a r i f i c a t i o n p hv a l u e4 0 4 5 s a c c h a r i f i c a t i o np e r i o d 3 6 6 0 h o u r s d o s a g eo fg l u c o a m y l a s ea b o u t3 0 0 u 幢s t a r c h d o s a g eo fp u l l u l a n a s ea b o u t 0 10 a s p u g s t a r c h t h e o p t i m a lp a r a m e t e r s o fs a c c h a r i f i c a t i o nw a sa l s o a c q u i r e db y o r t h o g o n a lt e s t s e c u n d u mt h eo p t i m a ln u m e r i ca r e ao fa l lf a c t o r s a f f e c t i n g s a c c h a r i f i c a t i o n t e m p e r a t u r e6 0 c p h4 5 s a c c h a r i f i c a f i o np e r i o d4 8h o u r s d o s a g eo fg l u c o a m y l a s e2 5 0u gs t a r c h d o s a g eo fp u l l u l a n a s e0 10 a s p u 乜s t a r c h t h ep r o v i n gt e s tb a s e do nt h e s eo p t i m a lp a r a m e t e r sr e v e a l e dt h a t t h ef i n a ls a c c h a r i f i c a t i o nd ev a l u er e a c h e d9 8 8 0 t h u sg l u c o s ec o n v e r s i o n r a t ew a se n h a n c e dg r e a t l y a n dt h i sn e wt e c h n o l o g yo fl i q u e f a c t i o na n d s a c c h a r i f i c a t i o nd e s t i n e dt oc o n t r i b u t eal o tt ot h ep r o d u c t i o no fc r y s t a l l i n e d e x t r o s ef r o mc o i ns t a r c h k e y w o r d s c o i t i s t a r c h c r y s t a l l i n ed e x t r o s e l i q u e f a c t i o n s a c c h a r i f i c a t i o n a m y l a s e 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 葡萄糖是自然界分布最广 也是最重要的单糖 葡萄糖的用途很广 泛 特别是结晶葡萄糖 现在广泛应用在食品 医药 化学等工业 在 食品上用在罐头 面包 糕点 果酱 果冻 低热量啤酒等生产中 医 药上用来生产口服葡萄糖 注射葡萄糖液 作为基质可以生产多类抗菌 素及维生素 也可转化生产氨基酸 化工上用来生产葡萄糖酸 葡萄糖 醇 甘油 山梨酸 柠檬酸 苹果酸等有机酸及其衍生物 罗明朗 1 9 9 5 众所周知 葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一 同时也是玉米的 重要深加工产品 尤其在美国 以玉米为原料生产的淀粉糖己全面代替 了蔗糖 广泛进入了工业加工及家庭食用等各个领域 刘炎 2 0 0 4 石桂 春 2 0 0 1 我国有着非常丰富的玉米资源 1 9 9 9 年己达1 2 亿吨 占世界第二 位 同时 由于玉米易于运输和贮藏 可供周年生产 不受季节限制 淀粉含量高 制作较简便 主产品质量好 副产品种类多 利用价值高 所以玉米已逐渐成了我国制造淀粉的主要原料 玉米淀粉已占我国淀粉 总产量的9 0 左右 因此 也就成了制造葡萄糖的理想选择 孙义 章 2 0 0 1 据中国淀粉工业协会统计数字显示 2 0 0 0 年全国的结晶葡萄糖的需 求量为8 万吨 2 0 0 1 年为9 万吨 增长了1 2 5 2 0 0 2 年以后年需求仍 以1 5 的速度递增 而2 0 0 0 年生产量仅为5 4 7 万吨 2 0 0 1 年生产量为 5 7 6 万吨 增长了5 3 2 0 0 2 年以后生产量基本稳定 可见 结晶葡萄 糖的生产增长速度远远跟不上市场的需求增长速度 生产规模还不能满 足市场需要 因此 进行玉米淀粉制各结晶葡萄糖的深入研究 提高葡 萄糖的转化率 缩短生产周期 从而提高生产能力 对于促进农业经济 发展 具有重要意义 1 1 玉米淀粉的结构及加工性质 1 1 1 淀粉的分子结构 淀粉分子是以白色固体淀粉粒的形式存在 淀粉粒是淀粉分子的聚合 体 它由直链淀粉 支链淀粉和中间型多糖构成 直链淀粉是脱水葡萄 糖单位间经过n 一1 4 糖苷键连接的d 一葡萄糖的多聚体 其分子量在5 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 2 0 万之间 相当于2 0 0 1 2 0 0 个葡萄糖分子聚合而成 支链淀粉是以a l 4 糖苷键连接为主 同时还有2 4 通过a 一1 6 糖苷键连接而成的 d 一葡萄糖的聚合体 其中 a 一1 4 糖苷键连成的链作主链 在主链上通 过n l 6 糖苷键形成众多的侧链 支链淀粉的分子量在2 0 6 0 万之间 相当于1 3 0 0 3 6 0 0 0 个葡萄糖聚合而成 t a k e d a ya n dh i z u k u r is 1 9 8 6 t a k e d aa n ds h i r a s a k ak 1 9 8 4 淀粉颗粒中除了直链淀粉和支链淀粉 外 还存在着中间型多糖 r u t e n b u r g 1 9 8 4 这种中间型多糖分支高 分子量小 其含量的多少对淀粉糊化后粘度的变化有较大的影响 直链 淀粉和支链淀粉的分子结构如图1 和图2 所示 o 图1 直链淀粉分子结构 c h o h 姆 ho h 图2 支链淀粉分子结构 f i 9 2 m o l e c u l es t r u c t u r eo fa m y l o p e c t i n 6 山东农业大学硕士学位论文 1 1 2 淀粉的糊化 将淀粉倒入冷水中 因淀粉不溶于冷水 只能混于水中 经搅拌会成 为乳白色的不透明悬浮液 称为淀粉乳 停止搅拌 则淀粉颗粒慢慢下 沉 经一定时间后 淀粉沉淀于下部 上部为水 将淀粉乳加热 淀粉 颗粒无定形区域吸水膨胀 而结晶束区域具有弹性 仍保持颗粒结构 随温度上升 淀粉吸收水分更多 体积膨胀更大 达到一定温度后偏光 十字消失 温度继续上升 淀粉粒继续膨胀 可达原体积的几十倍甚至 数百倍 高度膨胀的淀粉粒间互相接触 变成半透明粘稠状液体 虽停 止搅拌 也不会发生沉淀 称为淀粉糊 这种由淀粉乳转变成糊的现象 称为淀粉的糊化 淀粉糊并不是真正溶液 而是由膨胀淀粉粒的碎片 水合淀粉块和溶解的淀粉分子组成的胶状分散物 张力田 1 9 9 9 淀粉发生糊化现象的温度称为糊化温度 又称胶化温度 即使同一品 种的淀粉 颗粒大小不同 糊化难易程度也不相同 淀粉中大的颗粒容 易在较低的温度下先行糊化 称糊化开始温度 待所有淀粉颗粒全部被 糊化 所需的温度称糊化完成温度 两者相差约1 0 糊化温度不是指 某一个确定的温度 而是指从糊化开始温度到糊化完成温度的一定范围 普通玉米淀粉的糊化温度在6 2 7 2 高嘉安 2 0 0 1 淀粉的糊化受很多因素的影响 含直链淀粉较高的淀粉粒相对糊化 要难些 许多溶剂如液态氨 甲醛 甲酸 氯乙酸 二甲基亚砜 盐酸 等 由于它们能破坏淀粉颗粒中分子间的氢键或与淀粉形成可溶性配合 物 从而促进淀粉发生糊化 某些化学试剂如碱 o o s t e n 1 9 8 4 盐 e v e n s 1 9 8 2 醇 h i z u k u r i 1 9 7 8 o o s t e n 1 9 8 0 等也能降低或提高淀 粉糊化作用的温度以及影响糊化进行的程度 糊化温度随糖浓度的增加 而增高 1 1 3 淀粉的回生 淀粉糊放置一定时间后会逐渐变浑浊 最终可产生不溶性的白色沉 淀 而将浓的淀粉分散液冷却 可迅速形成有弹性的胶体 这种现象称 为淀粉的回生 也叫淀粉的老化或凝沉 因此 回生是指淀粉基质从溶 解 分散成无定型游离状态返回至不溶解 聚集或结晶状态的现象 凝 沉淀粉为结晶结构 不溶于水 具有b 一型x 光衍射图样 淀粉糊或淀粉 新型淀粉酶在玉米淀糟制备结晶葡萄糖中的应用 溶液的回生具有下列效应 强度增加 呈现不透明和浑浊 在热糊表面 形成不溶解的结膜 不溶性的淀粉粒沉淀 形成胶体 脱水收缩 淀粉回生的本质是糊化的淀粉分子在温度降低时 由于分子运动缓 慢 直链淀粉分子和支链淀粉分子的分支都回头趋向于平行排列 相互 靠拢 彼此以氢键结合 重新组成混合微晶束 其结构与原来的生淀粉 粒的结构很相似 但不呈放射状 而是零乱地组合 j e o n g o kk i m 1 9 9 7 由于所得的淀粉糊中氢键较多 分子间缔合很牢固 水溶解性下降 如 果淀粉糊的冷却速度很快 特别是较高浓度的淀粉糊 直链淀粉分子来 不及重新排列结成束状结构 便形成凝胶体 淀粉糊中直链淀粉回生机 带j f 见图3 飞 j 符 i 踅 图3 直链淀粉回生示意图 通常回生在淀粉糊冷却过程以及在7 0 或7 0 c 以下贮存时发生 然而 还有另外一种形式的回生存在 它是在7 5 9 5 c 贮存淀粉溶液时发生的 并形成均匀的颗粒状沉淀 称为高温回生现象 玉米淀粉经1 2 0 1 6 0 c 糊化 得到的淀粉糊在7 5 9 5 贮存时 就发生回生 形成沉淀颗粒 山东农业大学硕士学位论文 g i d l e ymj 1 9 9 5 沉淀颗粒是由玉米直链淀粉同游离脂肪酸结合成络 合物而形成的 普通玉米淀粉在9 5 c 以上贮存时没有高温回生现象发生 说明直链淀粉同脂肪酸结合形成的络合物在此温度下被解离 淀粉的回生速率是以淀粉糊从9 5 c 冷却至5 0 c 后强度的增加来表 示 高嘉安等研究证明 玉米淀粉糊回生相当快 其原因主要是直链淀 粉含量高 2 8 d p 小 2 0 0 1 2 0 0 之间 和类脂体含量高 0 8 玉米 淀粉回生的速度与淀粉粉浆的浓度以及p h 值等因素有关 粉浆浓度3 0 6 0 p h 值5 7 之间回生速度最快 高嘉安 2 0 0 1 在玉米淀粉制备 葡萄糖的过程中 回生淀粉不能被酶水解 从而影响葡萄糖的产率和质 量 李志达 1 9 9 4 马德 2 0 0 4 1 1 4 淀粉的水解 淀粉与水一起加热即可引起分子裂解 当与无机酸一起加热时 可 彻底水解成葡萄糖 水解过程是分几个阶段进行的 同时有各种中间产 物相应形成 淀粉 可溶性淀粉 卜糊精 卜麦芽糖 卜葡萄糖 淀粉酶在一定条件下也会使淀粉水解 根据淀粉酶的种类 一淀粉 酶 b 一淀粉酶 葡萄糖淀粉酶及异淀粉酶 不同 可将淀粉水解成葡萄 糖 麦芽糖 三糖 果葡糖浆 糊精等成分 1 2 玉米淀粉制备葡萄糖的方法 淀粉水解产品是淀粉应用的一个主要方向 其中尤以甜昧剂为主 通常把利用淀粉为原料生产的糖品统称淀粉糖 葡萄糖是重要的淀粉糖 在制备葡萄糖时 首先要通过酸或酶把淀粉水解 然后利用水解所获得 的糖浆 通过不同途径转化成相应的精制品 淀粉水解的基本方法有三 种 酸解法 酸酶结合法 双酶法 林勇 1 9 8 6 1 2 1 酸解法 酸法水解淀粉最早始于西方 1 8 11 年化学家k i r c h o f f 柯尔乔夫 在添加硫酸于马铃薯淀粉乳以制胶粘剂时 错误地多加了酸 得到了具 有甜味的糖浆 这是淀粉制糖的开始 张力田 1 9 9 7 此后 淀粉水解 制糖发展缓慢 直至2 0 世纪2 0 年代初 美国开始较大规模地用酸法技 术制取葡萄糖和果糖糖浆等 酸法水解淀粉才开始快速发展 国内最传 9 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 统的玉米淀粉制备葡萄糖的方法也是酸解法 但这种传统酸法水解工艺 存在很多缺点 需要耐酸耐压设备 需要精制淀粉为原料 淀粉投料的 质量分数较低 仅为2 0 左右 水解后必须中和 色泽深 精制费用大 淀粉转化为葡萄糖的收率低 不超过9 0 刘佐才 2 0 0 1 水解过程中 由于葡萄糖的逆聚合反应而生成较多带苦味的低聚糖 葡萄糖必须用结 晶法精制才能将苦味去除 久贮后还因生成氧化甲基糖醛而转变成褐色 等 因此 这种传统工艺逐渐被新兴的酶法技术替代 1 2 2 双酶法 酶法制糖始于我国 我国饴糖的制造已有2 0 0 0 多年的历史 古籍早 有记载 饴 米蘖煮也 说文 就是说饴糖是米饭与谷芽共同煮 熬而成 古人不知道什么是酶 酶的概念的提出以及将酶提取出来使用 是1 9 世纪才开始的 1 8 3 3 年p a y e r 等人从麦芽提取液中加酒精沉淀获得 淀粉酶 可使2 0 0 0 倍的淀粉分解 不久淀粉酶被用于棉布退浆 u h l i g 1 9 8 8 1 8 9 2 年c a l m e t t e 从我国的药酒中分离出纯种根酶糖化 酶 用于酒精发酵 m a y e r 1 9 5 9 1 8 9 6 年 本高峰让吉首先用米曲霉固 体培养法生产 他卡 淀粉酶 作为消化荆 f u k u m o t o 1 9 1 5 1 9 1 7 年法 国人b o i d i n 与e f f r o n t 等又先后发现枯草杆菌可以分泌耐热且活性更强 的a 淀粉酶 w e l l kne 1 9 6 3 g o d f r e y 1 9 8 3 并于1 9 2 6 年在德国设 厂生产 m a y e r 1 9 5 9 为微生物酶的工业化生产奠定了基础 直至1 9 4 9 年日本开始采用深层培养法生产细菌 一淀粉酶 w e l l kne 1 9 6 3 后 微 生物酶制剂的生产才进入大规模工业化的阶段 随着酶工业技术的进步 1 9 5 5 年德氏根酶与黑曲霉糖化酶首先被做成结晶 p a z u rjh 1 9 7 1 1 9 5 9 年酶法生产葡萄糖获得成功 g o d f r e y 1 9 8 3 大约1 9 6 0 年 日本开始用 n 一淀粉酶液化和葡萄糖淀粉酶糖化的双酶法生产结晶葡萄糖 m a y e r 1 9 5 9 这不仅是葡萄糖工业的重大革新 也是葡萄糖生产史上的 第一次大飞跃 与传统酸法水解淀粉相比 酶法具有独特的优点 刘佐才 2 0 0 1 可 在常温常压和温和酸度下 高效地进行催化反应 简化了设备 改善了 劳动条件和降低了成本 酶催化所需的活化能极低 催化效率远比无机 酸高 a 一淀粉酶与糖化酶共同作用于淀粉 得到的葡萄糖液d e 值可以 山东农业大学硕士学位论文 达到9 8 酶水解具有专一性 制得产品的纯度高 s l o m i n s k a 1 9 8 6 酶本身是蛋白质 无毒 对酸碱度极为敏感 故可简单地采用调节酸碱 度 改变反应温度或添加抑制剂等方法来控制反应的进行 酶的来源广 泛 许多动植物和微生物都可作为某些酶的原料 酶可以回收 重复利 用 冼雪芬 1 9 9 9 1 2 3 酸酶结合法 约在1 9 4 0 年美国开始采用酸酶合并糖化工艺生产高甜度糖浆 传统 的酸酶法是先采用加酸至p h l 5 左右加压糖化 此后接着用酶转化 陈 三宝等曾经研究利用酸酶法水解玉米粉制备葡萄糖 陈三宝 1 9 9 8 虽然 利用酸水解有效率高 速度快 时间短 过滤容易的优点 但酸水解选 择性差 杂质分解多 颜色深 精制费用高 另外 由于葡萄糖的复合反应和分解反应 加上转苷酶的作用 糖化 过程中会产生潘糖等杂糖 这些杂糖总含量在酸酶法工艺中约为7 8 酸法工艺约为1 2 1 5 双酶法工艺约为3 4 高嘉安 2 0 0 1 这 些杂糖的去除 主要是通过葡萄糖结晶时析出 而后从母液分离中排掉 杂糖的存在会严重影响结晶速度和葡萄糖收率 根据以上几点 现在玉米淀粉制备结晶葡萄糖生产中大多使用双酶 法 1 3 淀粉酶的应用 与玉米淀粉制备结晶葡萄糖有关的淀粉酶主要包括a 一淀粉酶 葡萄 糖淀粉酶 普鲁兰酶等 u h l i g 1 9 8 8 虽然也出现了一些新型复合酶制 剂 但其在玉米淀粉制备结晶葡萄糖的生产中并不理想 王怀贵 2 0 0 1 1 3 1q 一淀粉酶 q 一淀粉酶水解淀粉是从分子内部进行的 水解中间地位的a 1 4 键 先后次序没有一定规律 是杂乱的 因此 归类于内切水解酶 简 称内酶 糖苷键水解过程中 相邻葡萄糖单位间的c l o 口键断裂 加 上一个水分子 断裂处发生在c 一o 键上 由于水解时 作用于长链比短 链更有活性 所以最初阶段水解速度很快 r a m e s hm v 1 9 9 0 把庞大的 淀粉分子迅速断裂成小分子 此时淀粉浆的粘度也随之急剧降低 失去 粘性 称为液化 液化作用的主要产物是糊精 随水解继续进行 糊精 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 由大逐渐变小 淀粉遇碘的颜色反应也由开始的蓝色逐渐转变为紫 红 棕色 当小到一定程度时 遇碘不再变色 称为消色点 除遇碘显色的 变化外 还原性也会随分子变小而升高 在快速水解阶段完成之后 酶 对小分子的水解活性明显降低 进入一个缓慢水解过程 不同来源的n 一淀粉酶其性质有很大差别 a 一淀粉酶主要来源于真 菌 细菌及霉菌 周恒刚 1 9 9 6 在国内 生产上普遍使用的a 一淀粉 酶是由枯草杆菌生产的中温n 淀粉酶 其作用温度范围一般在6 5 8 0 耐高温a 一淀粉酶是近几年在我国市场出现的新型酶制剂 其温度适 用范围为6 0 1 i 0 c 林剑 2 0 0 3 刘仲敏 1 9 9 9 它是通过固体发 酵或者液体深层发酵由地衣芽孢杆菌生产的 r a m e s hm v 1 9 9 0 因其 具有相当的酶活力和较好的热稳定性 可以将淀粉的a 一1 4 葡萄糖苷 键任意切割成短链糊精 m a r c h a llm 1 9 9 9 诺维信有限公司生产的 诺维信 耐温淀粉酶s u p r a 是最新一代液体耐高温a 一淀粉酶 除了具有 很好的耐温性及相当的酶活力 还可在完全无钙及p h 5 5 下稳定运行 基于以上优点 本研究拟采用该新型淀粉酶作为液化酶 图4 a 一淀粉酶水解直链淀粉和支链淀粉示意图 f i 9 4 a a m y l a s eh y d r o l y z e sa m y l o s ea n da m y l o p e c t i n 山东农业大学硕士学位论文 1 3 2 葡萄糖淀粉酶 葡萄糖淀粉酶是一种外切酶 水解淀粉或短链糊精时 是从非还原 末端的a 一1 4 键开始 使 个葡萄糖单位分离 产生的葡萄糖为b 一构 型 水解产物只有葡萄糖 没有其它种糖生成 水解过程中葡萄糖单位 之间的c 一o c 中的c 一0 键断裂 与n 一淀粉酶一样 也是作用于长链 比短链活性大 j e n n y l y n da j a m e s 1 9 9 6 虽然葡萄糖淀粉酶能优先水解a 一1 4 键 但对d 一1 3 和a 一1 6 键也有一定活性 只是水解速度很慢 仅及水解a 一1 4 键的6 6 和3 6 葡萄糖淀粉酶水解淀粉分子和较大分子的低聚糖属单链式 即水解 一个分子完成后 再水解另一个分子 但水解较小分子的低聚糖属多链 式 即水解一个分子几次后 脱离再水解另一个分子 影响葡萄糖淀粉酶作用的主要因素是p h 和温度 不同来源的葡萄糖 淀粉酶在适用温度和p h 上有一定差异 曲霉为5 5 6 0 c p h 3 5 5 0 m i b r a h i mr a j o k a 2 0 0 5 根霉为5 0 5 5 p h 4 5 5 5 拟内抱霉为 5 0 c p h 4 8 5 0 糖化时间一般为几十小时 糖化过程中5 5 温度下 长时间水解 易感染杂菌 糖化在6 0 c 进行 可以避免杂菌生长 低p h 下糖化 有色物质生成少 颜色浅 易于脱色 基于以上分析 生产上 主要使用来源于曲霉的耐温耐酸型的葡萄糖淀粉酶 e h a bs e r o u r 2 0 0 2 1 3 3 普鲁兰酶 普鲁兰酶是支链淀酚酶 它能水解支叉结构的n i 6 键 还能水解 线性直链分子中的a l 6 键 但这种酶不能水解潘糖 异麦芽糖以及只 含n 一1 6 键的多糖 说明它切开的 一1 6 键的两头至少要有两个以上的 一l 4 键 g w o j e n ns h e n 1 9 9 0 工业上使用的支链淀粉酶主要由微 生物制取 n o v o 公司生产的支链淀粉酶商品名为p r o m o z y m e 是由酸性 解普鲁兰芽孢杆菌所生产 酶最适p h 5 0 最适温度6 0 c 耐酸 耐热 稳定性好 陆健 1 9 9 8 无锡杰能科生物科技有限公司生产的新型 o p t i m a xl 3 0 0 普鲁兰酶适用范围为温度5 5 6 5 p h 值4 o 4 5 这 一参数与来源于曲霉的葡萄糖淀粉酶很匹配 因此 该新型普鲁兰酶也 是本研究拟采用的新型淀粉酶 1 4 双酶法液化 糖化工艺中尚存在的问题 新型淀粉酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 在玉米淀粉制备结晶葡萄糖的过程中 液化 糖化工艺是决定葡萄 糖的转化率 葡萄糖质量以及生产周期的关键环节 目前生产中还存在 一些尚待解决的技术问题 一是葡萄糖转化率不高 一般的酶法生产葡萄糖转化率只有9 5 左 右 导致葡萄糖转化率不高的原因主要有两个 其一是液化过程中淀粉 的高温回生 高温回生是指淀粉在7 5 9 5 的高温下发生的回生现象 普通玉米淀粉在9 5 以上时则不会有高温回生现象 而玉米淀粉液化过 程中普遍使用的中温a 一淀粉酶作用温度一般在9 0 以下 这样高温回 生现象也就不可避免 由于回生以后的淀粉不能被淀粉酶水解 马德 2 0 0 4 从而造成葡萄糖转化率偏低 导致葡萄糖转化率不高的第二个原 因是葡萄糖淀粉酶的水解局限性 葡萄糖淀粉酶对a 一1 4 糖苷键分解 很快 对n 1 6 糖苷键却分解很慢 j e n n y l y n da j a m e s 1 9 9 6 在 玉米淀粉中具有n i 6 糖苷键的支链淀粉含量在7 0 以上 这就造成 了玉米淀粉在糖化过程中转化率降低 二是液化 糖化的生产周期较长 制约了葡萄糖的生产能力 在玉 米淀粉制各结晶葡萄糖生产中 一般液化时间需要几个小时 糖化时间 则需要7 0 8 0 小时 孙义章 2 0 0 1 这主要是由淀粉酶水解特性决定 的 a 一淀粉酶只能水解a 一1 4 糖苷键 因此 玉米淀粉分子中1 7 1 1 6 糖菅键的存在就降低了其水解速度 同时 a 一淀粉酶对长链淀粉比短 链淀粉分解快 r a m e s hm v 1 9 9 0 随着水解的进行 短链淀粉增加 a 一淀粉酶水解速度也必然会受到影响 葡萄糖淀粉酶虽然能水解a l 6 糖苷键 但水解速度很慢 葡萄糖淀粉酶的水解速度也受淀粉和糊精链 的长短影响 太长和太短的链都不利于其水解 生产中为了提高葡萄糖 产率 一般采用延长糖化时间的方法 这样就造成了生产周期较长 三是利用一般的酶法生产葡萄糖时 蛋白质等杂质凝聚性差 糖液 过滤性差 在以往的生产中 人们只注重葡萄糖的转化率 而忽视了蛋 白质等杂质的凝聚性和糖液的过滤性 蛋白质等杂质的存在对糖化后的 过滤以及葡萄糖的结晶都会造成不良的影响 严重制约了结晶葡萄糖的 质量 马德 2 0 0 4 葡萄糖加工过程中蛋白质等杂质的凝聚主要是在液 化阶段 糖化阶段因为温度太低很难凝聚 因此生产中应该在液化阶段 山东农业大学硕士学位论文 控制好杂质的凝聚 陈乐仁 2 0 0 4 生产中衡量杂质的凝聚性指标主要 是透光率 透光率高则杂质凝聚好 反之 则凝聚差 1 5 本研究主要内容 本研究拟采用新型耐高温a 一淀粉酶进行高温液化 利用新型普鲁 兰酶对n 一1 6 糖苷键的分解特性 协同葡萄糖淀粉酶进行糖化 以期 达到提高葡萄糖转化率 缩短生产周期 改善糖液中蛋白质等杂质的凝 聚性的目的 进而确定液化 糖化最佳工艺参数 为玉米淀粉制各结晶 葡萄糖的生产提供理论指导 本研究主要内容包括 1 不同液化程度对糖化d e 值的影响研究 2 影响玉米淀粉液化的因素研究 3 玉米淀粉液化优化参数的研究及验证试验 4 影响玉米淀粉糖化的因素研究 5 玉米淀粉糖化优化参数的研究及验证试验 新型淀糟酶在玉米淀粉制各结晶葡萄糖中的应用 2 材料与方法 2 1 试验材料 玉米淀粉 山东沂水大地玉米有限公司 一级品 耐高温 一淀粉酶s u p r a 诺维信公司 酶活力2 0 0 0 0 u m 1 葡萄糖淀粉酶 杰能科生物工程有限公司 酶活力1 0 万u m l 普鲁兰酶o p t i m a xl 3 0 0 杰能科生物工程有限公司 酶活力 2 5 0 a s p u m l 2 2 仪器设备 7 2 2 s 分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 a y 2 2 0 电子分析天平 日本岛津公司 数显恒温水浴锅 常卅i 国华电器有限公司 p h s 3 c 精密p h 计 上海雷磁仪器厂 k d m 型调温电热套 山东鄄城光明仪器厂 l x j i ib 多管离心机 上海安亭有限公司 电热恒温干燥箱 山东龙口市先科仪器厂 2 3 主要试剂 乙酸锌分析纯天津大茂化学试剂厂 柠檬酸分析纯天津大茂化学试剂厂 磷酸氢二钠分析纯天津大茂化学试剂厂 亚铁氰化钾分析纯安徽省萧达精细化工厂 氢氧化钠分析纯天津市博迪化工有限公司 无水葡萄糖分析纯上海伯奥生物科技有限公司 可溶性淀粉分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 可溶性糯米淀粉分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 碘化钾分析纯天津大茂化学试剂厂 碘分析纯山东省化学研究所 盐酸分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂 硫酸铜分析纯天津市化学试剂三厂 酒石酸钾钠分析纯天津市化学试剂三厂 亚甲基蓝分析纯中国医药集团上海化学试剂公司 山东农业火学硕士学位论文 冰醋酸分析纯博山化学试剂厂 氯化钠分析纯中国尧舜进出口有限公司 乙酸钠分析纯中国医药集团上海化学试剂公司 硫代硫酸钠分析纯中国医药集团上海化学试剂公司 硫酸分析纯天津市化学试剂三厂 2 4 分析测定方法 2 4 1 耐高温a 一淀粉酶活力测定 糊精化率法 邓宇 2 0 0 2 2 4 1 1 耐高温a 一淀粉酶活力单位定义 1 m 1 液体酶于7 0 c p h6 0 的条件下l m i n 液化可溶性淀粉l m g 即 为1 个酶活力单位 以u m l 表示 2 4 1 2 测定步骤 取2 0 m 1 2 的可溶性淀粉和5 m p h 6 0 的磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲 液 放于2 5 m i n x2 0 0 m m 大试管中 在7 0 c 恒温水浴中预热4 5 m i n 然 后加稀释好的酶液o 5 m l 立即记录时间 充分摇匀 定时用滴管取出反 应液0 5 m 滴于预先充满比色稀碘液 约1 5 m 1 的白磁板空穴内 当颜 色反应由紫色逐渐变为红棕色时 即为反应终点 并记录时间 m i n 2 4 1 3 酶活力计算 酶活力 u m 1 2 0 x 2 n t 1 0 3 p 0 5 式中 t 测定记录时间 m i n 2 0 可溶性淀粉溶液体积 m 1 1 0 3 1 9 21 0 5 m g 2 可溶性淀粉溶液质量分数 n 稀释倍数 0 5 测定酶液用量 m 1 2 4 2 葡萄糖淀粉酶活力测定 碘量法 姜锡瑞 1 9 9 6 2 4 2 1 葡萄糖淀粉酶活力单位定义 l m l 液体酶于4 0 c p h 4 6 的条件下 1 h 分解可溶性淀粉产生i m g 葡萄糖 即为一个酶活力单位 以u m l 表示 2 4 2 2 测定步骤 新型淀粉酶在玉米淀粉制备结晶葡萄糖中的应用 于甲 乙两只5 0 m l 比色管中分别加入2 可溶性淀粉2 5 0 m l 及p h 4 6 的乙酸一乙酸钠缓冲溶液5 0 m l 摇