毕业设计（论文）-紫拟青霉紫色色素的稳定性及生物活性研究.doc

贵州师范学院毕业论文（设计） 学科分类号 070411S 本 科 毕 业 论 文（设计） 题 目 紫拟青霉紫色色素的稳定性及生物活性研究 姓 名 学 号 院 （系） 化学与生命科学学院 专 业 生物资源科学 年 级 2011级 指导教师 职 称 教授 二一五 年 五 月贵州师范学院本科毕业论文（设计）诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文(设计)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本科毕业论文作者签名： 年 月 日目 录摘要1关键词1绪论31. 紫拟青霉色素的稳定性研究61.1材料与方法61.1.1材料61.1.2方法 61.2结果与分析81.3小结122. 紫拟青霉色素的生物活性研究132.1 抑菌性132.1.1材料与方法132.1.1.1材料132.1.1.2方法132.1.2结果与分析152.1.3小结172.2 抗氧化性172.2.1材料与方法172.2.1.1材料172.2.1.2方法182.2.2结果与分析182.2.3小结202.3 对部分癌细胞的抑制作用202.3.1材料与方法202.3.1.1材料202.3.1.2方法202.3.2结果与分析212.3.3小结212.4结论223. 结语22参考文献23致谢27附录28II摘 要 以紫拟青霉紫色色素粗提物为原料，研究其在水溶液中的稳定性及生物活性。通过紫外分光光度计测定吸光度研究色素的稳定性及抗氧化作用；采用滤纸片法研究色素的抑菌性；采用MTT法研究色素对部分癌细胞的抑制作用。试验结果表明：该色素水溶液在常温、糖等条件下较为稳定；在Cu2+、Zn2+、Fe2+和10 %的H202存在条件下稳定性较差；pH影响色素溶液的颜色变化；色素粗提物对金黄色葡萄球菌有很好的抑制效果，对青霉菌及黑曲霉无抑制作用；色素粗提物对HO及DPPH的清除率分别为8 %和17.614 %，表明该色素具有一定的抗氧化作用；另外，色素粗提物对癌细胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用。结论：紫拟青霉色素可为一种活性天然色素，具有一定的研究与开发利用价值。关键词：紫拟青霉；色素；稳定性；生物活性Abstract In this article, the stability and bio-activity of purpureus pigment on Paecilomyces purpureus were studied. The stability and antioxidant activity of the pigment were inspected by the absorbance measured using ultraviolet spectrophotometer; The antibacterial activity of the pigment was measured by the filters method; The effect of anti-cancer activity of the pigment for some cancer cells were determined by the MTT method. Results showed that the pigment of Paecilomyces purpureus was stable in natural temperature and was stable in sugar solution; While the stability of the pigment was poor in condition of Cu2+、Zn2+、Fe2+ and 10% H202 ; The change of the color on the pigment solution was observed in different pH; The effect of antibacterial on the pigment was obvious to staphylococcus aureus, but no inhibition to penicillium and aspergillus Niger almost; The clearance of the pigment to HOand DPPH were 8% and 17.614% respectively, which showed that the pigment had antioxidant activity. In addition, the pigment had inhibitory effect on cancer cell of MDA, BPH, PC3 and K562. So, as active natural pigment, the purpureus pigment of Paecilomyces purpureushad had great development and utilization value.Keywords：Paecilomyces purpureus; Pigment; Stability; Bio-activity 绪论 （一）天然色素和合成色素 食用色素按其来源可分为化学合成色素和天然色素。化学合成色素最早出现于18世纪，由于其色泽鲜艳、性质比较稳定、着色力较强、成本较低等许多优点，得到了广泛的应用与推广。然而，化学合成色素大多数对人体具有毒害作用，其不仅体现在一般的毒性和致泻性，有些还具有致癌性。目前，很多地区尤其是欧美等经济发达国家已经严令禁止在食品、药物等中使用化学合成色素。相对化学合成色素而言，食用天然色素是从动物、植物和微生物中获得的天然着色物质，大多数为花青素类、黄酮类、类胡萝卜素类化合物，其结构稳定，安全性较高，而且很多含有丰富的营养物质。此外，还有一些食用天然色素在清除自由基、抗氧化、抑制病原菌、降压、降血脂、调节免疫力、保肝护肝等方面有重要作用，因此食用天然色素广泛地应用于食品、医疗、保健、化工等领域。 （1）食用天然色素的来源食用天然色素的种类有很多，按取材其主要来源于植物类色素、动物类色素和微生物类色素。 1）植物类色素。该类色素大多是从植物的根、茎、叶、果实、种子等中经提取加工制成，是目前我国研究和应用最多的色素。属于这类的有甜菜红、紫甘蓝、山楂、栀子、一串红、红蓝、黑豆红、高粱红、玉米黄、萝卜红、玫瑰茄红、 - 葫萝卜素等。 2）动物类色素。用于食用的动物类天然色素较少，如胆红素、食用血红素、虫胶红色素等 3）微生物类色素。研究和应用最多的天然食用微生物类色素资是红曲色素。红曲红色素是我国传统使用的天然色素，安全且工艺性能较好，广泛用于肉、果酱、豆、面、果汁等类食品的着色1-11。 （2）食用天然色素的应用 1）在食品领域中的应用。主要用作食品的添加剂，如红曲色素主要用于酿酒、酿醋、食品着色及肉类的防腐保存，制作腐乳等；高粱红色素在肉灌制品、糖果和糕点上用作着色剂等。 2）在医药保健领域的应用。目前研究认为北五味子红色素有清除羟自由基的能力，具抗氧化活性；槟榔色素对DPPH、OH 的清除及对脂质体过氧化的抑制能力很强；茶色素有拮抗高同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤的作用；栀子黄色素具有泻火、清热利湿、解毒等功效；叶黄素可延缓眼睛退行性疾病的发生；番茄红色素可以防止细胞的老化和病变，具有抗癌、防癌、活化免疫细胞等作用；辣椒红色素可用来治疗脑血管病；姜黄色素具有抗肿瘤、降血脂和抗动脉粥状硬化作用；虾青素对由紫外线造成的皮肤癌具有很好的治疗效果，可防治由糖尿病引起的眼病；黑米色素能保护血管内皮，改善缺铁性贫血作用；花生红衣色素具有很好的抗氧化作用。3）其它方面。大多食用天然色素还具有很好的抑菌效果，如姜黄色素对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用，可用于抗凝、抗炎、防止老年斑的形成等方面；红曲及红曲色素对蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、萤光假单胞菌均有较强的抑制作用12-29。 （二）国内外研究现状相对于西方发达国家我国的天然食用色素研究起步较晚，目前是天然色素与合成色素并存。我国目前允许使用的天然食用色素有60多种，其中优势品种有：焦糖色素、辣椒红素、红曲红、姜黄、栀子黄、高梁红色素等。2005年我国天然色素的产量比2004增长29.6 %，总产量近30万吨，2007用于着色剂的有32.46万吨的产量，同比增长1.4 %，表明我国的天然食用色素的产量正在逐年增加。在国外尤其是有些发达国家食用天然色素的使用比例近85 %，其优势品种有果红、胭脂虫红、紫檀素、蓝绿色海藻、靛蓝植物等，但目前尚有些如万寿红等色素未获准使用30-32。采用微生物生产天然色素是天然色素的主要来源之一。微生物中真菌类资源研究较广，其化学稳定性高、化学结构及色调多样性。天然色素的生产真菌主要包括一些大型真菌和丝状真菌，但大型真菌色素性质不太稳定，难以在生产中进行广泛推广和应用。丝状真菌中研究较多的有红曲霉、青霉、虫草和拟青霉等。其中，红曲霉色素的研究最为广泛。目前对产紫青霉（Penicillium. purpurogenum Fleroff）及附球菌（Epicoccum spp.）等研究报道较多，但对拟青霉色素方面的研究很少，Youn Jeung Cho，Hye Jin Hwang等研究了营养条件和通气量对蝉拟青霉（Paecilomyces sinclairii）产红色素的影响；Ali Asaff，Francisco Escobar等研究了金属离子对玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）产色素的影响；Palanivel Velmurugan，Yong Hoon Lee等研究了光对粉质棒束孢(Isaria farinosa)产色素的影响33-35。 （三）研究的目的和内容 （1）研究目的天然食用色素广泛地应用于食品、医疗、化妆品、肥皂、保健品等行业以满足人们的不同需求。随着科学技术的进步和人类对自身健康的重视，人们对健康而营养丰富的天然食品的追求日益强烈。虽然天然色素主要来自动植物和微生物，且大多安全无毒，但与化学合成色素相比较食用天然色素性质复杂，对光、热、pH值及氧化较为敏感。而且因受到动植物种类、地理及季节的影响，导致食用天然色素供应量不稳定8，所以开展产天然色素菌株的相关研究有利于对其更有效地开发利用。紫拟青霉（Paecilomyces purpureus Z.Q. Liang & Y.F. Han）属半知菌类、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属，是一种虫生拟青霉，在培养过程中能大量产生天然紫色色素，色调少见。通过对该色素相关方面的研究，旨在为该色素日后的工艺提取及开发利用提供必要的参考。 （2）研究内容 1）色素水溶液在温度、金属离子、氧化剂、还原剂等存在条件下的稳定性； 2）色素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等的抑菌效果； 3）色素对HO及DPPH的抗氧化作用； 4）色素对部分癌细胞的抑制作用。1. 紫拟青霉色素的稳定性研究 1.1材料与方法 1.1.1 材料 1.1.1.1菌株：紫拟青霉，来自贵州大学真菌资源研究所。 1.1.1.2 仪器：紫外分光光度计，岛津UV2450型。 1.1.1.3药品试剂：盐酸、葡萄糖等为国产分析纯。 1.1.2 试验方法 1.1.2.1 粗提浓缩物的制备 将紫拟青霉接种于PDA液体培养基中，摇瓶培养4-6天，再静置避光培养20天，之后转自然光培养10天，将液面菌丝取出，用无水乙醇浸提3 h，收集提取液用旋转蒸发仪蒸干，得色素粗提浓缩物。 1.1.2.2温度对色素的影响 定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长下测得其初始吸光度。将色素液定量分装于五组试管中，分别置于20 、40 、60 、80 、97 下，每2小时测定其吸光度（测时用蒸馏水补回原量摇匀）。 1.1.2.3金属离子对色素的影响定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长下测得其初始吸光度。将色素液定量分装于十组试管中，取9只管分别同时添加20 mg的NaCL、MgSO4、无水CaCL2、ZnCL2、KCL、FeSO4、CuSO4、FeCL3、MnCL2（浓度均为20 mg/20 mL色素液），另一管作空白对照，每天室温下测定其吸光度。 1.1.2.4氧化剂对色素的影响 定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长下测得其初始吸光度。将色素液定量分装于五组试管中（每管10mL色素液），分别同时添加1 mL浓度为0 %、5 %、10 %、15 %、20 %的H202，每小时测定其吸光度。 1.1.2.5还原剂对色素的影响 定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长下测得其初始吸光度。将色素液定量分装于五组试管中（每管10 mL色素液），分别同时添加1 mL浓度为0 %、5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3，每天测定其吸光度。 1.1.2.6糖对色素的影响定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长处测得其初始吸光度。将色素液定量分装于五组试管中，每组20 mL。其中4管依次添加0.20 g的麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖，另一管做空白。每小时测定其吸光度。 1.1.2.7 pH对色素的影响定量称取0.20 g色素浓缩物，完全溶于200 mL蒸馏水中，在530 nm波长处测定其初始吸光度。将色素液等量分装于13组试管中，一组作空白，另外12组用pH计依次将pH调为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，同时测定其吸光度。 1.2结果与分析 1.2.1温度对色素的影响 通过测定OD值考察不同的温度对色素溶液稳定性的影响，如图1.1（0代表初始吸光度）： 图1.1 温度对色素稳定性的影响 Fig 1.1：the effect of the temperature on the stability of the pigment 由图1.1可知，浓度为0.10 g/100 mL的色素溶液在20 、40 、60 、80 、97 条件下稳定性较好，其中色素溶液在40 以后随着温度的升高其OD值相对于初始值在上升，8 h后测得上升百分比分别为2.5 %、8.7 %、16.3 %、26.3 %，说明温度的升高对该色素具有一定的增色效果，推测其增色效果可能是由于随着温度的升高色素在水溶液中溶解更充分。 1.2.2金属离子对色素的影响 通过测定OD值考察不同的金属离子对色素溶液稳定性的影响，如图1.2（0代表初始吸光度）： 图1.2 金属离子对色素稳定性的影响 Fig 1.2: the effect of the metal ions on the stability of the pigment由试验结果得知，在金属离子Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、K3+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、Mn2+影响下，3d后该色素溶液（0.10 g/100 mL）OD值相对于空白组下降百分比分别为23.3%、43.5 %、79.8 %、11.5 %、7.4 %、2.6 %、81.2 %、72.5 %、19.3 %，其中Zn2+下降最多为81.2 %，Fe3+下降最少为2.6 %。表明金属离子对该色素溶液的稳定性具有一定影响，其中Zn2+、Cu2+、Fe2+的影响较为明显。 1.2.3氧化剂对色素的影响 通过测定OD值考察不同浓度的H202对色素溶液稳定性的影响，如图1.3（0代表初始吸光度）： 图1.3 氧化剂对色素稳定性的影响 Fig1.3: the effect of the antioxidant on the stability of the pigment 由试验结果得知，浓度为0.10 g/100 mL的色素溶液在浓度分别为5 %、10 %、15 %、20 %的H202条件下，3 h后其OD值相对于初始值下降百分比分别为10.8 %、38.1 %、14.2 %和17.9 %，表明浓度为5%、15%、20%的H202对色素溶液稳定性影响较小，而10 %的H202影响相对较大。 1.2.4还原剂对色素的影响 通过测定OD值考察不同浓度的Na2SO3对色素溶液稳定性的影响，如图1.4（0代表初始吸光度）： 图1.4 还原剂对色素稳定性的影响 Fig1.4: the effect of reducing agent on the stability of the pigment 由图1.4可知，浓度为0.10 g/100 mL的色素溶液在浓度为5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3条件下，3 h后其OD值相对于初始值下降百分比分别为5.4 %、13.5 %、16.6 %和17.9 %，表明四种不同浓度的Na2SO3对色素溶液的稳定性影响较小。 1.2.5 糖对色素的影响 通过测定OD值，考察色素溶液在不同糖存在的条件下的稳定性，如图1.5（0代表初始吸光度）： 图1.5 糖对色素稳定性的影响 Fig1.5: the effect of sugar on the stability of the pigment 由图1.5可知：浓度为0.10 g/100 mL的色素溶液在麦芽糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖条件下较为稳定，3 h后其OD值与初始值相比较，上升百分比分别为3.3 %、4.7 %、4.0 %、4.5 %。另外，通过方差分析各试验组的OD值无明显差异，表明四种糖对该色素溶液无明显影响。 1.2.6 pH对色素的影响 通过pH的调定，考察不同pH条件下色素溶液的稳定性（0为空白对照，其他依次为pH1-12），如图1.6： 图1.6 pH对色素稳定性的影响 Fig1.6: the effect of pH on the stability of the pigment由图1.6可知，相对于空白对照组，浓度为0.10 g/100 mL的色素溶液OD值在pH1-pH12条件下变化较小（尤其是在pH6、pH7、pH8条件下），其变化百分比分别为10 %、2.7%、6.4 %、11.9 %、7.3 %、0.1 %、0.2 %、0.4 %、-3.8 %、-4.1 %、-1.4 %、7.5 %（正值代表下降，负值代表上升）。表明色素在上述pH条件下较为稳定。另外，在不同pH条件下色素溶液的颜色有变化，其结果如图1.7 图1.7 不同pH条件下色素溶液的颜色变化 Fig1.7: the change of the color on the pigment solution in different pH 由图1.7可知，在pH1-12范围内，该色素溶液的颜色与空白组（紫色）相比较，其颜色由紫色依次变化为黄色、紫色、蓝色。由pH对色素溶液呈色的影响推测该色素可能属于花青素醌类。1.3 小结对紫拟青霉色素水溶液的稳定性进行研究，试验结果表明：该色素溶液在常温、糖等条件下较为稳定；在Cu2+、Zn2+、Fe2+、10 %的H202条件下稳定性较差；pH、Na2SO3对色素溶液稳定性影响较小；pH影响色素溶液颜色变化，由此推测该色素可能属于花青素醌类。2. 紫拟青霉色素的生物活性研究 2.1 抑菌性 2.1.1材料与方法 2.1.1.1 材料 （1）菌种：紫拟青霉（Paecilomyces purpureus）、大肠杆菌（E scherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），来自贵州大学真菌资源研究所；青霉（Penicillium）、及黑曲霉（Aspergillus niger）取自贵州师范学院贵州省生物资源开发利用特色重点实验室。 （2）仪器：YXQ-LS-XJ SII型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SKP-02.500型电热恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；SW-CJ-ICU型洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。 （3）药品试剂：H202、FeSO4、邻苯三酚等为国产分析纯。 2.1.1.2 方法 （1）培养基 PDA固体培养基：土豆200 g削皮切块，加1000 mL水煮沸30 min后4层纱布过滤，加入蔗糖20 g再过滤一次，加入琼脂20 g，补水至1000 mL，121 灭菌30 min。 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCL 5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH 7.0-7.2。121 灭菌30min。 细菌培养液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCL5 g，水1000 mL，pH 7.0-7.2。121 灭菌30 min。 （2）色素粗提浓缩物的制备 将紫拟青霉接种于PDA液体培养基中，摇瓶培养4-6天，再静置避光培养20天，之后转自然光培养10天，将液面菌丝取出，用无水乙醇浸提3 h，收集提取液用旋转蒸发仪蒸干，得色素粗提浓缩物。 （3）细菌菌悬液制备待供试菌种活化后，从斜面培养基上刮下适量菌体，接种于细菌培养液中，37 培养18 h，培养后的菌液用血球计数板计数，以细菌培养液调整细菌浓度至3.2x108个/ mL，制成细菌菌悬液。 （4）色素粗提液的制备 准确称取0.5 g粗提浓缩物两份，其中一份完全溶于50 mL无菌蒸馏水中，无菌条件下静置，待用；另外一份置于温度为121 ，压强为0.14 MPa的立式压力蒸汽灭菌锅中灭菌20 min后取出冷至常温待用。 （5）抑菌材料制作 取3张定性滤纸为一叠，用打孔器均匀打孔，得到直径为6 mm的滤纸柱，压平后分装入洁净培养皿中，121 灭菌30 min，放入烘箱烘干，待用。 试验步骤 （1）色素粗提液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验 1）取已灭菌干燥的培养皿，每个培养皿导入约20 mL的牛肉膏蛋白胨固体培养基，无菌条件下静置待其凝透，取培养基均匀并表面无冷凝水的使用。用灭菌干燥的棉签蘸取细菌菌悬液在培养基上均匀涂布，静置30 min至菌液完全吸收。 2）用洁净无菌的镊子夹取滤纸柱（6层滤纸）在紫拟青霉粗提浓缩物水溶液中浸泡约10 s，取出滴去表面过多的色素液并将滤纸柱平移到培养基上。每个平板每种材料设对照1个（无菌蒸馏水），供试液2个，共3个。各种材料间隔距离相等，3个重复。 3）将上述平板静置于常温无菌环境中，待液体充分浸到培养基中，37 培养24 h，观察并记录抑菌圈直径大小，测量采用十字交叉法，取其平均值。 （2）色素粗提液对青霉菌及黑曲霉的抑菌活性 取已灭菌干燥的培养皿，每个培养皿导入约20 mL的PDA固体培养基，无菌条件下静置待其凝透，取培养基均匀并表面无冷凝水的使用。将青霉和黑曲霉接种于平皿上均匀涂布，静置一会后用洁净无菌的镊子夹取滤纸柱（6层滤纸）在紫拟青霉粗提浓缩物水溶液中浸泡约10 s，取出滴去表面过多的色素液并将滤纸柱平移到培养基上。每个平板每种材料设对照1个（无菌蒸馏水），供试液2个，共3个。各种材料间隔距离相等，3个重复。 （3）色素粗提液、庆大霉素及青霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较 取4个滤纸柱（每个滤纸柱两片滤纸），平移到涂好金黄色葡萄球菌的牛肉膏蛋白胨培养基上的4个不同位置。用移液枪各吸取20 L的庆大霉素（浓度为2 mL/8万单位）、青霉素（浓度为2 mL/80万单位）、色素液（浓度为0.5 g/50 mL无菌蒸馏水）及无菌蒸馏水分别加到4个滤纸柱上。每个平板每种材料设对照1个（无菌蒸馏水），供试液3个，共4个。各种材料间隔距离相等，3个重复。 2.1.2结果与分析 （1）色素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验 通过对抑菌圈直径的测量考察色素液的抑菌效果，如表2.1，图2.1： 表2.1 抑菌圈直径的测量 Table 2.1: The measure of inhibition zone 菌种大肠杆菌/mm金黄色葡萄球菌/mm抑菌圈直径6.6723.2 图2.1 色素液对培养24h后的金黄色葡萄球菌（左）和大肠杆菌（右）的抑菌效果 Fig.2.1: The antibacterial activity of the pigment solution to Staphyloccocus aureus and Escherichia coli由试验结果得知，在培养24 h后，浓度为0.5 g/50 mL的色素溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为23.2 mm，对大肠杆菌的抑菌圈平均直径为6.67 mm，表明该色素水溶液对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果，对大肠杆菌则无抑制作用（空白对照组直径为6 mm）。 （2）色素对青霉菌及黑曲霉的抑菌试验 图2.2 色素液对培养48h后的青霉菌（左）和黑曲霉（右）的抑菌效果 Fig.2.2: The antibacterial activity of the pigment solution to Penicillium and Aspergillus niger 由图2.2可知，在培养48 h后青霉菌、黑曲霉均已长满PDA培养基，未出现抑制效果，表明色素液对青霉菌、黑曲霉没有抑制作用。 （3）色素液、庆大霉素及青霉素的抑菌效果比较 注：左图为紫拟青霉紫色色素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果（双层滤纸/20 L）；右图的右上角为庆大霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果；右图的左上角为青霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果；下面为添加无菌蒸馏水的空白对照。 图2.3 色素液与庆大霉素及青霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较Fig.2.3:The compare of antibacterial activity of the pigment solution, gentamicin and penicillin to Staphyloccocus aureus 培养12 h后对各抑菌圈进行十字交叉法测量其直径，如图2.3。试验结果得知：相同剂量（20 L）条件下测得色素液（0.5 g/50 mL）的抑菌圈平均直径为2.09 cm，青霉素（2 mL/80万单位）的抑菌圈平均直径为2.48 cm，庆大霉素（2 mL/8万单位）的抑菌圈平均直径3.50 cm。表明：以抑菌圈直径为指标，在同等剂量下，色素液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，其抑菌效果是庆大霉素的59.7 %，是青霉素的84.3 %。 2.1.3 小结紫拟青霉色素水溶液的抑菌试验结果表明，以抑菌圈直径为指标，该色素水溶液对金黄色葡萄球菌有很好的抑制效果，对青霉菌及黑曲霉无明显抑制作用；通过抑菌效果比较得知，在同等剂量（20 L）下，浓度为0.5 g/50 mL色素水溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8万单位的庆大霉素的59.7 %，是2 mL/8万单位青霉素的84.3 %。 2.2 抗氧化性 2.2.1 材料与方法 2.2.1.1材料 （1）菌株：紫拟青霉，来自贵州大学真菌资源研究所。 （2）仪器：紫外分光光度计，岛津UV2450型。 （3）药品试剂：邻二氮菲、双氧水等为国产分析纯。 2.2.1.2方法 （1）色素粗提液对HO的清除作用27, 28, 29 7.5 mmol/L邻二氮菲1.5 mL，加pH7.4磷酸盐缓冲液5 mL，充分混匀后， 加7.5 mmol/L 的硫酸亚铁1.5 mL，每加一管立即混匀。加0.10 % H2O2 2.0 mL，加水至12.0 mL，25 水浴加热1 h后，测510 nm处的吸光度为A损伤。加色素样品液（浓度为0.2 g/100 mL）后再加0.10 % H2O2 2.0 mL，测吸光度为A加样。加Vc溶液后，再加2.0 mL 0.1% H2O2 测得吸光度值为AVc。不加H2O2和样品液测得的吸光度为A空白。利用以下公式求样品对HO的清除率。 HO清除率=（A加样-A损伤）/（A空白-A损伤）100% （2）色素粗提液对DPPH的清除作用 在0.25 mmol/mL DPPH溶液中加入2 mL待测样品后摇匀，于室温下放置30min，用无水乙醇作参比液在517nm处测其吸光度为Ai；同时测定在2 mL，0.25 mmol/mL DPPH溶液中加入2 mL无水乙醇混合液的吸光度Ac；测定2 mL, 25 mmol/mL DPPH溶液中加入2mLVc液的吸光度值AiVc；再测定2 mL样品液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度Aj。利用以下的公式求得样品对DPPH的抑制率，抑制率越高说明抗氧化活性越强。 DPPH的抑制率=1-（Ai-Aj）/Ac）100% 2.2.2结果与分析 2.2.2.1 HO的清除作用 用岛津紫外分光光度计UV2450在510 nm下分别对A加样、A损伤、A空白的吸光度进行测定，取其平均值并计算抑制率（VC作对照），如表2.2： 表2.2 色素液对HO的清除作用实验组 OD值A加样0.270A损伤0.252A空白0.475A vc0.483 Table 2.2: The scavenging effect of HO 由表2.2可知，通过公式：HO清除率=（A加样-A损伤）/（A空白-A损伤）100%计算可得该色素溶液对羟基自由基的清除率为8.0 %，对照组VC的清除率为100 %，色素液为VC清除率的8%。 2.2.2.2 DPPH的抑制率用紫外分光光度计岛津UV2450在517 nm下分别对Ai、Aj、Ac的吸光度进行测定，取其平均值并计算抑制率（VC作对照），结果如表2.3： 表2.3 对DPPH的抑制作用 Table 2.3: The inhibition effect of DPPH实验组 OD值Ai1.321Aj0.091Ac1.492 A vc 0.558 由表2.3可知，通过公式：DPPH的抑制率=1-（Ai-Aj）/Ac）100 %计算可知该色素水溶液对DPPH的抑制率为17.614 %，对照组VC的清除率为65.875 %，色素液为VC清除率的26.7%。 2.2.3小结紫拟青霉色素粗提液清除羟基自由基和DPPH试验，结果表明：该色素液对羟基自由基的清除率为8 %，对DPPH的清除率为17.614 %。与VC作比较可知该色素液对羟基自由基的清除效果是VC的8%，对DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明该色素液具有一定的抗氧化效果。 2.3对部分癌细胞的抑制作用 2.3.1 材料与方法 2.3.1.1 材料 （1）菌株：紫拟青霉，来自贵州大学真菌资源研究所。 （2）仪器：紫外分光光度计，岛津UV2450型。 （3）药品试剂：Na2HPO4等为国产分析纯。 2.3.1.2 方法 （1）PBS溶液配制定量称取NaCL0.8 g，KCL0.02 g，Na2HPO4 0.144 g，KH2PO4 0.024 g溶解于100 mL蒸馏水中，调pH至7.4。 （2）MTT溶液配制定量称取0.5 gMTT，溶于100 mL PBS溶液中配成浓度为5 mg/mL的MTT溶液，用0.22 m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存待用。 （3）操作步骤1）称取50 mg样品（紫拟青霉色素浓缩物），用DMSO溶液溶解至1 mL，此时溶液浓度为50 mg/mL，-20 保存待用。2）细胞铺板（96孔板），贴壁细胞每孔约3104个，悬浮细胞每孔约5104个，贴壁细胞等贴上后加药，悬浮细胞立即加药，设置对照：全培养基、全细胞悬液（200 L）、细胞悬液（190 L）+DMSO（10 L）、细胞悬液（190 mL）+药物（10 L）。3）加药(样品)，加药前DMSO，药物样品却用无血清培养基稀释200倍，即1 L+199 L，稀释完之后，再取10 L加入到细胞悬液中，其终浓度为12.5 g/mL，注意每个药物设置3个重复。4）培养72 h37 ，5 %恒CO2细胞培养箱之后，避光向每孔中加入20 L MTT溶液（5 mg/mL，即0.5 %MTT，用PBS溶MTT试剂），4小时之后，倒板，将液体倒出，千万不要碰到紫色的甲臜(三苯基甲臜)，再加入150 L DMSO溶液到每孔，使其溶解甲臜。 5）检测:振板10 min，使甲臜充分溶解，再用酶标仪在490 nm处检测吸光度。 2.3.2 结果与分析 通过MTT法，测定色素对癌细胞系MDA（人乳腺癌细胞系）、BPH（良性前列腺癌细胞系）、PC3（前列腺癌细胞系）和K562（人慢性髓原白血病癌细胞系）的抑制作用，结果如表2.4：表2.4 色素对MDA、BPH、PC3和K562四种癌细胞系的抑制率 Table 2.4: the inhibition rate of the pigment on MDA, BPH, PC3 and K562癌细胞系MDABPHPC3K562抑制率19%27%19%30% 由表2.4可知紫拟青霉色素对癌细胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用。 2.3.3小结 紫拟青霉色素水溶液对部分癌细胞的抑制作用，试验结果表明：该色素对癌细胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用，其抑制率分别为19 %、27 %、19 %、30 %。 2.4 结论紫拟青霉色素的抑菌性试验结果表明：色素溶液对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果；对青霉菌、黑曲霉无明显抑菌作用；通过抑菌效果比较得知，在同等剂量（20 L）下，浓度为0.5 g/50 mL色素溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8万单位的庆大霉素的59.7 %，是2 mL/8万单位青霉素的84.3 %。抗氧化试验结果表明：色素溶液其对羟基自由基的清除率为8 %，对DPPH的清除率为17.614 %，与VC作比较可知该色素液对羟基自由基的清除效果是VC的8%，对DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明该色素液具有一定的抗氧化效果。对部分癌细胞的抑制作用，试验结果表明：色素水溶液对癌细胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用，其抑制率分别为19 %、27 %、19 %、30 %。3. 结语以紫拟青霉紫色色素粗提浓缩物为原料，研究该色素水溶液的稳定性、抑菌性、抗氧化性及部分癌细胞的抑制作用。其中稳定性试验结果表明：色素溶液在20 、40 、60 、80 、97 等温度条件下较为稳定，温度的升高对该色素具有增色效果；色素溶液在葡萄糖、乳糖、蔗糖及麦芽糖存在条件下较为稳定；金属离子Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、K3+、Fe3+、Zn2+、Fe2+、Mn2+对该色素溶液稳定性具有一定的影响，其中Cu2+、Zn2+、Fe2+的影响最明显，所以在提取及应用等过程中应尽量避免金属离子对该色素的影响；色素溶液在浓度分别为5 %、10 %、15 %、20 %的Na2SO3条件下相对稳定，10 %的H202 对该色素的水溶液稳定性具有一定的影响；pH影响色素水溶液的颜色变化，由此推测该色素属于花青素鲲类。抑菌试验结果表明：色素溶液对金黄色葡萄球菌有很好的抑制效果，对青霉菌及黑曲霉无抑制作用；通过抑菌效果比较得知，在同等剂量（20 L）下，浓度为0.5 g/50 mL色素溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果是2 mL/8万单位的庆大霉素的59.7 %，是2 mL/8万单位青霉素的84.3 %。抗氧化性试验结果表明：色素溶液对羟基自由基及DPPH具有一定的清除作用，清除率分别为8 %和17.614 %，与VC作比较可知该色素液对羟基自由基的清除效果是VC的8%，对DPPH的清除效果是VC的26.7%，表明该色素具有一定的抗氧化效果。对部分癌细胞的抑制作用，试验结果表明：色素粗提液对癌细胞系MDA、BPH、PC3和K562均有一定的抑制作用，这在抗癌物筛药选方面具有很好的研究价值。参考文献1钟秋, 谢建春, 孙宝国. 天然食用色素的来源、制备及应用J. 食品研究与开发. 2008, 29(2): 174-177.2杨萌, 吴振强. 食用天然黄色素的研究近况J. 中国调味品. 2008(2): 67-71.3夏洁如, 向晨茜, 王洪伟. 食用天然色素功能应用及发展趋势J. 中国酿造. 2008(22): 1-4.4杨丽华, 陈晓光. 天然色素的资源开发和应用研究进展J. 中国食物与营养. 2010(6): 13-16.5高荣海, 张辉等. 天然食用色素的研究进展J. 农产品加工学刊. 2009(6): 64-68.6吕帮玉, 杨新河, 毛清黎. 我国天然食用色素的开发现状与前景J. 江西农业学报. 2007, 19(10): 108-110.7谭国进, 蒋林斌等. 植物食用色素的研究现状与展望J. 化工技术与开发. 2005, 34(6): 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