（生理学专业论文）trpm7通道在新生大鼠心肌细胞功能的初步研究.pdf

j u n e2 0 1 0 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：_ 1 ) 召哥岛日期：2 柚。6 6 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或 部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 躲脚燧溉y 瓯 暾0 垮反1 t r p m 7 通道在新生大鼠心肌细胞功能的初步研究 研究生：房伟伟导师：沈之君教授 离子通道与疾病课题组 东南大学“发育与疾病相关基因”教育部重点实验室， 东南大学基础医学院，中国江苏省南京市丁家桥8 7 号，2 1 0 0 0 9 中文摘要 摘要。目的研究t r p m 7 在新生大鼠心肌细胞中的功能方法利用r t - p c r 半定量检测大鼠心肌 细胞t r p m 7 和其他六种m 9 2 + 转运体在出生后不同时间的表达情况。原代培养大鼠乳鼠心肌细胞， 用s i r n a 技术和t r p m 7 通道阻断剂2 - a p b 分别作用于心肌细胞，r t - p c r ，蛋白免疫印迹检测s i r n a 的沉默效率和流式细胞术检测细胞凋亡情况。实验数据均采用s p s s l l 5 软件对结果进行统计学分 析。结果 r t - p c r 半定量观察到大鼠心肌细胞上七种m 9 2 + 转运蛋白在出生后不同时期都有不同程 度的表达，其中t r p m 7 在各个时期表达较稳定，并且表达量明显高于其他六种m 9 2 + 转运蛋白。 培养的大鼠乳鼠心肌细胞中经r t - p c r 和蛋白免疫印迹检测，s i r n a 下调t r p m 7 效率在m r n a 水 平和蛋白水平均在7 0 以上；流式细胞术检测细胞凋亡率数据：转染t r p m 7 s i r n a 实验组细胞凋 亡率为( 3 3 6 9 - - + 2 0 6 ) ，与转染无序s i r n a 对照组细胞( 1 0 4 3 - - + 0 9 9 ) 比较，差异有统计学意 义( p 0 0 1 ) 。采用不同浓度2 - a p b ( o 0 l 帐o 1 咖1 0 q 叭) 孵育，实验组细胞凋亡率分别为 ( 1 9 0 0 0 8 7 ) ，( 2 3 0 6 1 4 8 ) 和( 2 8 4 1 0 9 4 ) 。其中加药o 1 硼实验组与未加药对照 组比较，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，加药1 0 u l 实验组与未加药对照组( 1 7 8 0 4 9 ) 比较， 差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。结论t r p m 7 对心肌细胞的生存有重要的作用。这种作用可能与t r p m 7 参与的细胞内m 9 2 + 稳态有关。m 9 2 + 是细胞内重要的二价阳离子，它不仅是多种酶的辅助因子，而且 参与维持生物大分子的正确构象、第二信使的调控、电荷补偿、调控离子通道活性等重要生命活动。 关键词：t r p m 7 ；s i r n a ；2 - a p b ；细胞凋亡 英文摘要 fu nc t ion ala na l y s iso ftr pm 7in n e o n a t a lr a tc a r d i o m y o c y t e s g r a d u a t es t u d e n t ：f a n gw e i w e i ，s u p e r v i s o r ：p r o f s h e nz h i j u n i o nc h a n n e l sa n dd i s e a s e sg r o u p k e yl a b o r a t o r yo fd e v e l o p m e n t a lg e n e sa n dh u m m a nd i s e a s e ，m i n i s t r yo fe d u c a t i o no fc h i n a s o u t h e a s tu n i v e r s i t y , s c h o o lo fb a s i cm e d i c a ls c i e n c e , n a n j i n g210 0 0 9 ，c h i n a a b s t r a c t a b s t r a c t ：o b j e c t i v et oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no ft r p m 7i nn e o n a t a lr a tc a r d i o m y o c y t e m e t h o d s s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c rw a su s e df o rd e t e c t t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f t r p m 7a n do t h e rs i xm + t r a n s p o r t e r si nm o u s ec a d i o c y t e so fd i f f e r e n ta g e ( g ) s i r n aa n dt r p m 7b l o c k e r2 - a p bw e r eu s e di nr a t p r i m a r yc u l t u r en e o n a t a lc a r d i o m y o c y t e ；r t - p c ra n dw e s t e m b l o tw e r eu s e dt ov a r y f yt h eg e n es i l e n e e f f i c i e n c y ；f l o wc y t o m e t r y ( f c m ) w a su s e df o rd e t e c t i n ga p o p t o s i s r e s u l t sa l ls e v e nm + t r a n s p o r t e r s i n c l u d i n gt r p m 7w e r ed e t e c t e da td i f f e r e n ta g e sf r o mn e wb o mt o6 0 一d a ya f t e rb i r t h ，a l t h o u g ht h e e x p r e s s i o nl e v e l so ft r p m 7s h o w e dr e l m i v e l ys t a b l ea n ds i g n i f i c a n t l yh i g h e r w h t is i r n a ，g e n es i l e n e e f f i c i e n c yw a sa b o v e7 0 b o t ha tm r n aa n dp r o t i e nl e v e l s t h ed a t ao ff c m w a st h a t ：a p o p t o s i sr a t eo f n e o n a t a lr a tc a r d i o m y o c y t et r a n s f e c e dw i t hs i r n af o rt r p m 7w a s ( 3 3 6 94 - 2 0 6 ) ，w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ( 1 0 4 3 0 9 9 ，p o 0 5 ) ，2 3 0 6 4 - 1 4 8 ( p b a 2 + c 0 2 + m 9 2 + m n 2 + s d + c d 2 + 和c a 2 + 。其中， t r p m 7 通道对于一些机体非必需的甚至是有毒的金属离子如b a 2 + 、s r 2 + 、n i 2 + 、c d 2 + 也 有较大通透性。值得注意的是t r p m 7 对一些稀有金属离子的通透性远大于对c a 2 + 和 m 9 2 + 的通透性，提示这些离子即使在低浓度下也可以和细胞外钙、镁离子竞争通过 t r p m 7 通道进入细胞内。这一点对于理解金属离子中毒的病理生理机制有重要意义， 也提示t r p m 7 有可能成为金属离子中毒的一个治疗靶点。 1 0 第1 章文献综述 4 ) 参与神经递质的释放 研究表明【4 2 1 ，t r p m 7 通道表达于交感神经元的突触小泡膜上，并可调节交感神经末 梢胆碱能神经递质的释放。以下几点可能是t r p m 7 通道参与神经递质释放的机锌j l j ：( 1 ) 带正电荷的神经递质如乙酰胆碱被锚定在突触小泡内带负电荷的基质上，当突触囊泡和 细胞膜融合后，递质释放的量取决于进入小泡内的中和电荷的量。作为非选择性阳离子 通道的t r p m 7 可以提供正电荷中和突触小泡内的负电荷，从而影响神经递质的量子释 放；( 2 ) 表达于突触小泡膜上的t r p m 7 通道与突触素结合蛋白i ( s y n a p t o t a g r n i ni ) 和突触 蛋白i ( s y n a p s i ni ) 结合成复合物，参与突触囊泡。 的融合。 5 ) 参与细胞运动 肌球蛋白i i ( m y o s i n i i ) 是体内肌细胞和非肌细胞内的重要的马达蛋白，可以将化学能 转化为机械能而引起细胞运动。最近发现t r p m 7 的激酶部位可调节m y o s i n i i 的磷酸 化水平，从而影响细胞的黏附和迁移f 4 3 1 。另有研究表明，t r p m 7 和m 钙激活蛋白酶 ( m c a l p a i n ) 共存于细胞黏附复合体中，钙离子可通过t r p m 7 通道激活m c a l p a i n ，使细胞 黏附复合物解离从而抑制细胞黏附删。t r p m 7 对细胞黏附和迁移的调节可能与一些疾 病如肿瘤有关。 1 3 总结与展望 目前为止，关于细胞转j 垂m 9 2 + 的分子和机制还了解甚少。现在对大部分介导m 9 2 + 出胞的蛋白女i n a + m d + 转运体和c a 2 + m d + 转运体等都只停留在功能水平，还没有深入 到蛋白和基因水平。m 9 2 + 入胞则主要通过不同的通道蛋白，这些通道蛋白中被研究的 最深入的要算是t r p m 7 。以往的研究进展已经使人们对t r p m 7 的分子结构、生物物理 学特性及其调控机制的细节等方面都有了较充分的认识。但也应注意到，目前关于 t r p m 7 的大部分知识都是来自于体外转染体系。虽然己知t r p m 7 组成性表达于机体的 众多器官组织中的可兴奋和不可兴奋细胞中，但由于缺乏选择性的抑制剂或激动剂，极 大地增加了在组织细胞上深入研究t r p m 7 通道的难度。因此，关于t r p m 7 的工具药的 开发是其药理学研究领域的一个重要任务。另外，除了药理学的方法外，分子生物学的 方法如基因敲除也是研究t r p m 7 的生理功能及其与疾病的关系的另一途径。总之， t r p m 7 作为哺乳动物细胞生存所必需的功能蛋白质，参与机体许多重要的生理和病理 过程，t r p m 7 的基础研究和临床应用的开展对生命科学具有重要意义。 东南大学硕士学位论文 2 1 实验材料 第2 章实验材料与方法 2 1 1 实验动物 s d 大鼠：出生三天内s d 大鼠乳鼠和不同出生年龄段s d 大鼠 2 1 2 主要试剂及试剂盒 1 ) t r i z o l ( 美国i n v i t r o g e n 公司) 2 ) m m l v 逆转录酶( 韩国b i o n e e r 公司) 3 ) t a qd n a 聚合酶( 日本t a k a r a 公司) 4 ) 普通一抗( r a b b i ta n t i t r p m 7 ) ( 以色列a l o m o n e 公司) 普通一抗( r a b b i ta n t i a c t i n ) ( 美国s a n t ac r u z e 公司) 普通二抗( g o a ta n t i r a b b i t ) ( 美国s a n t ac r u z e 公司) 5 1 p r o t e i na p l u s a g a r o s e ( 美国s a n t ac r u z e 公司) 6 ) p v d f 膜( 美国m i l l i p o r e 公司) 7 1 l i p o f e c t a m i n er n a i m a x 脂质体( 美i 雪i n v i t r o g e n 公司) 8 ) 牛血清白蛋白( b s a ) ( 美国a n l r e s c o 公司) 9 、d m e m ( 日本n i s s u ip h a r m a c e u t i c a l 公司) 1 0 ) h e p e s ( 美国s i g m a 公司) 1 1 ) 胎牛血清( 美国h y c o l o n e 公司) 1 2 ) 胰酶( t r y p s i n e ) ( 美国i n v i t r o g e n 公司) 1 3 ) i i 型胶原酶( 美国i n v i t r o g e n 公司) 1 4 ) s i r n a ( 上海吉玛公司) 1 5 ) 2 - a p b ( 美i 雪m e r c k 公司) 1 6 ) 凋亡检测试剂( 美国b i o u n i q u e r 公司) 2 1 3 论文中使用的溶液及缓冲液 1 1 5 0 x t a e ：2 4 2 9t d s 碱溶于6 0 0 m l 蒸馏水，加冰乙酸5 7 1 m l ，0 5 me d t a ( p h 8 o ) 1 0 0 m l ，加水定容至1 升，室温保存。 2 ) 3 0 聚丙烯酰胺：2 9 9 丙烯酰胺，l gn - n 亚甲双丙烯酰胺，溶于1 0 0 m l 蒸馏 水。 3 ) 1 5 m s h c l 缓冲液：4 5 5 9t d s 碱溶于2 0 0 m l 蒸馏水中，加浓盐酸调p h 值至 8 8 ，加水定容至2 5 0 m l 。 4 ) 1 0 mn s h c l 缓冲液：3 0 3 9t r i s 碱溶于2 0 0 m l 蒸馏水中，加浓盐酸调p h 值至 6 8 ，加水定容至2 5 0 m l 。 5 ) 5 x t r i s 甘氨酸电泳缓冲液：1 5 1 9t r i s 碱，9 4 9 甘氨酸，5 0 m l1 0 s d s ，加水 定容至1 l 。 6 ) 半干转移缓冲液：3 0 3 9t r i s 碱，1 4 4 9 甘氨酸，2 0 0 m l 甲醇，溶于6 0 0 m l 蒸馏 水中，浓酸调p h 值至8 3 ，定容至1 0 0 0 m l ，室温保存。 7 ) 4 x s d s 凝胶上样缓冲液：5 m l0 1 mt r i s h c l ( p h 6 8 ) 溶液，0 4 m lp 巯基乙醇， 1 2 第2 章实验材料与方法 4 m l 甘油，o 8 9s d s ，o 2 m g 溴酚兰，加蒸馏水定容至1 0 m l ，分装后- - 2 0 冻存。 8 ) l p b s ：n a c i8 0 9 ，k c l0 2 9 ，n a 2 h p 0 41 4 4 9 ，k h 2 p 0 40 2 4 9 ，加蒸馏水8 0 0 m l ， 混匀后，用浓盐酸调p h 至7 4 ，加水定容到1 0 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌后室温保存。 9 15 x t b s 溶液：4 0 9n a c l ，l gk c l ，1 5 9t r i s 碱，溶于8 0 0 m l 蒸馏水中，浓盐酸 调p h 值至7 4 ，定容至1 0 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌后，室温保存。 1 0 11 p b s t ：1 p b s 中加入0 2 t r i t o n x 一1 0 0 。 11 ) 1x r i p a 裂解液：5 0m mt r i s e l ( p h8 o ) ，1 m me d t a ，1 0 0m mn a c l ，0 1 s d s ， 1 n p 4 0 ，0 5 脱氧胆酸钠，1 0 0m g la p r o t i n 。 2 1 4 细胞培养基 1 ) 细胞完全培养基( d m e m ) - 称取d m e m 粉末1 。9 9 ，j t u 入, 1 5 0 m l 去离子水搅拌溶 解，定容至1 8 0 m l ，高压灭菌后，加入2 0 m l 胎牛血清、5 m l2 0 0 m m 谷氨酰胺、3 m l1 0 碳酸氢钠，混匀，4 c 保存。 2 ) 胰酶和i i 型胶原酶混合液：0 0 8 9 胰酶( t r y p s i n e ) 和0 0 5 9 i i 型胶原酶溶- 于1 0 0m l 1x p b s e ? ，用盐酸调p h 值至7 5 ，4 保存。 2 1 5 主要仪器设备 1 ) p c r 扩增仪( 美国b i o r a d 公司) 2 ) 凝胶成像系统( 上海培清科技有限公司) 3 1 稳压稳流电泳仪( 北京市六一仪器厂，型号d y y i i l 2 型) 4 ) d y c p - 3 1 d 型水平电泳槽( 北京市六一仪器厂) 5 ) 高速低温离心机( 德国e p p e n d o r f 公n ) 6 1 常温离心机( 德国e p p e n d o r f 公司) 7 ) 隔水式恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司，型号g h p 9 0 8 0 ) 8 ) 微量移液器( 德国g i l s o n 公司) 9 1p h 计( 上海雷磁) 1 0 ) 正置荧光显微镜( 日本o l y m p u s 公司，型号b x 5 1 ) 1 1 ) 细胞培养箱( 美国t h e r m o 公司) 1 2 ) 流式细胞仪( 美国贝克曼库尔特公司) 2 2 实验方法 2 2 1 大鼠心肌细胞t r p m 7 通道m r n a 发育生物学表达谱的制作 1 ) 总r n a 提取利用t r i z o l 一步法提取提取o ，3 ，1 0 ，6 0 天龄的大鼠心脏组织和肾脏 组织总r n a 。每个样品秤量后加适量t r i z o l 试剂匀浆，按试剂说明书操作方法提取组织 总r n a 。然后，用变性琼脂糖电泳鉴定r n a 的质量。用核酸蛋白测定仪测定其浓度及 纯度，稀释为1 u g u l ，分装。分装好的r n a 样品放入8 0 。c 冰箱保存备用。 2 ) r n a 反转录( r t ) 每个样品取总r n a 2u g 用o l i g od t 引物对r n a 样品进行反转录， 获得各样品r n a 的c d n a ( r t 产物) 产物。r t 反应体系为2 5 u l ，包括2 u g 总 r n a ，0 4 u l m o l lo l i g o d t 引物，0 4 m m o l l d n t p , 力i id d h 2 0 至10 u l ，7 0 。c 变性5 m i n ，立即放 冰上冷却，再加8 u l r n a 酶抑制剂，1 0 0 u l m m l v 反转录酶，5 u l 5 b u f f e r , 辛b 充d e p c 处理 东南大学硕士学位论文 的d d h 2 0 至2 5 u l ，3 7 。c 反应6 0 m i n ，9 5 。c 反应5 m i n 。反转录产物( r t 产物) 分装，2 0 c 保存备用。 3 ) 引物设计及p c r 扩增条件用半定量r t - p c r 方法，以b a c t i nm r n a 水平作为c d n a 合成 及p c r 的内源性参照，定量分析大鼠心脏组织t r p m 7 、t r p m 6 、m r s 2 p 、s l c 4 1 a 1 、 s l c 4 1 a 2 、m a g t l 和a c d p 2 七种m 矿转运蛋白表达水平。引物由大连宝生物工程有限 公司设计并合成。p c r 反应体系为5 0 u l ，含模板( r t 产物) 2 u l ，5 u 1 1 0 p c r b u f f e r , 5 u l 2 5 m m o l ld n t p s ：2 0u m o l l 上下游引物各2 u l ；1 0 u l t a qd n a 聚合酶；力h 2 8 u l 灭菌d d h 2 0 补足。1 3 - a c t i n 和目的基因的p c r 产物均在线性扩增范围内。 表2p c r 所用的引物序列及反应条件 基因引物pcr条件 片段大小 t 砌m 65 一c a r t g g t a g c g g a a c a c 3 预变性9 5 。c5 m i n 变性9 5 。c3 0 s3 4 7 5 t g g g c a c t c a c a a c t c t - 3 退火5 7 c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s t 砌m 75 - c c t g g t c a g a g c a c g a t - 3 预变性9 5 c5 m i n 变性9 5c3 0 s 4 4 4 5 c a g a t g g g t c a g t c a a g t - 3 退火5 5 。c ，3 0 s 延伸7 2 c3 0 s m r s 2 p 5 c g a t t c g c a g a g c a t t a t - 3 预变性9 5 c5 m i n ，变性9 5 。c3 0 s 1 l8 5 - a a c t c c c a t c a g a c c a a a 3 退火5 8 c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s s l c 4 1 a 15 a a a t g t t c c c t c g t i c g c 3 预变性9 5 c5 m i n ，变性9 5 。c3 0 s 1 2 3 5 - t g a g t g g g l l a g c a a g a t - 3 退火5 9 。c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s s l c 4 1a 25 - c t c c c a c t g a a c a t a a c a a 3 预变性9 5 。c5 m i n ，变性9 5 。c3 0 s1 2 9 5 - t c t c c a c g a a a g a a r a a a c 3 退火5 5c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s m a g t l 5 a g t t c c g t c g t c t 雨t t - 3 预变性9 5 。c5 m i n ，变性9 5 c3 0 s 4 4 6 5 g c t t c t t c g c a g a t a c a c 3 退火6 0 c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s a c d p 2 5 g g g a t g g a a a c t g g a c a c g 3 预变性9 5 c5 m i n ，变性9 5 。c3 0 s 13 0 5 t g a g g g a t g a a a g a a a c g a 3 退火5 7 c ，3 0 s ，延伸7 2 c3 0 s 4 ) 电泳及灰度分析取2 0 u lp c r 产物在2 0 的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色。用 k o d a ki d 凝胶图象分析系统分析条带灰度，根据目的基因t r p m 7 、t r p m 6 、m r s 2 p 、 s l c 4 1 a 1 、s l c 4 1 a 2 、m a g t l 和a c d p 2 和内标基因1 3 - a c t i np c r 产物的灰度比，确定 样品中目的基因m r n a 表达的相对含量。 5 ) 统计分析所有数据采用s p s s1 1 0 统计软件统计，结果以平均数标准误( m e a n s e ) 表示，差异显著性检验采用独立样本t 检验。检验结果以p o 0 5 代表差异显著，p 0 0 1 代表差异极显著。 2 2 2 大鼠心肌细胞原代培养并进行sir n a 转染 1 ) 乳鼠心肌的取材：取出生1 4 d 内的大鼠乳鼠，7 5 酒精消毒皮肤，无菌条件下用剪刀剪 头，从胸腔取出心脏，取出的心脏立即放入装有预热3 7 的d h a n k s 液的培养皿中，可见到 心脏仍然保持搏动。 2 ) 乳鼠心肌细胞的分离和培养：取出的心脏在加有3 7 c 的d h a n k s 液的平皿中，洗1 2 次， 置于无血清无双抗的d m e m f 1 2 中。并在其中把心脏剪成体积为l m m 3 的小块。 3 ) 事先准备好2 支离心管，第1 支加入5 m l 左右1 0 胎牛血清d m e m 培养液，第2 支空，其中 第1 支放入4 。c 冰箱中备用。 4 ) 将剪成小块的心肌用镊子放入第2 支空着的离心管中，并吸取1 5 m l 消化液，加入到第2 支离心管中：加入消化液后，把第2 支离心管放入到事先准备好的3 7 c 的水浴锅中消化，第 1 次消化1 l m i n ，弃上清( 保持温度在3 7 。c ) ；第2 次加入消化液2 m l ，消化1 l m i n ，弃上清；第3 次 1 4 第2 章实验材料与方法 加入消化液2 m l ，消化11 m i n ，弃上清；第4 次加入消化液2 m l ，消化2 0 m i n ，每隔5 m i n 摇匀，每 隔1 0 m i n 吹吸以加速心肌细胞的消化。2 0 m i n 后将消化液吸出，放入在4 。c 冰箱中的离心 管中；重复以上步骤，共消化6 次，当用5 m l 的吸管吹吸消化的心肌块时不卡吸管时，即可以 终止消化。 5 ) 将收集好的心肌细胞15 0 0 r m i n 离，1 二, 7 m i n ，弃上清，用5 m l 预热3 7 。c 1 5 的d m e m f 1 2 培养液重悬；在无菌平皿中用滤网过滤细胞悬液以去除大块有形成份。 6 ) 将过滤好的细胞液收集到培养瓶中，置于3 7 。c5 c 0 2 培养2 h ，吸出尚未贴壁的细胞悬 液，转移到6 孔培养板，通过差速贴壁分离、纯化心肌细胞。 7 ) 置于3 7 。c5 c 0 2 培养，2 4 h 后换液，心肌细胞培养2 4 h 以后会出现节律性搏动，时间延 长会出现细胞融合，融合的心肌细胞成片搏动。 8 ) 进行s i i 斟a 转染。 2 2 3 提取细胞总m r n a 和总蛋白 1 ) s i r n a 转染 转染混合物配制： 加样名称加样量 无血清培养基5 0 0 “岈l s i r n a 脂质体 2 1 孔 6 9 l 孑t 心肌细胞种植在6 孔板，2 4 h 后细胞完全贴壁，每孔更换新鲜培养基2 m l 。 1 ) 分别用2 5 0 u l 无血清培养基o p t i m e m 稀释转染试剂和s i r n a 2 ) 将二者混合并轻轻混匀，室温静置2 0 m i n 3 ) 逐滴将混合物加入细胞培养基中，前后摇动混匀。将细胞置于3 7 c5 c 0 2 恒温培 养箱中培养。 2 ) 细胞总蛋白提取 用预冷的p b s 洗涤细胞两次，最后一次吸干p b s ：加入适量预冷的r i p ab u f f e r ( 1 m l 1 0 c m 培养平皿) ；吹打吸入1 5 m l 微量离心管中，冰上放置1 0 m i n ：然后离心：4 。c ，1 3 0 0 0 r p m ， 1 5 m i n ，将上清转移到一个新的离心管中。 3 ) b r a d f o r d 法测定蛋白质浓度 分别在各个e p 管中加入一定浓度的b s a ( 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5u1 ) 各两组，以0 9 n a c i 溶液补足1 0 0 u l ，同时以1 0 0 u l 的0 9 n a c i 作空白对照。每管加入l m l 考马斯亮蓝溶液 ( b r a n f o r d 液) ，振荡混匀，室温放置3 分钟。用波长为a 5 9 5 、光径为l c m 的微量比色法 检测，取a 5 9 5 吸光度值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，用e x c e l 求出标准方程。 取已经抽提的蛋白质样品1u l 加入9 9 u l0 9 n a c i 溶液及考马斯亮蓝溶液l m l ，摇匀，室 温静置3 分钟后同法测定吸光度值，将吸光度值代入标准方程，算出样品的蛋白质浓度。 2 2 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹 1 ) 配制聚丙烯酰胺凝胶( s d s p a g e ) 配制分离胶，混匀后均匀灌入垂直式电泳板中，加蒸馏水封闭上端，室温静置约3 0 m i n 至凝胶聚合完成。吸去上层水分，n 3 m l 混匀的5 浓缩胶，插入加样梳齿，室温静置 约15 m i n 至凝胶聚合完成后拔出梳齿后上样。 1 2 分离胶的配制( 5 m 1 ) ： 东南大学硕上学位论文 加样名称体积( m 1 ) 1 5 2 0 1 3 蒸馏水 3 0 丙烯酰胺 1 5 mt r i s h c i 缓冲液 ( p h 8 8 ) 1 0 s d s 溶液 1 0 过硫酸胺 t e m e d o 0 5 0 0 5 0 0 0 2 5 浓缩胶的配制( 3 m 1 ) ： 加样名称体积( m 1 ) 2 1 0 5 o 3 8 蒸馏水 3 0 丙烯酰胺 1 5 m 耐s h c i 缓冲液 ( p h 6 8 ) 1 0 s d s 溶液 1 0 过硫酸胺 t e m e d o 0 3 0 0 3 0 0 0 3 2 ) 加样 蛋白样品中加入l 上样缓冲液( 1 s d sl o a d i n gb u f f e r ) ，煮沸5 m i n 后加入加样孔 中。 3 ) 电泳 样品在浓缩胶中电泳电压为8 0 伏，时间l h o u r ；样品进入分离胶后，电泳电压设为 1 2 0 伏，直至电泳结束。 4 ) w e s t e r nb l o t 印迹 将适量r i p a 裂解液加入细胞培养皿中5 m i n 后才吹打吸入1 5 m l 离心管中，冰上 放置1 5 m i n ： 1 进行分离胶浓度为1 0 1 2 的s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳； 2 1 8 0 m a 电流，2 h o u r ，将蛋白转至p v d f 膜上； 3 将膜置于w e s t e r n 封闭液( 3 b s at b s t 中) 中封闭1 h o u r ； 4 t b s t 简单清洗后将膜置于纯化的一抗稀释液中室温孵育2 h o u r 或4 。c 过夜； 5 用5 1 0 m lt b s t 清洗4 次，每次1 0m i n ； 6 将膜置于二抗稀释液中，室温孵育1 h o u r ； 7 用5 1 0 m lt b s t 洗膜4 次，每次1 0 m i n ； 8 加入发光底物，暗室内使x 光片感光后，用柯达自动洗片机冲洗x 光片或进行d a b 显色。 1 ) p c r 反应 反应混合物配制： 反应物体积u 1 d d h 2 0 3 8 1 6 第2 章实验材料与方法 1 0 b u f f e r m g c l 22 5 m m c d n a 模板 d n t pm i x1 0 m m 上游引物1 0 u m 下游引物1 0 u m t a g 酶 5 0 3 0 1 o 1 o 2 0 2 0 0 5 p c r 扩增反应条件： c y c l e st e m p e r a t u r e t i m e 19 4 3 m i n 3 09 4 3 0 s e c 5 8 3 0 s e c 7 2 3 0 s e c 母 1 7 2 1 0 m i n * t a q 酶的合成速率为l k b m i n 2 2 6 流式细胞仪检测细胞凋亡 1 贴壁心肌细胞用不含e d t a 的胰酶收集，( 胰酶消化时间不易过长，否则会影响细胞 膜上磷脂酰丝氨酸与a n n e x i nv f i t c 的结合) 。 2 用p b s 洗涤细胞两次( 离心2 0 0 0 r p m ，5 m i n ) 收集1 5 1 0 细胞。 3 加入5 0 0u l 的a n n e x i nvb i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞。 4 加入5 u la n n e x i nv f i t c 混匀后，加入5 u l p r o p i d i u mi o d i d e ，混匀避光、室温反应 1 0 m i n 。 5 用流式细胞仪检测( e x = 4 8 8 n m ；e m = 5 3 0 ) 细胞凋亡情况。 6 所有数据采用s p s s l l 0 统计软件统计，结果以平均数标准误( m e a n s e ) 表示，差 异显著性检验采用独立样本t 检验。检验结果以p 0 0 5 代表差异显著，p 0 0 1 代表 差异极显著。 1 7 东南大学硕上学位论文 第3 章实验结果与讨论 t r p m 7 是近年来发现的一种具有离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能蛋白，为 配体依赖性二价阳离子通道优先对m 孑+ 、c a 2 + 通透。目前主要研究其作为哺乳动物细胞 胞内m 9 2 + 浓度的调控蛋白。其介导的电流呈现典型的外向整流特征。m 孑+ 是细胞必需 的基本离子，参与细胞多种生命活动：其介导的m 9 2 + 不仅是多种酶的辅助因子，而且 参与维持生物大分子的正确构象、第二信使的调控、电荷补偿调控离子通道活性的调控 和等重要生命活动。m 9 2 + 对细胞内游离c a ：十浓度和p h 的调控也起重要作用。细胞内 c a ：十浓度和p h 对细胞收缩、分泌、活力和增殖等生命活动起重要作用。 t r p m 7 蛋白c 段激酶区域序列与e e f 2 丝氨酸苏氨酸激酶以及仅激酶蛋白序列相 似，具有蛋白激酶活性。在胞内二价离子当中，只有m 9 2 + 浓度改变才能直接影响t r p m 7 激酶的催化活性。目前为止，已经有三个t r p m 7 激酶底物被鉴定出来：膜联蛋白1 、 肌球蛋白i i a 重链、钙蛋白酣1 1 。膜联蛋白1 是一种和c a 2 + 和磷脂结合的蛋白并且是细 胞内源性炎性反应的调节蛋白。肌球蛋白i i a 重链参与细胞迁移、细胞生长、细胞凋亡 和细胞骨架的组建等多种生命活动。钙蛋白酶通过分解局部粘着点参与细胞粘附的控 制。t r p m 7 磷酸化膜联蛋白1 、肌球蛋白i i a 重链、钙蛋白酶这三种底物的生物学意义 还不是特别清楚 目前关于t r p m 7 与细胞生存关系的研究一直是一个研究热点。文献报道，在条件 性t r p m 7 基因敲除的鸟类b 淋巴细胞对m d + 的摄入发生障碍，在普通培养基中不仅失 去了分裂生长的能力，而且其存活期也大大缩短，而这种现象在重新转入t r p m 7 基因 后得到纠正。在神经系统，大脑皮层神经元在缺氧所致的细胞死亡与胞内c a 2 + 超载有关， 而t r p m 7 通道是这种c a 2 + 超载的主要途径，下调t r p m 7 通道的表达可以阻断c a ：+ 超 载显著保护神经元不受缺氧的损害。我们的预实验结果表明t r p m 7 在大鼠心肌细胞各 个发育时期都稳定高水平表达，但目前为止，t r p m 7 对心肌细胞正常生理功能的发挥 所起的作用我们还不清楚。 我们试图以大鼠乳鼠心肌细胞为模型，下调大鼠心肌细胞上t r p m 7 基因的表达和 阻断t r p m 7 通道活性，观察t r p m 7 下调或者通道功能被阻断对细胞的生存率的影响 来推测t r p m 7 在心肌细胞上的作用，为深入研究心肌细胞t r p m 7 的功能和机制提供 线索。 主要方法：原代培养大鼠乳鼠心肌细胞；脂质体转染体外合成的s i r n a 下调靶基因 t r p m 7 的表达和利用t r p m 7 通道阻断n 2 a p b 来阻断t r p m 7 通道活性；利用r t - p c r 和 蛋白免疫印迹来保证s i r n a 的沉默效率；通过流式细胞术等手段主要分析t r p m 7 与心肌 细胞生存之间的关系。 3 1t r p m 7 在内的七种m 9 2 + 转运体在出生后不同时期大鼠心肌细胞的表 达 m 9 2 + 是细胞内重要的二价阳离子【4 5 1 ，参与了细胞d n a 与蛋白质的合成、细胞增殖、 氧化磷酸化、酶功能、离子通道的调控、神经与肌肉兴奋性调节等重要生命活动【4 7 。 生理情况下，心肌细胞胞内m 9 2 + 的浓度通常维持在0 4 一l m m 范围内，胞内m 9 2 + 的这种 动态平衡对于心肌细胞正常的生理功能具有重要的意义j 。例如在病理条件下，心肌细 胞内的游离m f + 浓度可出现显著的变化。当胞内游离m 9 2 + 低于生理水平时可诱发房性 或室性心律失常。另外，血镁水平下降可导致心肌细胞内游离m 9 2 + 浓度下降，使心脏 1 8 第3 章实验结果及讨论 更易产生心肌梗塞诱发的心律失常。低镁血症在心电图上通常表现为t 波低平或倒置， q t 间期缩短，q r s 间期延长，提示心脏兴奋性和传导性的异常。这些异常可能是由于 心肌细胞胞内异常浓度的游离m 9 2 + 对心肌上多种通道作用的结果。基础研究及临床资 料表明：在哺乳动物心肌细胞中，当胞内游离m 9 2 + 高于正常生理水平时，心肌细胞的 钠离子( n a v l 5 ) 、钾通道( k i r 2 1 ，k i r 3 1 ，k i r 6 1 ，e r g , k v l q t l ) 、钙通道( c a v l 2 ，c a v 3 2 ) 及m i c 通道( t r p m 6 7 ) 受到不同程度及方式的抑制，虽然在分子机制上不尽相刚4 。 心肌细胞内m 9 2 + 的平衡调控机制现在仍不清楚，可能是参与介导m 9 2 + 进出细胞的转运 蛋白质和胞内一些生物大分子对游离m 9 2 + 的螯合共同作用的结果。目前所知在哺乳动 物细胞上参与介导m 9 2 + 入胞的转运蛋白主要有：t r p m 7 、t r p m 6 、m r s 2 p 、s l c 4 1 a 1 、 s l c 4 1 a 2 、m a g t l 和a c d p 2 等七种1 4 9 。，但我们对这七种蛋白在心肌细胞不同时期的表 达情况还了解，本研究以不同生长时期小鼠心脏组织为模型，检测各个蛋白在大鼠发育 不同时期m r n a 的表达情况，为心脏上m g + 调控机制的研究提供资料。 3 1 1 大鼠心脏发育各时期七种m 9 2 + 转运蛋白m r n a 的表达 大鼠发育各时期心脏t r p m 7 、t r p m 6 、m r s 2 p 、s l c 4 1 a 1 、s l c 4 1 a 2 、m a g t l 和 a c d p 2 的r t - p c r 标志的电泳条带清晰。各时期大鼠心脏组织m r n a 通过r t - p c r 获 得的产物经电泳后，在3 4 7 、4 4 4 、1 1 8 、1 2 3 、1 2 9 、4 4 6 、1 3 0 b p 处出现清晰的电泳条带， 实际扩增长度与设计长度相吻合。内参照1 3 - a c t i n 的p c r 产物电泳条带位于2 7 2 b p ，在 各发育时期灰度较均一，未见明显改变。( 图5 ) 1 2 345678 r f _ r 1 广1 广1 广1 广1n 图5 大鼠心脏七种m 孑+ 转运蛋白m r n a 表达情况m ：d n am a r k e r , h ：心脏组织，p ：阳性对照( 大鼠肾 组织) ，n ：阴性对照，1 ：m r s 2 p ，2 ：s l c 4 1 a l ，3 ：s l c 4 1 a 2 ，4 ：t r p m 6 ，5 ： t r p m 7 ，6 ：m a g t l ，7 ：a c d p 2 ，8 ：1 3 - a c t i n 3 1 2 大鼠心脏发育各时期七种m 9 2 + 转运蛋白m r n a 表达的定量分析 大鼠一1 1 , 肌组织中t r p m 6 的表达从0 天至6 0 天呈上升趋势，6 0 天表达量与0 天表达 量比较，有差异( p o 0 5 ) ；t r p m 7 表达量较平稳，各时期无明显差异；m r s 2 p 表达量 在第1 0 天达到高峰，第1 0 天m r n a 表达量与第0 天比较，有差异( p 0 0 5 ) ；s l c 4 1 a 1 表达量较平稳，各时期无明显差异；s l c 4 1 a 2 在0 、3 、1 0 天m r n a 表达量