草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究.docx

草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究许庆轩, 王勇, 刘志强, 刘淑莹(中国科学院长春应用化学研究所新药研究实验室, 长春 130022)田成(满洲里检验检疫技术中心, 满洲里 021400)摘要 利用电喷雾质谱技术对传统中药草乌中的二萜类生物碱进行直接分析鉴定. 通过实验数据并对比文献发现, 草乌中含有单酯型、双酯型、三酯型和脂类等共 4 种类型生物碱, 其中三酯型和脂类生物碱在草乌 中为首次发现. 由于这些生物碱的结构相似, 在电喷雾串联质谱中碎裂方式相同, 因此根据电喷雾串联质谱结果确定了这些生物碱的结构.关键词 草乌; 二萜类生物碱; 电喷雾串联质谱中图分类号O 657文献标识码文章编号 025120790 (2005) 0420638204A植物草乌 (A con itum k u sn ez of f ii R e ich b. ) 的根部为传统中药, 其中含有生物碱, 具有镇痛、消炎、强心和抗癌等药理功效1 4 .电喷雾电离 (E S I) 是近年来发展起来的软电离技术, 具有高灵敏度、特异性强、操作简便快速等优 点. 生物碱一般具有较高的质子亲合势, 在电喷雾质谱条件下容易电离. 利用电喷雾质谱技术研究草乌生物碱, 不仅可以从一级谱中得到分子量信息, 还可以进行碰撞诱导解离获取生物碱碎片离子的信 息, 从而获取生物碱更多的结构信息. 此外, 在进行结构分析过程中, 样品不需分离, 可以避免植物中 微量成分的丢失5 .草 乌 中 已 知 的 生 物 碱 主 要 是 双 酯 型 生 物 碱, 分 别 为 去 氧 乌 头 碱 ( deo x yaco n it in e )、次 乌 头 碱( h yp aco n it in e)、乌头碱 (aco n it in e )、中 乌 头 碱 (m e saco n it in e )、102羟 基 乌 头 碱 ( aco n if in e ) 和 北 乌 碱(b e iw u t in e) ;另外, 还含有少量的单酯型生物碱以及其它生物碱6 ; 任玉林等7 从草乌花中分离出了 3种三酯型生物碱. 由于乌头碱型二萜生物碱在电喷雾串联质谱中通常失去 C 8 位取代基, 生成相应的特征子离子. 前文8 根据这些特点用电喷雾质谱研究了草乌花中生物碱类化合物, 在其中发现了脂类生 物碱. 本文用电喷雾串联质谱对中药草乌中的生物碱进行分析, 首次发现了三酯型生物碱和脂类生物碱, 这些化合物对于阐释草乌的药理活性将是十分重要的.1 实验部分1. 1试剂、药材与仪器乌头碱、次乌头碱和中乌头碱标准对照品购于中国药品生物制品检定所; 无水乙醇和甲醇均为分 析纯; 草乌为植物草乌 (A con itum k u sn ez of f ii R e ich b. ) 的根部, 购于长春市吉林大药房.电喷雾串联质谱测定在美国 F in n ign L CQ 电喷雾质谱仪上完成, 仪器条件: 毛细管温度 180 ,喷雾电压 418 kV , 离子透镜补偿电压 15 V ,注射泵流速 2 uL m in.1. 2样品处理碰撞能 25% 43% ,氮气流速 60 u n it, 毛细管电压 38 V ,分别称取乌头碱、中乌头碱和次乌头碱标准对照品 1100, 1102 和 0191 m g, 溶解于 50 mL 无水乙收稿日期: 2004206210.基金项目: 国家科技部重大基础研究前期研究专项 (批准号: 2003CCA 03100)、中国科学院知识创新工程重要方向项目 (KGCX 22SW 2213206) 和国家 自然科学基金 (批准号: 39930210, 30271600) 资助.联系人简介: 刘淑莹 (1943 年出生) , 女, 博士, 研究员, 博士生导师, 从事有机质谱学研究.E 2m a il: m slab c iac. jl. cn639N o. 4许庆轩等: 草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究醇中;将 10 g 中药草乌粉末用 40 mL 无水乙醇超声提取 1 h ,分别取上述乙醇溶液用甲醇稀释 100 倍后, 待电喷雾质谱分析用.2 结果与讨论2. 1草乌乙醇提取液的电喷雾质谱研究图 1 为草乌乙醇提取液的电喷雾质谱图. 电喷雾质谱为软电离技术, 在一级谱中不产生碎片, 每 个峰代表一种化学成分,因此从电喷雾质谱一级谱的数据可以获得各种生物碱类化合物的分子量信 息. 结 合 文 献 7, 9可 以 推 断, m z646, 632, 616, 630, 648 和 662 离子分别对应 双酯型生物碱乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、脱氧乌头碱、北乌碱和 102羟基乌头碱; 低质量区的 m z 590, 574, 604 和 588 等弱峰分别 对 应 单 酯 型 生 物 碱 苯 甲 酰 中 乌 头 原 碱( b en zo y lm e saco n in e )、 苯 甲 酰 次 乌 头 原 碱( b en zo y lh yp aco n in e )、 苯 甲 酰 乌 头 原 碱( b en zo y l2aco n in e ) 和 苯 甲 酰 脱 氧 乌 头 碱F ig. 1 Full- scan ES I m a ss spec trum of the e than o l ic ex trac tof A con itum k usn ezof f ii(b en zo y ldeo x yaco n in e) , 它们分别与相应的双酯型生物碱的结构差别仅在于 C 8 位的羟基6; 另外, 还发现了 m z674, 688,690 和 704 等很弱的峰以及 m z800 950 等多个峰, 对照文献 7, 8 ,初步推断可能分别是三酯型和脂类生物碱, 因为这些化学成分在草乌根部首次发现, 仅仅根据分子量确定是不够的, 所以通过串联质谱获取它们的结构信息十分必要.1 所示.A lk a lo id sA co n it ineM e saco n it ineH yp aco n it ineD eo xyaco n it ineB enzo y laco n ine上述生物碱类化合物的化学结构如 Sch em eM + H +646632616630604590574588648662674688690704R 1E t M e M e E tE t M e M e E t M e E t M e E t M eE tR 2O H O H HH O H O H HH O H O HO ace ty l O ace ty l O ace ty lO ace ty lR 3A ce ty l A ce ty l A ce ty l A ce ty l HH H HA ce ty l A ce ty l A ce ty l A ce ty l A ce ty lA ce ty lR 4H H H H H H H HO H O H HH O HO HB enzo y lm e saco n ineB enzo y lh yp aco n ineB enzo ldeo xyaco n it ineB e iw u t ineA co n if ine32A ce ty lm e saco n it ine32A ce ty laco n it ine32A ce ty lbe iw u t ine32A ce ty laco n if ineSchem e 1 The struc ture s of acon itum a lka lo ids in A con itum k usn ezof f ii2. 2草乌中二萜生物碱的电喷雾串联质谱研究为进一步确认草乌中的二萜生物碱, 首先对乌头碱、中乌头碱和次乌头碱标准对照品的甲醇溶液 进行了电喷雾串联质谱研究, 主要质谱碎裂数据列于表 1. 实验结果表明, 它们在二级串联质谱中均生成相对丰度较强的离子8 . 乌头碱、中乌头碱和次乌头碱在三级串联从 C 8 位失去乙酸 (分子量 60) ,质谱中均能失去 CH 3O H , CO 和 C 6H 5COO H 等中性分子. 此外, 乌头碱和中乌头碱还能失去 H 2O , 而次乌头碱则没有失 H 2O 反应. 从 Sch em e 1 可知, 次乌头碱与乌头碱和中乌头碱的结构差别是 C 3 位不 含羟基, 表明乌头碱和中乌头碱在三级质谱中失去的水来自 C 3 位的羟基, 也说明 C 3 与 C 13 和 C 15 位羟 基断裂有明显的不同, C 3 位的羟基较易以脱水形式失去, 而 C 15 位的羟基以失去 CO 方式断裂. 另外,C 14 位取代基仅在三级串联质谱才失去, 说明 C 14 取代基与环连接较紧密. 图 1 中的 m z 616, 632 和640高 等 学 校 化 学 学 报V o l. 26646 离子的串联质谱图 ( 图略) 分别与次乌头碱、中乌头碱和乌头碱标准样品的串联质谱图完全相同,进一步说明它们分别对应这三种双酯型生物碱. 脱氧乌头碱在二级串联质谱 ( 图略) 失去乙酸 ( 分子量60) , 形成 m z 570 离子, 由于其结构与次乌头碱相似, 所以其三级串联质谱 (图略) 与次乌头碱的三级 串联质谱也相似. 102羟基乌头碱和北乌碱的串联质谱 (图略) 分别与乌头碱和中乌头碱的串联质谱相 似, 说明 C 10 位羟基对生物碱的串联质谱无影响.Table 1 M S2 an d M S3 spec tra of M + H + ion s f or HA , M A an d AC图 1 中, m z 604 和 590 离子分别对应苯甲酰乌头原碱和苯甲酰中乌头原碱6 ; m z 574 和 588 离子可能对应着新化合物, 目前在生草乌中尚未见报道, 根据质量数推断可能分别为苯甲酰次乌头原碱 和苯甲酰脱氧乌头原碱离子, 它们是相应的双酯型生物碱通过 C 8 位水解失去乙酰基的产物, 属单酯型生物碱.为进一步确定其结构, 分别对其进行电喷雾串联质谱研究. 对比 m z 590 离子的二级质谱 ( 图略)与中乌头碱标准样品的二级质谱 (Sch em e 1) 可见, m z 590 离子在二级质谱中未失去乙酸 (分子量 60)生成相应的离子,但却观察到了失去水 (分子量 18) 生成的 m z572 离子, 三级串联质谱与中乌头碱标准对照品的三级串联质谱 ( 表 1) 完全相同.表明在二级串联质谱中, m z 590 离子生成的 m z572 离子与中乌头碱标准对照品离子生成的 m z 572 离子结构完全相同, 说明 m z 590 离子所对应的化合物是苯甲酰中乌头原碱. 用相同的方法进一步确定了其它 3 种单酯型生物碱, 其相应的化学结构示于Sch em e 1.在图 1 中, m z 674, 688, 690 和 704 处存在 4 个弱峰. 图 2 为 m z 704 离子的串联质谱, 与草乌 花中 32乙酰基2102羟基2乌头碱的串联质谱8 完全相同, 由于生物碱的串联质谱与其结构密切相关, 微小的结构差别也能被反映出来, 同时考虑到生物碱的来源, 可以确定该离子就是 32乙酰基2102羟基2乌 头碱离子.同理, 可以确定其它 3 种三酯型生物碱 ( 串联质谱未列出) 分别为 32乙酰中乌头碱、32乙酰乌头碱和 32乙酰基2102羟基2中乌头碱. 它们在二级串联质谱中产生的子离子主要为 M H - CH 3COO H + 离子, 其次分别为 M H - 92M H - 120 + 和 M H - 152 + 离子, 分别为母离子通过失去 CH 3COO H+ CH 3O H , 2CH 3COO H 或 CH 3COO H + CO + CH 3O H , 2CH 3COO H + CH 3O H 或 CH 3COO H + CO + ,2CH 3O H 而形成; 在三级串联质谱中, 失去的 m z 60 可能对应 CH 3COO H 或 CH 3O H + CO , 另外还失278 形成三酯型生物碱的特征峰8 .去 m zF ig. 2 ES I-M S2 (A ) an d ES I-M S3 (B) spec tra of the ion a t m z 704 f rom theES I-M S spec trum of A con itum k usn ezof f ii脂类生物碱的结构与双酯型和三酯型生物碱的结构相似,差别仅在于 C 8 位被长链脂肪酸酯链取代, 因此它们在二级串联质谱中失去 C 8 位长链脂肪酸生成的子离子与相应的双酯型和三酯型生物碱A co n it ine HA M A A CA co n it ine HA M A A CM S2 M H + 616 ( 18) 632 ( 24) 646 ( 42) M H + - 60 556 ( 100) 572 ( 100) 586 ( 100)M S3 M H + - 60 556 ( 8) 572 ( 10) 586 ( 30) M H + - 60- 18 554 ( 5) 568 ( 4) M H + - 60- 32 524 ( 100) 540 ( 66) 554 ( 50)M H + - 60- 32- 18 522 ( 28) 536 ( 16)M S3 M H + - 60- 32- 28 496 ( 80) 512 ( 100) 526 ( 100) M H + - 60- 323 2 492 ( 8) 508 ( 8) 522 ( 3)M H + - 60- 323 2- 18 490 ( 6) 504 ( 2) M H + - 60- 323 2- 28 464 ( 6) 480 ( 6) 494 ( 5) M H + - 60- 323 3- 122 338 ( 18) 354 ( 16) 368 ( 18)641N o. 4许庆轩等: 草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究失去 C 8 位乙酸形成的子离子完全相同,串联质谱也完全相同.它们的三级串联质谱与相应的双酯型和三酯型生物碱的三级通过在串联质谱中所失去的质量数以及生成的子离子的种类, 可以确定脂类生物碱的结构, 并且对于质量数相同的不同脂类生物碱, 也可以通过串联质谱加以有效区分9 . 例如,在 m z938 离子的串联质谱中 (图略) 母离子失去 m z 294, 310, 352 和 366 生成相应的 m z 644, 628, 586 和 572 子离子, 对这些子离子做串联质谱, 所得谱图 (图略) 与 32乙酰2102羟基乌头碱, 32乙酰乌头碱, 乌头碱和中 乌头碱的三级串联质谱几乎完全相同, 可以断定这 4 种子离子是由 4 种不同的母离子形成的, 因此可以确定在 m z 938 处存在 4 种离子,分别为 32乙酰2102羟基282十九碳二烯酸酯2苯甲酰乌头原碱, 32乙酰282二十碳烯酸酯2苯甲酰乌头原碱, 82二十三碳烯酸酯2苯甲酰乌头原碱和 82二十四碳烯酸酯2苯甲酰中乌头原碱.同理,列出).通过串联质谱在草乌中发现了大量的双酯型和三酯型生物碱骨架 C 8 长链脂肪酸酯 ( 结构未参考文献1234D e sa i H. 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T h e st ru c tu re in fo rm a t io n o f th e a lk a lo id s w a s go t ten b y e lec t ro sp ray io n iza t io n tan dem m a ss sp ec t rom e t ry ( E S I2M Sn ).A cco rd in g ly, fo u r k in d s o f no rd ite rp eno id a lk a lo id s,su ch a s m o no e ste r a lk a lo id s, d ie r ste r a lk a lo id s, t r ie ste r a lk a lo id s an d lipo 2a lk a lo id s, w e re sim u ltan eo u sly de te rm in ed in th e roo t s o f A con itum k u sn ez off ii. A lso , t r ie ste r a lk a lo id s an d lipo 2a lk a lo id s a re f ir st lyfo u n d in th e roo t s o f A con itum k u sn ez off ii.Keyword ssp ec t rom e t ryA con itum k u sn ez off ii; N o rd ite rp eno id a lk a lo id; E lec t ro sp ray io n iza t io n tan dem m a ss(E d. : K ,G )K619Syn the s is of M oS2 Ca rbon Com po s iteNan o tube sSON G X u 2C h u n 3 , ZH EN G Y i2F an ,HA N Gu i, Y IN H ao 2Yo n g, CA O Gu an g2Sh en gC h em . J . 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