驯鹿β防御素1reBD1基因的原核表达及蛋白活性的鉴定.docx

畜牧兽医学报2011，42(11)：16381642acta veterinaria et zootechnica sinica驯鹿p一防御素一1(rebd一1)基因的 原核表达及蛋白活性的鉴定苏丽娜1，杨银凤，景 岚2，曹贵方1(1内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；2内蒙古农业大学农学院，呼和浩特010018)摘要：旨在构建驯鹿8防御素-1(reindeer p_defensin-1，rebd-1)基因的原核表达载体pet-32a(+)rebd-1，诱导 rebd-1融合蛋白在大肠杆菌中表达，并对其表达产物的生物学活性进行评价。利用rt-pcr技术扩增rebd-1前 原肽。从重组克隆载体pmdl9trebd-i中扩增rebd-1成熟肽编码基因，并克隆入pet-32a(+)中，在大肠杆菌 bl21(de3)中用iptg诱导表达rebd-1融合蛋白。表达的融合蛋白扩大培养，进一步纯化后进行体外抑菌试验。 结果表明，rebd-1前原肽和成熟肽扩增产物大小分别为215和138 bp，目的基因的序列与驯鹿防御素一1 mrna序 列同源性为100。前原驮和成熟肽融合蛋白分子量分别为28和24 ku。利用琼脂糖扩散法表明，008 mgml-1的纯化成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用。结果显示，rebd-1前原 肽及成熟肽在大肠杆菌中得到了高效表达，其成熟肽对革兰氏阳性菌和阴性菌的活性有抗性。 关键词：驯鹿；防御素；基因克隆；蛋白表达；抗菌活性中图分类号：s825；q786文献标识码：a 文章编号：0366-6964(2011)11163805prokaryotic expression of reindeer d-defensin-1(rebd-1)gene and bioactivityidentification of the recombinant proteinsu li-nal，yang yin-fengh，jrng lad，cao gui-fan91(1college of veterinary medicine，inner mongolia agricultural university，huhhot 010018，china；2college of agronomy，inner mongolia agricultural university，huhhot 010018，china)abstract：the aim of this experiment was to construct prokaryotic expression vector of reindeer3-defensin-1(rebd-1)，induce the expression of rebd-1 fusion protein in ecoli，and evaluate the bioactivity of the expression productsthe prepro-peptide of rebd-1 was amplified by rtpcr the mature peptide of encoding rebd-1 was amplified from recombinant cloning vector pmdl9t rebd-1，and then cloned into pet-32a(+)，in which rebd-1 fusion protein expression was in duced by iptg in ecoli bl2 1(de3)the expressed product was further cultured and purified for experiment of bacteriostasis in vitrothe results showed that the amplified products of pre pro-peptide and mature peptide were 2 1 5 and 1 38 bp，respectively，and the homology of the se quences of the targeted gene and rebd一1 mrna was up to 100the molecular weight of fusion proteins of prepro-peptide and mature peptide were 28 and 24 kuthe agar diffusion method has demonstrated that 008 mgml-1 purified mature peptide protein has obvious antimicrobial ac- tivity against saureus and ecolifrom the results we can conclude that the prepro-peptide and mature peptides have high expression level in ecoli，and the mature peptide has resistance to both gram negative and gram positive bacteriakey words：reindeer；defensin；gene cloning；protein expression；bacteriostasis收稿日期：2010-0910基金项目：内蒙古农业大学科技创新团队建设项目(ndpyytd2010-6)，国家自然基金项目(31160491) 作者简介：苏丽娜(1983一)，女，内蒙古呼伦贝尔人，硕士生，主要从事解剖与生物学研究，e-mail；sln850201163com*通讯作者：杨银凤，e-mail：juliel963163eom万方数据11期 苏丽娜等：驯鹿p防御素一1(rebnl)基因的原核表达及蛋白活性的鉴定1639防御素(defensin)是广泛分布于生物界的一类 内。这些p防御素表达在不直接接触微生物环境的 富含精氨酸和半胱氨酸残基的阳离子内原性抗微生 器官内有助于防御素抵御这些器官的感染。 物肽。在动物、植物、昆虫等多种生物中已发现了本研究构建了驯鹿8防御素一1基因的原核表达279种防御素分子，在哺乳动物中的表达已经超过载体pet-32a(+)rebd-1，诱导rebd-1融合蛋白100种1。防御素存在于中性粒细胞或潘氏细胞，在大肠杆菌中的表达，并对其表达产物的抗微生物 或由单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、角质化细胞、 活性进行评价。 nk细胞以及上皮细胞分泌。防御素具有十分广泛的抗微生物活性，无论在细胞内或细胞外，防御素对 1材料与方法 细菌、真菌、病毒等多种微生物都具有杀伤作用，尤11材料 其是哺乳动物防御素，除了对细菌、真菌、被膜病毒 大肠杆菌dh5a和bl21(de3)购于takara(大 具有杀伤作用外，还能杀伤支原体、衣原体、螺旋体连)公司。金黄色葡萄球菌(saureus)、大肠杆菌 以及一些恶性肿瘤细胞【2。防御素具有抗病毒作(e coli)为内蒙古农业大学农学院病理实验室惠赠。 用，趋化作用、细胞毒作用、免疫调节作用等活性。pmdl9t-simple克隆载体购于takara(大 防御素的多种作用也提示了它是天然免疫的主要介连)公司。pet-32a(+)表达载体为内蒙古农业大 质，可能为一些重要感染性疾病的防治开辟新路，因学兽医学院组胚实验室惠赠。 此，对于它们的研究也越来越受到人们的关注。 rna提取试剂盒(z3100)及反转录试剂盒成熟的p防御素富含半胱氨酸残基，由3842 (a1260)购于promega公司，蛋白纯化试剂盒购于 个氨基酸残基组成，其分子内包含在特定位置上的6 novagen公司。限制性内切酶ecor i、not i、 个保守的半胱氨酸和其他一些决定p防御素结构和 nco i、taq dna聚合酶、t4-1igasedna连接酶， 功能的保守氨基酸，分子链内二硫键的连接位置分别 均购于takara(大连)公司。为cyslcys5、cys2-cys4和cys3一cys63。p防御素12pcr扩增引物 主要存在于哺乳动物体内，在植物和昆虫中也有发根据ncbl已公布rebd-1 mrna(dq8612961) 现，广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细的基因序列，利用dnastar软件设计引物。前原肽胞内，单核细胞和巨噬细胞通常缺乏p防御素，但是扩增引物为p。和p2，分别带有酶切位点踟r i和它们可以释放诱导上皮细胞合成j防御素的信使4。not i(表1中下划线部分)。成熟肽扩增引物为p3和p防御素广泛表达在机体多种器官的上皮组织，如胃 p2，p3带有酶切位点nco i(表1中下划线部分)。 肠道和呼吸道的黏膜上皮以及一些非上皮组织器官表1引物序列table 1 the primers sequence预扩增基因preamplified gene引物序列(5 73)primers sequencepl鱼垒垒!竺aacatgaggctccatcacctgrebd-1前原肽prepro-peptide of rebd-1p2 ttt gcggccgcttacttctrrct(池agcatp3 catg竖坠塑tactcctcaaagctc汜catrebd-1成熟肽mature peptide of rebd-1p2 ttt gcggccgcttacttctttctgcagcat13驯鹿总rna的提取p。和p：进行前原肽片段的扩增。采用75肚l体 rebd-1 mrna在驯鹿体内的管状器官和实质系：无酶水255肛l，amv缓冲液15弘l，dntpl5 性器官均有表达，其中在舌、瘤胃、睾丸中表达最 弘l，p1 75弘l，p2 75肛l，mgs04 3弘l，amv酶 强5j。本试验选取60 mg的瘤胃组织，根据总rna l 5肛l，丁i厂酶15弘l，rna模板12 i工l。rt- 提取试剂盒说明书提取驯鹿瘤胃总rna。 pcr循环条件：4845 rain；942 min；902014 rt-pcr反转录扩增rebd-1基因rain；5540 min；7280 min；727 min。根据反转录试剂盒说明书进行操作。用引物万方数据1640畜牧兽医学报15克隆载体的构建 19表达蛋白的纯化 将胶回收后的pcr产物与pmdl9tsimple载首先，将5 ml含表达目的蛋白的菌液接种到体用限制性内切酶ecor 1和not i进行双酶切消 500 ml lb培养基中，在发酵罐中过夜处理，离心 化，然后用t4一ligase连接酶连接，进行蓝白斑筛选 收集菌体，加入磷酸盐缓冲液悬浮、搅匀，经超声破 后将重组体转换到ecoli dh5a中，用琼脂糖电泳 碎后，离心取上清。其次，将上述制备的包涵体重悬 检测阳性克隆，提取质粒后用限制性内切酶ecor i 于缓冲液a中使包涵体完全溶解，然后使用ni 和not i进行消化，选择阳性质粒进行测序，重组质 sepharose色谱纯化重组蛋白，将含有重组蛋白的碎 粒测序由上海生物工程公司完成。 片收集到离心管中，所获蛋白质即为pet一32a(+)16 rebd-1成熟肽的扩增rebd-1融合蛋白，用sds-page进行分析。最后， 在前原肽基因测序正确的前提下用引物p：和采取逐步降低盐酸胍浓度的方法，除去蛋白溶液中p。进行成熟肽片段的扩增。50 plpcr体系：无酶 的盐酸胍，使变性的蛋白在此过程中自然复性。 水365,ul，buffer 5 pl，dntp 3 pl，p2 2肛l，p3 2110重组蛋白抑菌活性的检测pl，taq酶05 pi。，模板1 pl。pcr循环条件：94 参照文献6报道的方法，取对数生长期的5rain；9415min；5915min；7215min； ecoli(5106 cfu)涂lb平板，用打孔器在平7210 min。胶回收后，建立克隆载体，与前原肽 板上打孔，加入纯化后的重组蛋白溶液，于37孵 方法相同。 育过夜，观察以加样孔为中心的抑菌环的大小。17原核表达体系的构建 将扩增后的前原肽和成熟肽基因片段与原核表2结果达载体pet一32a(+)分别用限制性内切酶ecor i 21 rebd-1基因的克隆 和noti及ncoi和noti进行双酶切消化，然后用 利用rt-pcr扩增，得到了215 bp的rebd-1t4一ligase连接酶连接，挑选阳性克隆转化到ecoli 前原肽cdna片段与138 bp的rebd-1成熟肽编码 bl21(de3)菌株中，在lb液体培养基中37培养 片段。经测序与预期的目的片段大小相符，目的基 过夜，并进一步检测。 因的序列与rebd一1 mrna序列同源性为i00，18蛋白的诱导表达 见图1(a、b、c)。取培养物以1：100的比例扩大培养，于37、22原核表达体系的构建200 rrain_1震荡至a6。o约为06(3 h左右)，采用 将pet一32a(+)与rebd-1前原肽和成熟肽连 终浓度为1 mmoll1的iptg作为诱导剂，诱导 接后的pet一32a(+)rebil重组体进行pcr检 不同时间(05、l、2、3、4和6 h)取1 ml菌液样本进 测，并做双酶切分析后分别得到215和138 bp大小 行变性处理，然后用15sds-page进行分析。 的条带，证明有外源片段插入到了质粒中，见图2。amdl2000 dna marker；1rebel成熟肽pcr产物(138 bp)。bmdi2000 dna marker；1rebd-i前原肽rt pcr产物(215 bp)。cmdl2000 dna marker1质粒的提取(2 119 bp)丸m dl2000 dna rnarker：1pcr product of ylaature peptide of rebel(138 bp)hl dl2000 dna marker；1rt_ pcr product of prepropeptide of rebd-1(215 hp)cl dl2000 dna marker；1the extraction of plasmid(2 119 bp)图1 febd-i产物的琼脂糖凝胶电泳fig1electrophoresis analysis of rebd-l product万方数据11期 苏丽娜等：驯鹿伊防御索一1(rebnl)基因的原核表达及蛋白活性的鉴定 1641用iptg诱导重组体表达后，经15sds-page分 (e coli)有很强的抗性，当浓度达到004 mgml-1 析表明，在重组菌株中明显比对照菌株及没有诱导的时就可以看到抑菌环，当浓度达到008 mgml一1时 表达菌株多表达了一条大小约为28和24 ku的蛋 抑菌效果就非常明显，见图6a。成熟肽融合蛋白对 白，此为带有histag的融合蛋白，并在诱导3 h后 革兰氏阳性菌(saureus)也有较强的抗性，当浓度 蛋白表达量达到峰值，蛋白主要以包涵体的形式存在为008 mgml_1时可以看到抑菌环，当浓度达到 于菌体沉淀中，上清中可溶性蛋白较少。采用亲和层010 mgmll抑菌效果较明显，见图6b。没有发 析的方法纯化目的蛋白，sds-page显示得到了较为 现前原肽融合蛋白的抑菌作用。 纯净的融合蛋白见图35。ku m黝譬紫7，嚣。，i：a：m蛋白质分子质量标准(低)；1前原肽融合蛋白在上清中的表达；2前原肽融合蛋白在沉淀中的表达。b：mdll5000 dna marker；1前原肚质粒酶切；2前原肽m蛋白质分子质量标准(低)；1成熟肽融合蛋白在上清 质粒对照；3成熟肽质粒酶切；4成熟肽质粒对照 中的表达；2成熟肽融合蛋白在沉淀中的表达mdll5000 dna markerl 1restriction endonuclease a：mprotein mw marker；1the expression of fusionpattern analysis of the recombinant plasmid of prepro- protein of prepro-peptide in supernatant；2the expres peptidel2control of the recombinant plasmid of prepro- sion of fusion protein of prepro-peptide in sedimentb： pepide；3restriction endonuclease pattern analysis of 1the expression of fusion protein of mature peptide in the recombinant plasmid of mature peptide；4control of supernatant；2the expression of fusion protein of ma the recombinant plasmid of mature peptide ture peptide in sediment图2重组质粒pet-32a【+)rebd-i限制性酶切分析 围4融合蛋白衰达形式的鉴定fig2 restriction endonudease pattern allalysis of the fig4 the idenliflcafiou of the exanssim of fusion laetetarecombinant plasm|d of pet-32a【+lrebd-1：!：7=黧：l荽1 ii三。可 ia：m蛋白质相对分子质量标准(低)；1纯化产物；2纯 化前的诱导蛋白。b：m蛋白质相对分子质量标准(低)；1纯化产物；2纯化前的诱导蛋白1未诱导的pet-32a(+)rebdl重组体；m低分子量a：1the purified product；2the protein before purified；marker；2诱导3 h的pet-32a(+)载体；3前原肽融合l protein mw tnarker,b：1the purified producti 2蛋白的表达量；4成熟肽融合蛋白的表达量the protein before purified；l protein mw marker1-pet-32a(+)rebd-1 before induced by iptg；m low围5纯化的目的蛋白pet32a(+)【rebd-i的sds-molecular weight of protein marker 2e coli bl21(de3)page分析txansformed with pet-32a(+)，induced 3 hours；3ex-fig5 sds-page analysis of pmdfled fusion proteinpresslon quanuty of lusion protem of prepro-peptide；4expet32a(+)(rebd-ipression quantity of fusion protein of mature peptide圈3融台蛋白的sd争pagefig3 sds-page analysis of fusion protein3讨论2-3融合蛋白pet-32a(+)rebd-1的抗菌活性利用生物化学方法及免疫技术可以从动物组织 融合蛋白体外抑菌试验结果如图6所示。从图 及血细胞中提取防御素，然而在动物体内仅存有少上可以看到，成熟肽融合蛋白对革兰氏阴性菌 量的天然防御素，并且提取防御素非常昂贵。工业万方数据1642畜牧兽医学报42卷a和b分别是重组蛋白对大肠杆菌(ecold和金黄色葡萄球菌(saureus)抗性的分析其中阳性对照为amp+；试验设置004、008和010mgml叫3个梯度a and b were the analysis of antimierobial activities of recombinant to ecoli and saureu$the positive control wasamp+；the test set up three gradients，004，008 and 010 mgmi。1图6重组蛋白的抗菌活性分析(琼脂凝胶扩散法)fig 6antimicrobial activities of recombinant protein蝴ayed by agar diffusion method化生产和应用防御素预防和治疗疾病是非常有限 的。利用分子生物学技术将转基因动、植物的防御参考文献： 素在体外表达可获得防御素，但得到的防御素分子1 constance a，yvonne rmultifunctional host 仅有35 ku口 。基因融合表达载体的应用是目前 defense peptides：antimicrobial peptides，the small yet 加强防御素稳定表达的较好手段。big players in innate and adaptive immunityj jfebsj2009276：64976508本研究通过rtpcr扩增出rebd一1 cdna序2冯燕，李明远，防御紊的结构特点及抗肿瘤机制研列，该序列与rebd一1 mrna序列同源性为i00。 究进展j肿瘤预防与治疗，2008，21(4)：466469为了屏蔽抗菌肽自身对表达宿主菌的毒性作用，减r 3diamond g，zasloff m，eck h，et a1tracheal少防御素对宿主细胞的伤害。防止防御素因分子小antimicrobiai peptide，a cysteine-rieh peptide from易被蛋白酶所降解，本研究选用了合适的限制性内mammalian tracheal mucosa：peptide isolation and clo切酶。并构建可获得rebd-1天然序列的重组载体进 ning of a ednam3 proc natl acad sci usa， 行融合表达，为成功表达奠定了基础。在表达菌株 1991，88：39523956 的选择上，笔者选用严格控制型菌株bl21(de3)，4孙洁，祁克宗动物防御紊的功能及其应用j动 避免未诱导时的渗漏表达，从而有效防止了rebd-1 物医学进展2005，26(9)：8-12r 5huttner k m，bevions c i，antimierobial对宿主细胞的伤害。通过优化密码子、选用合适的纯peptides as mediators of epithelial host defensej化、复性方法及表达菌株可以