山西省太原市十六中高三生物 5.2 PCR技术课件 中图版版选修1.ppt

复习 基因功能的比较 细胞核 细胞核 核糖体 dna的两条链 dna一条链的部分片段 rna单链 四种脱氧核苷酸 四种核糖核苷酸 20种氨基酸 子代dna mrna 蛋白质 边解旋边复制半保留复制a t a u t a a u u a 选修1专题2课题2pcr技术 自学提纲 知识回顾 1 dna分子的结构 外侧 内侧 基本单位 2 dna复制过程和特点 3 pcr技术概念及应用 基本概念 变性 复性 taqdna聚合酶 引物理解pcr技术的原理掌握pcr技术的全过程比较pcr技术和体内dna复制的异同点 一 基础知识 一 pcr技术的概念是一种体外迅速扩增dna片段的技术 它能以极少量的dna为模板 在几小时内复制出上百份的dna拷贝 二 pcr技术的应用遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定 pcr的应用1 从蓝藻里面克隆sod 超氧化物歧化酶 清除人体内细胞中自由基抗氧化 抗辐射 消炎 抗衰老 抗癌高压氧中毒 肺气肿 糖尿病 早衰食品 保健品 药品 化妆品 基因库检索sod的序列 设计引物 以蓝藻总dna位模板做pcr 获得的基因片断连接在表达载体 原核表达蛋白 pcr的应用2 检测粉末样品是否含有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌 降临美国 席卷全球生命力强 传染快 发作快 死亡率高 有两对引物是根据编码炭疽杆菌ef因子的基因序列设计的 仅与各种炭疽杆菌的ef因子同源 pcr产物是1247bp和208bp的片断 非炭疽杆菌均呈阴性 用营养肉汤培养2小时 取培养液直接作pcr pcr的应用3 基因测序 一 基础知识 三 pcr技术的原理 1 体内dna复制的条件 解旋酶 dna母链 4种脱氧核苷酸 dna聚合酶 引物 rna 打开dna双链 提供dna复制的模板 合成子链的原料 催化dna子链合成 使dna聚合酶能从引物3 端开始连接脱氧核苷酸 变性 80 100 taq聚合酶 耐高温 20 30个核苷酸构成 是一小段dna或rna atp 提供能量 2 dna合成的方向 1 dna单链两端的命名 基本单位 脱氧核苷酸 脱氧核糖 磷酸 t 1号碳 5号碳 3号碳 连接 5 端含磷酸基团 3 端 含羟基 3 端 5 端 dna单链两端的命名 2 dna聚合酶的特性 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 因此 dna复制需要引物 2 dna合成的方向 3 dna合成的方向 从子链由5 端向3 端延伸 3 dna复制的前提 是 用 方法 思考 dan复制的前提是什么 体外扩增dna如何打开双链 双链的解开 控制温度 dna双链 单链 变性 加热80 100 复性 缓慢冷却 4 dna分子的热变性原理 pcr仪原理 变性的目的 复性的目的 解开双链 有利于引物 和引物 与两条单链的结合 思考 高温使dna解旋 但普通dna聚合酶会失活 找到耐高温dna聚合酶 p21托马斯 布鲁克 5 体外dna复制的条件 pcr反应的条件 dna模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐高温的聚合酶 控制温度 但不需解旋酶 以便增加大分子模板dna彻底变性的概率 二 pcr的反应过程 1 循环之前的一次预变性 2 pcr一般要经历三十多次循环 1 变性 当温度上升到90 以上时 双链dna解聚为单链 2 复性 温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 3 延伸 温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 二 pcr的反应过程 3 每个循环包括 变性 复性 延伸 1 pcr循环 变性 95 变性 1 pcr循环 变性 95 变性 1 pcr循环 变性 95 变性 2 pcr循环 复性 55 复性 3 pcr循环 延伸 3 pcr循环 延伸 3 pcr循环 延伸 3 pcr循环 延伸 4 循环特点 上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条 无引物存于两个子代dna分子中 其它子代dna分子都为双引物分子式 处于两引物之间的dna序列呈指数增长1 2n 练习 见课课练p79第10题 二 实验步骤 准备好pcr反应体系的配方 用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 盖严盖子 用手指轻轻弹击管壁 离心10分钟 将离心管放入pcr仪上 设置好循环程序 电泳检测pcr结果 三 操作提示 操作提示1 为避免外源dna等因素的污染 pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 2 pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份 并在 20 储存 使用前 将所需试剂从冰箱拿出 放在冰块上缓慢融化 3 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头都必须更换 所有的成分都加入后 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管的侧壁 使反应液混合均匀 再将微量离心管放在离心机上 离心约10s 使反应液集中在离心管底部 再放入pcr仪中进行反应 目的 避免外源性dna大量扩增造成假阳性反应 四 结果分析与评价 1 原理 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 图5 11 可以利用dna的这一特点进行dna含量的测定 四 结果分析与评价 了解 2 具体方法如下 1 将样品进行50倍稀释 取2 lpcr反应液 加入98 l蒸馏水 2 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计 图5 12 的读数调节至零 3 加入步骤1中的dna稀释液100l至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 4 根据下面的公式计算dna含量 dna含量 g ml 50 x 260nm的读数 x稀释倍数 五 课题延伸 1 pcr优点 2 pcr技术的意义 原理虽然复杂 但操作却十分简单 快速 高效 灵活和易于操作 复习 pcr技术与体内dna复制的区别 1 pcr不需要解旋酶 体内dna复制需要 2 pcr需要耐热的dna聚合酶 常用taqdna聚合酶 而生物体内的聚合酶在高温时会变性 3 pcr一般要经历三十多次循环 而生物体内dna复制需要生物体自身的复制 练习 1 书本2 课课练 练习 见课课练p79第10题 9下图为pcr过程的前三次循环的图解 请据图回答 请将pcr缓冲液中提供的4种组分填写在图中的方框内 2 第一轮循环中变性是指 复性是指 延伸是指 3 假设pgr反应中的dna模板为p 第一轮循环的产物2个子代dna为nl 第二轮的产物4个子代dna为n2 第二轮的产物8个子代dna为n3 则nl n2 n3中分别含有模板dna单链的dna分子 个 若继续循环36次 则n36中将有 个dna分子含有模板dna单链 4 n3的8个dna分子中 是以n2中的 为模板复制而来的 是以n2中的为模板复制而采的 是以n2中的为模板复制而来的 是以n2中的为模板复制而来的 从图中可以看出 dna聚合酶只能特异地复制处于2个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 原因是 练习 见课课练p79第10题 练习二 课堂检测 1 dna单链的 末端为3 端 末端为5 端 在dna复制时 引物从模板链的 端配对结合 在 酶的作用下 引物提供 端 使子链向下延伸 2每次循环可以分为 这三个过程 对应温度分别为 练习二 课堂检测 3 一个dna片段经过30次循环后能形成 个这样的片段 4依据dna吸收紫外光的情况 用紫外分光光度计测得dna 练习二 课堂检测 答案 练习二 课堂检测 1 dna单链的 末端为3 端 末端为5 端 在dna复制时 引物从模板链的 端配对结合 在 酶的作用