分子生物学检验技术实验指导.doc

实验一 小鼠肝组织DNA的提取及鉴定【实验目的】1、 掌握动物组织DNA提取的方法；2、 掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；排除RNA分子的污染和干扰。DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.82.0之间。【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 l Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 l蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55孵育直到组织溶解（约1小时）。2、提取DNA（1）加入1.5 l RNase A，颠倒混匀，37孵育15-60 min。（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。（3）加入1/3体积的Buffer PP，涡旋震荡20 s，12000 rpm离心3 min。（4）将上清转移到个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。12000 rpm离心1 min，弃上清。（5）加入300 l 70乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。（6）加入50 l Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，可以65孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。3、DNA浓度和纯度的测定取0.1 ml DNA样品，加蒸馏水至1 ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。计算：DNA浓度（g/ml）= A2605010 （请问系数50、10是如何得来的？） DNA纯度 = A260nm/A280nm【注意事项】（1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留6070的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。（2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。（3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。（5）提取过程应尽量保持低温。（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA或RNA为40g/ml；单链寡核苷酸为20g/ml。据此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度0.25g/ml的核酸溶液。（7）A260nm/A280nm比值应介于1.82.0之间，若比值2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值线性DNA。（2）琼脂糖凝胶浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA ：琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小（kb）0.5%5600.7%0.8121.0%0.461.5%0.241.75%0.232.00.13（3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状 线状DNA 单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。（4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过20V/cm，电泳温度应该低于30。（5）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中）。（6）电泳缓冲液（0.5TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率。无离子存在时，核酸基本不泳动；离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性。一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染，凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。【实验结果与分析】1电泳过