高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸.docx

高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸韦淑毅1，2，钟其顶2，高红波2，邢江涛2，王道兵2，熊正河2，*，王岁楼1，*（1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100027）摘 要：建立了高效液相色谱法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。采用酶解提取法提取富硒酵母样品中的硒代蛋氨酸，丹磺酰氯柱前衍生，c18 色谱柱（4.6 mm250 mm i.d., 5 m）分离，以 10 mmol/l 磷酸二氢钠缓冲液（含 4 % n，n-二甲基甲酰胺，ph=6.55）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，荧光检测（激发波长：320 nm；发射波长：523nm）。硒代 蛋氨酸的检出限为（s/n=3）1 g/l，定量限为（s/n=10）5 g/l。在 1 mg/l50 mg/l 范围内的线性关系良好（r0.999 6）。 加标回收率在 91.12 %107.83 %，方法相对标准偏差1.2 %。本方法具有专属性好，灵敏度高，适用于富硒酵母原料 及相关产品中的硒代蛋氨酸的定量测定。关键词：富硒酵母；硒代蛋氨酸；丹磺酰氯；高效液相色谱法determination of selenomethionine in selenium-enriched yeast by reversed phase high performance liquidchromatographywei shu-yi1, 2, zhong qi-ding2, gao hong-bo2, xing jiang-tao2, wang dao-bing2, xiong zheng-he2, * , wang sui-lou1, *（1. china pharmacutical university, nanjing 210009, jiangsu, china; 2. national research institute of food &fermentation industries, beijing 100027, china）abstract：the high performance liquid chromatography detection methods for selenomethionine in selenium - enriched yeast is established, which utilizes protein enzymes for selenomethionine extraction, dansyl chloride for derivatizaiton, c18 reverse column (4.6 mm 250 mm i.d., 5 m) for seperation, 10 mmol/l phosphate buffer solution and acetonitrile for gradient elution, fluorescent detector (ex: 320 nm; em: 523 nm) for determination.the detection limit (s/n=3) is 1 g/l, and quantification limit (s/n=10) is 5 g/l. detection of 1 to 50 mg/lselenomethionine produces a linear response (r0.999 6) and the recovery is quantitative around 91.12 %-107.83 %, the rsd1.2 %. the present methods is speficitive, sensitive ,economatic and accurate, and be used in the determination of selenomethionine for the selenium-enriched yeasts materials and relating products.key words: selenomethionine; selenium-enriched yeast; dansyl chloride; hige performance liquid chromatography硒（selenium，se）是人体必需微量元素，存在于抗氧化酶和甲状腺素代谢酶的活性中心1-2，缺硒导 致克山病，合理补硒可有效减少人类及动物罹患癌 症的风险3。蛋氨酸中硫被硒取代后得到硒代蛋氨酸（selenomethionine，semet），是生物利用度最高的有机硒化物4，人体吸收后可在体内形成硒储备池5。富硒酵母是被广泛研究的食品硒补充剂6，在培养基中加 入无机硒，利用酵母将难吸收的无机硒源转化为易吸 收的有机硒源7。clark 等8的临床研究证明将富硒酵母 纳入饮食中作为硒补充剂可减少大约 50 %的癌症发 病率与死亡率。作为硒代蛋氨酸的最经济来源，富硒 酵母中总硒的 70 %76 %以硒代蛋氨酸的形式存在9-10， 富硒酵母中硒代蛋氨酸的含量对评价其质量与营养 价值具有重要意义。目前，国外测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的方法有 高效液相色谱串联电感耦合等离子体质谱法 （hplc-作者简介：韦淑毅（1986），女（壮），硕士研究生，主要从事富硒酵母中活性成分的检测技术研究。* 通信作者 1：熊正河（1957），女，教授级高工，研究方向：发酵类食 品标准的研究与制定。* 通信作者 2：王岁楼（1961），男，教授，博士生导师，工学博士，药 物分析学科食品质量与安全方向。检测分析韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸165icp-ms），高效液相色谱串联质谱法（hplcms），毛细管电泳-电化学发光法（ce-ecl）等，国内相关文献 较少。chassaigne 等11采用稀酸提取，hplc-icp-ms 进 行富硒酵母中有机硒检测；po覥atajko 等12采用水溶液 超声提取，hplc-ms 检测富硒酵母中硒代蛋氨酸；以 上方法采用色谱-质谱联用仪器昂贵，使其应用受到 一定限制。deng 等13采用稀酸提取，ce-ecl 检测富硒 酵母中硒代蛋氨酸；但电泳方法的重现性不高。考虑 到以上方法的不足以及现实生产应用中对检测方法 的要求需兼顾准确性与经济性，本实验针对富硒 酵母中硒代蛋氨酸进行分析，采用酶解法进行样品提 取，通过对样品的色谱分离及衍生等条件进行研究， 建立了丹磺酰氯（dns-cl）柱前衍生高效液相色谱 荧光法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸。磷酸氢钠缓冲液（ph=7.4），40 mg 蛋白酶 xiv，充分混匀后于 37 摇床振摇 24 h。振摇结束后向样品酶解液 中加入 0.1 ml 1.5 g/l 亚铁氰化钾溶液及 0.1 ml 3 g/l 乙酸锌溶液，充分混匀后在 3 000 r/min 下离心 10 min， 取上清液待测，用 80 mmol/l 碳酸钠缓冲液（用 1 mol/l hcl 调节 ph 至 9.5）适当稀释，使样品含量在方法线 性范围内。 样品衍生取 1 ml 稀释后的酶解液于 5 ml 离心管中，加入1 ml 80 mmol/l 碳酸钠缓冲液（ph =9.5），1 ml 丹磺酰 氯（6.0 mg/l，乙腈介质），涡旋混匀，于 60 水浴避光 衍生 2 h，加入 0.1 ml 20 mg/ml 盐酸甲胺溶液终止衍 生反应。避光放置 15 min，0.22 m 有机微孔滤膜过滤 上机检测。取 1 ml 系列不同浓度的硒代蛋氨酸标准工作液， 按照如上方法进行衍生。1.3.3 色谱条件pursuit xrs c18 色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m)；荧 光检测器：激发光波长：320 nm，发射波长：523 nm；柱 温 30 ；进样量为 10 l；流动相为乙腈-10 mmol/l 磷酸二氢钠缓冲液（含 4 %n，n-二甲基甲酰胺 ph=6.55）15；流速为 1.0 ml/min，梯度洗脱程序：（t，乙 腈%）0 min，14 % ；5 min，20 % ；10 min，25 % ；12 min，25.6 %；15 min，25.7 %；19 min，25.9 %；23 min，26.5 %；30 min，27 %；34 min，30 %；38 min，43 %；41 min，68 %；45 min，68 %；47 min，86 %；52 min，86 %。1 材料与方法1.1 材料与试剂富硒酵母原料（硒含量 2 000 g/g）：安琪酵母有 限公司；硒代蛋氨酸（98%）：j&k，scientific ltd； 丹磺酰氯（98 %）：acr譫s organics；蛋白酶 xiv： sigma：乙腈（色谱级）：fisher scientific；盐酸（优级纯）、 无水碳酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）均为北京化 工厂生产；甲胺盐酸盐（分析纯）：国药集团化学试剂有 限公司；n，n-二甲基甲酰胺（分析纯）：西陇化工股份 有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：上海试剂总厂；实验 用水为 milli-q 水。1.2 仪器与设备waters 2695 高效液相色谱仪配荧光检测器：美国 waters 公司；wh-861 型旋涡混合振荡器：太仓市科教 仪器厂；phs-3c 型酸度计：上海雷磁仪器厂；therm ostar-95 型数显恒温水浴锅：浙江省轻工业研究所； hc-3518 型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限 公司；thz-q 型台式冷冻恒温振荡器：太仓市华美生化 仪器厂；ab204-n 型万分之一分析天平：mettler toledo。1.3 测定方法1.3.1 标准储备溶液的配制 称取适量硒代蛋氨酸标准品，用 milli-q 水制成1.0 mg/l 的硒代蛋氨酸标准储备液。称取适量 17 种常 见氨基酸，用 0.1 mol/l 盐酸配成 1.0 mg/l 的氨基酸混 标溶液，以上溶液均置 4 冰箱冷冻保藏14。1.3.2 样品前处理条件 样品提取称取 0.1 g 经冷冻研磨的富硒酵母原料（或 0.5 g富 硒酵母产品），置于 10 ml 离心管中，加入 5 ml 0.05 mol/l2 结果与讨论2.1 样品前处理条件的优化2.1.1 硒代蛋氨酸提取方法的选择酵母细胞壁主要由 -葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白 以及丁几质构成，比较了超声水溶液提取法与酶解提 取法的提取效率,前者按 casiot 等16所述操作，后者按1.3.2 节所述操作。结果显示，酶解提取液中硒代蛋氨 酸浓度为水溶液提取液的 30 倍，说明富硒酵母中硒代蛋氨酸主要以蛋白结合形态存在，因此本试验采用酶 解提取法提取游离态及结合态的硒代蛋氨酸。2.1.2 蛋白酶 xiv 用量选择平行取 5 份 0.1 g 富硒酵母原料样品，分别加入 5、10、20、40、60 mg 蛋白酶 xiv，按照实验方法酶解测定， 酶量在 5 mg40 mg 时硒代蛋氨酸的面积随酶量增加 而增大，在 40 mg60 mg 时硒代蛋氨酸的面积变化较 小，说明 40 mg 蛋白酶 xiv 已经将结合态的硒代蛋氨 酸完全释放出来，结果如图 1，因此本试验采用蛋白酶/积500 000面峰 ） 400 000 s酸 v 300 000/氨 200 000蛋 （ 100 000硒0510204060蛋白酶 xiv 用量/mg图 1 不同蛋白酶 xiv 使用量对酶解效率的影响fig.1 effect of different protease xiv usages on enzymatic efficiency检测分析韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸166xiv 的用量为 40 mg。表 1 不同衍生试剂浓度与衍生时间下所得的加标回收率table 1 the recovery of spiked sample extract with differentdns-cl concentrations and derivative time丹磺酰氯溶液浓度（/ mg/l）衍生时间/h加标回收率/%2.02.04.04.06.06.012121264.476.480.785.891.1102.2衍生条件的优化在 25 的碳酸钠缓冲体系中，丹磺酰氯与一级、二级甚至三级氨基官能团进行荧光标记，灵敏度达1 g/l17，反应 ph、衍生剂浓度、衍生温度与时间都对 衍生反应产率有一定的影响18。相关文献15，19-21提及， 当反应缓冲体系 ph 为 9.5 时，衍生效果最好；在前人 研究的基础上，本试验采用 80 mmol/l（ph 9.5）碳酸钠 缓冲液为衍生反应溶液，衍生温度为 60 ，重点对衍生剂浓度与衍生时间进行了优化。以富硒酵母原料为待测样品，综合考察在不同衍 生剂浓度及衍生时间下加标回收率的水平，结果如表1 所示，当丹磺酰氯浓度为 6.0 mg/l，衍生时间为 2 h时，回收率较理想。2.2 色谱条件的优化富硒酵母基质中含有多种氨基酸对硒代蛋氨酸 的测定产生一定的干扰，试验采用 10 mmol/l 磷酸氢 钠缓冲液（含 4 % n，n-二甲基二甲胺，ph 6.55）-乙腈 为流动相15，依据的酵母基质特性对梯度洗脱的方法进行了优化，最终在 1.3.3 色谱条件下，酵母中常见的17 种氨基酸与硒代蛋氨酸获得了良好分离，图 2 为 17 种常见氨基酸与硒代蛋氨酸衍生物的色谱图, 图 3 为 酵母样品衍生的色谱图。2.1.32 000.001 800.001 600.001 400.001 200.001 000.00800.00600.00400.00200.000.00-200.00-400.00-600.002110.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00时间/min1.硒代蛋氨酸（selenomethionine）；2.蛋氨酸（methionine）17 种常见氨基酸与硒代蛋氨酸混标衍生物的液相色谱图chromatogram of the standards of 17 common amino acids and selenomethionine图 2fig.2700.00600.00500.00400.00300.00200.001100.000.008.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00时间/min1.硒代蛋氨酸（selenomethionine）图 3 富硒酵母样品衍生的色谱图fig.3 chromatogram of selenium-enriched yeastfluorescencefluorescence检测分析韦淑毅，等：高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸1672.3 方法的线性范围与检出限、定量限取硒代蛋氨酸储备溶液逐级稀释成 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/l 的系列标准工作液，按试验方法衍生后 测定，以峰面积 y 为纵坐标，质量浓度 x（mg/l）为横坐 标绘制标准工作曲线。结果表明：在 1.0 mg/l50.0 mg/l 时，硒代蛋氨酸质量浓度与峰面积有良好的线性关系（r=0.999 6），回归方程 y=122 459x-48 813，检出限（以s/n=3 计）为 1 g/l，定量限（以 s/n=10 计）为 5 g/l。2.4 方法的重复性取同一份富硒酵母样品 6 份，按照上述方法测定 硒代蛋氨酸含量，方法的相对标准偏差小于 1.2 ，表 明该方法具有良好的重复性。2.5 加标回收率实验取富硒酵母样品 4 份，加入不同量硒代蛋氨酸标 准液，按照试验方法测定，计算加标回收率。由表 2 可 见，硒代蛋氨酸的加标回收率在 91.12 %107.83 %之间。分离条件研究：选择丹磺酰氯进行柱前衍生，并对衍生剂浓度及衍生时间进行了优化，采用磷酸二氢钠 缓冲液和乙腈进行梯度洗脱，硒代蛋氨酸与富硒酵母 中常见氨基酸及其它基质干扰组分得到有效的分离； 方法加标回收率在 91.12 %107.83 %之间，相对标准 偏差1.2 %。该方法相对于液相色谱-icp 质谱法，普 及性强，操作简单，兼顾准确性和经济性等特点，适合 运用于实际生产对富硒酵母中硒代蛋氨酸进行定量 分析。参考文献：1rayman p r.the importance of selenium to human healthj.lancet,2000, 356(9):233-241birringer m, pilawa s, floh l. trends in selenium biochemistry j. nat prod rep, 2002, 19(6):693-718rayman p r.the argument for increasing selenium intake j.procnutr soc, 2002, 61(2):203-215schrauzer g n. the nutritional significance, metabolism and toxicology of selenomethioninej. adv food nutr res, 2003, 47:73-112wang zijian,zhou jie,peng an.metabolic differences and simil- arities of selenium in blood and brain of the rat following the administration of different selenium compoundsj.biol trace elem res, 1992, 33(1):135-143reyes l h, encinar j r, marchante -gayn j m, et al. seleniumbioaccessibility assessment in selenized yeast after in vitrogas trointestinal digestion using two -dimensional chromatography and mass spectrometryj. j chromatogr a,2006,1110(1):108-116smith a m, picciano m f. relative bioavailability of seleno -compounds in the laboratory rat j. j nutr,1987,117(4):725-731clark l c, combs g f, turnbull b w, et al. effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skinj. j am med assoc,1996,276(24):1957-1963kotrebai m, bird s m, tyson j f, et al. characterization of selenium species in biological extracts by enhanced ion -pair liquid chro matography with inductively coupled plasma-mass spectrometry and by referenced electrospray ionization -mass spectrometry j.spectrochim acta part b, 1999, 54(11):1573-1591234表 2 硒代蛋氨酸加标回收率实验table 2 recovery results of standard addition of selenomethionine in yeast enzymatic extrat5基质本底（/ mg/l） 加入量（/ mg/l）回收率/%酵母酶解提取液72.648.567.997.0107.8107.791.162.6 富硒酵母样品中硒代蛋氨酸的测定根据建立的方法对 5 种不同富硒酵母样品及普通 酵母进行检测，结果见表 3。表 3 富硒酵母原料及产品中硒代蛋氨酸的测定结果table 3 the detection results of selenomethionine in selenium- enriched yeasts materials and related products78标识硒含量/（g/g）硒代蛋氨酸含量/（g/g）总硒回收率/%样品9富硒酵母原料富硒酵母产品 1# 富硒酵母产品 2# 富硒酵母产品 3# 富硒酵母产品 4# 面包酵母2 000.0357.140.040.0 未标识 未标识3 779.1435.191.464.8341.965.210 larsen e h,hansen m,fan t,et al.speciation of selenoamino acids,selenonium ions and inorganic selenium by ion exchange hplc with mass spectrometric detection and its application to yeast and algae j. anal at spectrom, 2001, 16 (2):1403-140811 chassaigne h, chry c c, bordin g, et al. development of newanalytical methods for selenium speciation in selenium -enriched yeast materialj. j chromatogr a, 2002, 976(1):409-42212 po覥atajko a, liwka -kaszyska m, dernovics m, et al. a systematicapproach to selenium speciation in selenized yeastj.j anal at spec- trom, 2004, 19(1):114-12013 deng biyang,shi aihong,li linqiu,et al.determination of selenom-ethionine in selenium-enriched yeast using capillary electrophore3 结论本文建立了丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法 检测富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。重点对样品提取方法和衍生方法进行了研究。1）样品提取方法研 究：对酶解提取和超声提取富硒酵母中硒代蛋氨酸方法进行比较，结果表明酶解法测定结果远大于超声水 溶液提取法，并对酶用量进行优化，有效提高了富硒酵母中硒代蛋氨酸的提取效率。2）硒代蛋氨酸衍生及食品研究与开发food research and development2012 年 8 月第 33 卷第 8 期检测分析168一种测定口香糖中vc 的方法邓鸿铃（广东食品药品职业学院 食品科学系，广东 广州 510520）摘 要：针对目前国标没有口香糖中 vc 含量的检测方法，结合已有国标 vc 测定方法的基础上进行改良试验。对口香糖样品进行快速溶解，使样品中的 vc 溶解进入含有乙酸的溶液中，与固蓝盐 b 反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰 内酯衍生物。在其最大吸收波长 420 nm 处，用紫外可见分光光度计测定其含量。本方法的线性范围 1 g/ml20 g/ml， 检出限为 1 g/ml，样品加标回收率在 90.9 %98.6 %，相对标准偏差为 1.57 。 关键词：紫外可见分光光度计；vc；口香糖determination method of vc from chewing gumdeng hong-ling（guangdong food and drug vocational college ，guangzhou 510520, guangdong, china）abstract：no chewing gum for the current national standard content of vitamin c detection methods, combined with vitamin c has been the national standard based on the determination of improved tests. the method is rapid dissolution of the gum samples, the sample of vitamin c dissolved into the solution containing acetic acid, and the reaction of fast blue salt b yellow grass hydrazide -2 -hydroxybutyrate acid lactone derivatives. at its maximum absorption wavelength at 420 nm, using uv-vis spectrophotometer and its content. the linear range of 1 g/ml -20 g/ml, the detection limit was 1 g/ml, the recovery rate in the 90.9 % to 98.6 % , relative standard deviation was 1.57 %.key words：uv-visible spectrophotometer; vitamin c; gum作者简介：邓鸿铃（1977），男（汉），高级工程师，硕士，主要从事食品安全及食品检测技术的研究工作。!sis on -line coupled with electrochemiluminescence detection j.microchim acta, 2009,165(3/4):279-28314 pyrzyska k. analysis of selenium species by capillary electrophore sisj. talanta, 2001,55(4):657-66715 chen tianfeng,zheng wenjie, luo yon