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医用高分子材料甲壳胺的生物安全评价研究 功能高分子材料 教师：彭桂荣 张海全 姓名：王姗 班级：09级焊接 学号：090102010010医用高分子材料甲壳胺的生物安全评价研究功能高分子材料一般指具有传递、转换或贮存物质、能量和信息作用的高分子及其复合材料，或具体地指在原有力学性能的基础上，还具有化学反应活性、光敏性、导电性、催化性、生物相容性、药理性、选择分离性、能量转换性、磁性等功能的高分子及其复合材料。功能高分子材料是上世纪60年代发展起来的新兴领域，是高分子材料渗透到电子、生物、能源等领域后开发涌现出的新材料。近年来，功能高分子材料的年增长率一般都在10以上，其中高分子分离膜和生物医用高分子的增长率高达50。 功能高分子材料按照功能来分类1.化学功能 离子交换树脂、螯合树脂、感光性树脂、氧化还原树脂、高分子试剂、高分子催化剂、高分子增感剂、分解性高分子等. 2.物理功能 导电性高分子（包括电子型导电高分子、高分子固态离子导体、高分子半导体）、高介电性高分子（包括高分子驻极体、高分子压电体）、高分子光电导体、高分子光生伏打材料、高分子显示材料、高分子光致变色材料等. 3.复合功能 高分子吸附剂、高分子絮凝剂、高分子表面活性剂、高分子染料、高分子稳定剂、高分子相溶剂、高分子功能膜和高分子功能电极等. 4.生物、医用功能 抗血栓、控制药物释放和生物活性等 .甲壳胺是由氨基葡糖和乙酰氨基葡糖聚合物组成的多糖，它可由甲壳中的甲壳素部分脱乙酰化而得到。它也在某些微生物和酵母菌中天然存在。甲壳胺一词系指一系列具有不同分子量(50 kDa2000 kDa)、粘度和脱乙酰度(40%98%)的甲壳胺聚合物。甲壳胺不溶于中性和碱性溶液，但可与无机酸和有机酸如谷氨酸、盐酸、乳酸和醋酸形成盐。聚合物的氨基被质子化，产生的可溶性多糖带有正电荷。最常用的甲壳胺盐是谷氨酸盐和盐酸盐。甲壳胺盐可溶于水中，溶解度取决于脱乙酰度和pH值。较低脱乙酰度(40%)的甲壳胺可溶于pH高达9的溶液，而脱乙酰度大约85%的只能溶于pH6.5以下的溶液。溶液中加入盐可显著影响甲壳胺的溶解度。离子强度越高，溶液度越低。甲壳胺溶液的粘度随甲壳胺浓度的增加而增加，温度升高粘度降低。粘度也随甲壳胺脱乙酰度的增大而增加，这是因为高、低脱乙酰度的甲壳胺具有不同的分子构象。高脱乙酰度的甲壳胺分子高度电离，具有一个更灵活的链状伸展构象。而低脱乙酰度的甲壳胺分子，由于低电离度，具有条状或卷曲状构象。在制药工业中，甲壳胺用于开发药物控释给药系统的可能性已被广泛探讨。这是因为它具有独特的聚合阳离子特性、胶凝性和成膜性。这些给药系统应能控制药物给药速度，延长有效治疗作用时间，也可能将药物向特定的部位靶向给药。文献已报道大量的给药系统，包括微粒系统、控释骨架、溶蚀性骨架和控释凝胶系统。将甲壳胺和甲壳胺的衍生物与其他辅料合用，制备具控释特性的片剂，发现药物的释放速率，在某种程度上，与使用的甲壳胺的量和类型直接相关，且可得到零级释药模型。大多数可形成凝胶的聚合物在高pH值时形成凝胶，因此甲壳胺可用于肠控释是显然的。用甲壳胺、Carbomer?934P和柠檬酸的水合胶体骨架系统制备了茶碱控释片，发现甲壳胺的用量超过片重的50%时，可形成非溶蚀型骨架片，而当用量小于33%时，可形成快速释放骨架片。甲壳胺的用量小于10%，可作崩解剂。制备片剂时加入藻酸钠使片子有更广泛的释药特性。柠檬酸能使甲壳胺凝胶化，因此影响控释特性，Carbomer使甲壳胺的崩解性能下降。Akbuga研究了甲壳胺马来酸盐骨架片的释放特性与药物理化性质的关系，发现药物溶解性、解离度和分子量是重要的影响因素。Illum等首先提出甲壳胺能够进行极性小分子和肽类和蛋白质药物的透粘膜吸收。在羊模型中，他们发现一种鼻用胰岛素处方中加入甲壳胺，引起血浆葡萄糖水平下降到原水平的43%，相比之下，未加甲壳胺的处方只下降到原水平的83%。同时，血浆胰岛素水平从34 m IU/1增加到191 mIU/l，AUC增加7倍。对其它小分子量药物也得到相似结果，如在自然界中极化的吗啡和抗偏头痛药物以及肽类如降钙素、去氨加压素、戈舍瑞林、甲状旁腺素释放激素和亮丙瑞林。对人类志愿者的研究结果证实了羊试验结果。 甲壳胺可以简单的溶液剂(浓度0.51.0%)形式被应用，也可通过喷雾干燥制备甲壳胺微球。此种粉末处方与甲壳胺溶液相比，对药物透过细胞膜转运促进作用更强。在羊模型试验中，对肽类药物(戈舍瑞林、亮丙瑞林和甲状旁腺素)，甲壳胺粉末和微球的生物利用度达到2040%。临床试验结果也证实了动物试验结果。与鼻腔吸收研究一致，Rentel等报道甲壳胺也能促进肽类药物9?脱甘氨酰胺?8?精氨酸加压素溶液大鼠肠圈给药的透粘膜吸收。后来的试验结果表明，甲壳胺对甘露醇穿透Caco2细胞的作用取决于脱乙酰度和甲壳胺的分子量。最近，也有报道甲壳胺溶液可增加布舍瑞林50%肠吸收。甲壳胺的衍生物也有相似的吸收促进作用。N?三甲氯化甲壳胺水溶性较好，因此比甲壳胺本身更易于制备固体口服剂型。含有甲壳胺的固体剂型的研究较少成功，是由于甲壳胺以粉末形式溶解缓慢的原因。对肽类如胰岛素和降钙素的大鼠和猪模型试验研究，得到相似结果。最近，有报道甲壳胺(很有可能是由于它的吸收促进作用)能作为一种材料用于增强疫苗透粘膜途径如鼻腔给药的免疫反应。当通过鼻腔或注射给药时，甲壳胺本身不能产生体液免疫反应。Gill等报道含有抗原血球凝集素丝(FHA)和百日咳类毒素或只含有FHA的百日咳疫苗，与甲壳胺结合鼻腔给药，得到与腹膜内注射给药相似的血浆IgG水平，在鼻腔洗液中得到非常高的分泌IgA水平。相比之下，不含甲壳胺的注射入方，在鼻腔洗液中检测不到IgA水平，而不含甲壳胺的鼻腔处方，IgA水平很低。含有甲壳胺的流感疫苗鼻腔给药，与皮下注射相比，发现相似的高度促进免疫反应作用。 不同研究小组广泛研究了甲壳胺促进药物透粘膜转运的机理，认为是细胞膜上紧密结合点的短暂开放允许极性药物通过以及生物粘附作用结果。?闪烁法清楚说明甲壳胺具生物粘附性，对人类志愿者鼻腔应用对照溶液、甲壳胺溶液和甲壳胺粉末，鼻腔清除时间分别为25、40和80分钟。脉冲追踪研究进一步显示，甲壳胺的透粘膜吸收促进作用是短暂的，溶液给药后3045分钟后作用下降。甲壳胺对模型细胞膜的作用总结性地说明，甲壳胺很有可能由于它的正电荷与紧密结合点的开放结构相互作用，正象看到的ZO?1蛋白下降和细胞骨架蛋白FActin从丝状变成球状结构。关于甲壳胺在医疗器械领域的开发应用尚在起步阶段,尚未见有类似的针对甲壳胺的生物安全性的全面评价的报道,因此本研究为甲壳胺的生物安全性作了全面评价。目的:从热原、急性毒性、溶血、皮内刺激、体外细胞毒性、潜在皮肤致敏性、沙门氏菌回复突变、染色体畸变(体内哺乳动物骨髓细胞微核实验)、精子致畸和亚慢性毒性几个方面对甲壳胺的生物安全性进行较全面的评价。 方法:在热原试验中,将一定剂量供试品静脉注入家兔,观察发现3只试验用兔的体温升高情况;在急性全身毒性试验中,将供试品分别通过静脉和腹腔给予昆明鼠,在注射后4、24、48、72h观察试验组和对照组昆明鼠的一般状态、毒性表现和死亡动物数,以及72h后的动物体重;在溶血试验中,将新鲜制备的抗凝兔血加入供试品中,观察各组是否出现溶血现象,并测其吸光度;在皮内刺激试验中,将供试品注射于家兔背部,观察接种点的红斑和水肿情况,并计算皮内刺激反应指数;在体外细胞毒性试验中,将供试品与特定细胞系接触,评价其对细胞的毒性作用和程度,并用MTT法测定细胞相对增殖率;在潜在皮肤致敏试验中,受试动物经供试品的两步诱导和激发后,观察激发部位皮肤情况;在AMES试验中,通过点滴板评价技术选择对测交品系无抑制作用的提取液,用标准平板掺入方法进行测试,观察各组的菌落生长情况,并计算被测样品菌落计数平均值与阴性对照菌落计数平均值的比值;在微核试验中,将受试品腹腔给予受试动物,取其双侧股骨内骨髓,制备涂片,油镜观察,计算各组PCEs占红细胞总数的比值,用作骨髓毒性的指示,并进行统计学比较;在精子畸形试验中,将受试物腹腔给予受试动物,分离附睾,制作涂片,观察结构完整的1000个精子,计数其中畸形的精子,计算畸形精子发生率,采用秩和检验分析试验组的精子畸变率与阴性对照组之间的差异;在亚慢性毒性试验中,将测试样品无菌植入受试动物腹股沟面的皮下囊袋中,在整个植入期内,每周称重一次,并逐个进行详细的临床检查。植入期结束后,进行实验室观察和病理解剖,并对观察结果进行分析。 结果:热原实验中,3只家兔的体温升高均低于0.6,且3只家兔的升温总和低于0.6,可以认为甲壳胺没有致热性。在急性毒性试验中,注射后立即观察昆明鼠,没有出现不良反应,在注射后4、24、48、72h继续观察试验组和对照组昆明鼠的一般状态、毒性表现和死亡动物数,以及72h后的动物体重,结果表明试验组动物症状和体重的变化都在可接受的范围之内,可以认为甲壳胺无急性全身毒性作用。溶血试验中阳性对照管中观察到溶血现象,试验品和阴性对照管中未见溶血现象。移入比色皿内测吸光度,得到试验组溶血率为0.7%,5%,结果表明,甲壳胺-生物止血愈合海绵没有引起溶血反应。皮内刺激试验中,皮内刺激反应指数为0.89,表明该试验品有轻微刺激作用。体外细胞毒性试验中,显微镜下观察可见阳性对照呈现明显的细胞毒性,空白及阴性对照细胞形态正常,试验组观察到有极轻的毒性。定量测试结果表明,试验品毒性为1级,空白对照为0级,而阳性对照为4级。定量测试和定性测试的结果均表明,甲壳胺-生物止血愈合海绵具有极轻的细胞毒性。潜在皮肤致敏试验中,SC组和CSO组的致敏反应情况相同,二者的试验组和阴性对照组的红斑和水肿记分等级均为0,而阳性对照组的红斑和水肿记分等级均1。所以在本项试验条件下,甲壳胺-生物止血愈合海绵无潜在皮肤致敏性。AMES试验中,各个菌株的阴阳性的自发回变菌落数均按预期生长,阴性对照在各自的范围内,阳性对照回变菌落数均至少为阴性的2倍以上,试验样品回变菌落数与阴性对照基本无差异。计算被测样品菌落计数平均值与阴性对照菌落计数平均值的比值均介于0.5和2之间,表示菌株生长未受抑制,且受试品对各受试菌株无诱导作用。因此,本研究中试验品提取液对各试验菌株没有诱导性,不具有致突变作用。微核试验中,各组PCEs占红细胞总数的比值的差别均无统计学意义,计算各组MPCEs在PCEs中所占的数量,阳性对照的雌雄两组与样品组(SC)的雌雄两组的差别均有统计学意义,与样品组(CSO)的雌雄两组的差别也均有统计学意义,阴性对照(SC和CSO)与样品组(SC和CSO)的差别均无统计学意义。本次试验结果表明,试验组没有出现细胞毒性的迹象,可以认为被测样品浸提液不会对小鼠产生遗传毒性。精子畸形试验中,试验组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较差异无显著性(P0.05),而CP阳性对照组与阴性对照组比较有显著差异(P0.05)。结果表明在本次研究的条件下,被测样品浸提液并未表现出对小鼠产生遗传毒性的迹象。亚慢性毒性试验中,在整个试验期间,试验组和对照组对比,大鼠的一般行为、体重增长、进食、尿常规、血液学、血生化、脏器重量及病理检查均未见显著性差异(P0.05)。在本次研究条件下,我们认为甲壳胺植入皮下组织92天后,没有导致毒性效应的特异性变化,不会引起亚慢性毒性。 结论:甲壳胺作为生物止血愈合海绵在本研究的试验条件下,无致热性,不会引起急性全身毒性反应和溶血反应,对皮肤、粘膜有轻微刺激作用,但在可接受范围内,具有轻微的细胞毒性,对皮肤无潜在致敏性,无致突变作用,无遗传毒性,因此,可以认为甲壳胺作为生物止血愈合海绵具有较高的生物安全性。参考文献：易义珍,陈律,唐明德;交通性污染物对小鼠遗传毒性的影响J;癌变畸变突变;