（动物遗传育种与繁殖专业论文）spb蛋白在es小鼠中的表达分析.pdf

摘要 小鼠胚胎干( e m b 巧o m cs t e r i l ，e s ) 细胞与四倍体胚胎有不同的发育潜能，四倍体胚 胎仅参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系( 如绒毛膜外胚层、滋养巨细胞等) 的生 成，而e s 细胞广泛参与胚体、羊膜、尿囊、卵黄囊中胚层和绒毛膜中胚层的生成， 不参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系的生成。利用四倍体胚胎补偿技术就可以得 到完全由e s 细胞发育而来的小鼠。 包括e s 小鼠在内的许多克隆动物都死于呼吸衰竭，呼吸衰竭征是指新生有活力 的e s 小鼠( 有短暂的呼吸现象) 在出生后立刻表现进行性呼吸困难、皮肤青紫，其寿 命不会超过1 小时，肺部病理表现为肺泡扩张不全和肺泡壁增厚，而且，这种呼吸衰 竭征是导致新生e s 小鼠死亡的主要疾病。这种新生e s 小鼠呼吸衰竭征的临床和病 理表现与人类儿科医学中的新生儿呼吸窘迫综合征( n e o n 砌r e s p i r a t o 巧d i s t r e s s s y n d r o m e ，n r d s ) 非常相似，n r d s 是由于肺表面活性蛋白( s u f f a c t 锄tp r o t e i n ，s p ) 缺 乏导致肺泡塌陷而引起的，现已在小鼠发现4 种s p ：s p a 、s p b 、s p c 、s p d 。在 研究四种s p 功能过程中发现s p b 基因打靶小鼠和因突变而导致s p b 基因缺失的新 生儿在出生后都很快死于呼吸衰竭，所以s p b 对于维持肺泡的正常功能起着关键作 用。据此我们推断：新生克隆动物的呼吸衰竭征很可能是由于s p b 的异常表达引起 的。 酚提法提取1 2 只成年e s 小鼠的1 2 种组织( 肺、肝、脑、胰、肠、膀、胃、心、 睾丸或卵巢、脾、肾、肌肉) 和7 只新生死亡e s 小鼠的4 种组织( 心、肝、脑、肌肉) 的d n a ，选取5 个微卫星位点d 2 m i 9 9 3 、d j o m i t l 3 4 ，d 5 m i t l 3 8 、d j 6 m i t l 8 9 和 d 5 m i 乃4 6 ，进行p c r 扩增，检测1 9 只e s 小鼠的组织嵌合度，结果表明1 9 只e s 小 鼠完全由e s 细胞发育而来。 取1 只死于呼吸衰竭的新生e s 小鼠的肺脏，做常规组织切片，苏木精一伊红染 色，显微镜观察其病理变化。和对照组相比，发现死于呼吸衰竭的新生e s 小鼠的肺 泡明显扩张不全，且肺泡壁增厚。 分别取1 2 只成年e s 小鼠、6 只死于呼吸衰竭的新生e s 小鼠及成年对照小鼠和 新生对照小鼠的肺组织，裂解液充分消化，离心后取上清即为提好的蛋白。用免疫印 迹法，即w e s t e r nb l o t 检测s p 。b 蛋白的表达，结果表明成年e s 小鼠肺脏组织中的 s p b 表达减少，即使那些外表正常的成年e s 小鼠，其s p b 的表达也明显低于对照 组成年小鼠，而在死于呼吸衰竭的e s 小鼠中，没有检测到s p b 的表达，这些结果 说明，呼吸衰竭征很可能是由于s p b 的严重表达不足引起的，而适度减少表达可能 并不会影响e s 小鼠的正常存活。 关键词：e s 小鼠；呼吸衰竭综合征；肺表面活性蛋白b ；四倍体胚胎补偿技术 e x p r e s s i o no f s u r f a c t a n tp r o t e i nb i nm i c ed e r i v e d c o m p l e t e l yf r o me m b r y o n i cs t e mc e l l s m a s t e rc a n d i d a t e ：g a os h u m i n s u p e r v i s o r ：p r o f il ix i a n g y u n m a j o r ：a n i m a lg e n e t i c s ，b r e e d i n ga n dr e p r o d u c t i o n a b s t r a c t m o u s ee m b r y o n i cs t e m ( e s ) c e l l sa n dt e t r a p l o i de m b r y o sh a v ed i f f e r e n td i s t r i b u t i o n m y 0 墩s a ce n d o d e r ma n dt h et r o p h o b l a s tc e l ll i n e a g e sa r et e t r a p l o i de m b r y o - d e r i v e d ， w h e r e a st h ee m b r y op r o p e r , t h ea m n i o n ，t h ey o l ks a cm e s o d e r m ，t h ea l l a n t o i s ，a n dt h e c h o r i o n i cm e s o d e r m d e r i v e dp a r to ft h ep l a c e n t aa r ec o m p l e t e l ye sc e l l d e r i v e d t h u s ，w e c a no b t a i nt h ee sm o u s ec o m p l e t e l yf r o me sc e l l sw i t ht h em e t h o do ft e t r a p l o i de m b r y o c o m p l e m e n t a t i o n m a n yc l o n ea n i m a l sd i e do fr e s p i r a t o r yd i s t r e s si n c l u d i n ge sm o u s e t h er e s p i r a t o r y d i s t r e s sw i l t st h em a i nd i s e a s er e s u l t i n gi nd e a t hi nn e o n a t a le sm o u s e t h el i f es p a no f t h o s ea n i m a l sw a sl e s st h a na nh o u r 1 1 1 ec l i n i c a la n dp a t h o l o g i c a lf e a t u r e so fr e s p i r a t o r y d i s t r e s sa r es i m i l a rt on e o n a t a lr e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ( n r d s ) i nc l i n i c a lp e d i a t r i c s n r d sr e s u l t sf r o mi n s u f f i c i e n tl e v e l so fp u l m o n a r ys u r f a e t a n tp r o t e i n ( s p ) p u l m o n a r y s u r f a c t a n tp r o t e i ni se s s e n t i a lf o rt h ee x p a n s i o no ft h ea l v e o l ii nt h el u n g s ，a n di t s d e f i c i e n c yc a u s e st h ea l v e o l it oc o l l a p s e , p r e v e n t i n gt h ei n f a n t sf r o mb r e a t h i n gp r o p e r l y s of a r , f o u rs ph a v eb e e nf o u n di nm o u s e ：s p - a ，s p b ，s p ca n ds p - d ，i np a r t i c u l a rs p - b ， h a v eb e e ns h o w nt ob ec r i t i c a lf o rn o r m a la l v e o l a rf u n c t i o n t r a n s g e n i cn e w b o r nm i c e l a c k i n gt h es p bg e n ef a i lt oi n f l a t et h e i rl u n g sa n dd i eo fr e s p i r a t o r yd i s t r e s ss h o r t l ya f t e r b i r t h , s ow ed e d u c et h a tr e s p i r a t o r yd i s t r e s sm a y b em a i n l yr e s u l t i n gf r o ma b n o r m a l e x p r e s s i o no fs p bi nn e o n a t a lc l o n ea n i m a l s g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o m12t i s s u e s ( 1 u n g , l i v e r , b r a i n ，p a n c r e a s ，i n t e s t i n e ， b l a d d e r ，s t o m a c h , h e a n ，t e s t i so ro v a r y ，s p l e e n ，k i d n e y ，m u s c l e ) o fa d u l te sm i c ea n df r o m 4t i s s u e s ( h e a r t ，l i v e r , b r a i n ，m u s c l e ) o fn e w b o me sm i c ed i c do f r e s p i r a t o r yd i s t r e s s p c r a m p l i f i c a t i o n o ff i v em i c r o s a t e l l i t ed n a1 0 c i ，d 2 m i t 4 9 3 ，d 1o m i t l 3 4 , d i6 m i t l 8 9 , d 5 m i t l 3 8a n dd 5 m i t 3 4 6t od e t e c tt h et e t r a p l o i de m b r y oc o n t r i b u t i o ni ne sm i c et o d e t e r m i n ew h e t h e rt h e s ee sm i c ea led e r i v e dc o m p l e t e l yf r o me sc e l l s t h ed a t as u g g e s t t h a te sm i c ea r ed e r i v e dc o m p l e t e l yf r o me sc e l l s l u n g sw e r ec o l l e c t e df r o mo n eo ft h en e o n a t a le sm i c ew i mr e s p i r a t o r yd i s t r e s sa n da n o r m a ln e o n a t a lm o u s ea n ds u b m i t t e df o rr o u t i n eh i s t o p a t h o l o g i e a la n a l y s i s h i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o no ft h el u n g sr e v e a l e de x t e n s i v ea t e l e c t a s i s ，a l v e o l ic o l l a p s e ，a n dt h i c k e n e d a l v e o l a rw a l li nt h ee sm i c e 、 ，i lr e s p i r a t o r yd i s t r e s s ，w h e r e a st h el u n g so fn o r m a l n e o n a t a lm i c ew e r ef u l l yi n f l a t e da n dt h ea l v e o l iw e r ee x p a n d e d l u n gp r o t e i n sw e r ee x t r a c t e dr e s p e c t i v e l yf o r m12a d u l te sm i c e ，6n c n o t a le sm i c e d i e do fr e s p i r a t o r yd i s t r e s sa n dc o n t r o lm i c e t h e nw ed e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no fs p b 、) l ，i t l l w e s t e r nb l o t w eo b s e r v e dw e a k e rs p be x p r e s s i o ni nt h ea d u l te sm i c et h a ni nt h en o r m a l a d u l tm i c e s i m i l a r l y , w eo b s e r v e dn os p be x p r e s s i o ni nt h en e o n a t a le sm i c ew i t h r e s p i r a t o r yd i s t r e s sa n ds l i g h ts p be x p r e s s i o ni nt h en o r m a ln e o n a t a lm i c e t 1 1 e s ed a t a s u g g e s tt h a ts e v e r el a c k i n gs p bm a yb et h ek e yr e a s o nr e s u l t i n gi nr e s p i r a t o r yd i s t r e s s ， h o w e v e rt h es u r v i v a lw o n tb e e na f f e c t e db ym o d e r a t ed e c r e a s eo fs p bi ne sm i c e k e y w o r d s ： e sm i c e ；r e s p i r a t o r yd i s t r e s s ；p u l m o n a r ys u r f a c t a n tp r o t e i nb ；t e t r a p l o i d e m b r y oc o m p l e m e n t a t i o n 缩略语表 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰堡垒些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：喜链良答乙签字日期：。2 椭8 年舌月。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：嘉诂晷乙 导师签名：万钥日迪 签字日期：如8 年6 月，q 日 签字日期：幽8 年月p 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： s p - b 蛋白在e s 小鼠中的表达分析 1 1e s 小鼠的制备 1 引言 1 9 9 7 年w i l m u t 等【l 】利用绵羊乳腺细胞进行核移植实验获得了世界首例体细胞克 隆绵羊- - d o l l y 。d o l l y 的诞生为体细胞克隆时代的来临拉开了序幕，此后小鼠t 2 1 、牛 【3 羽、山羊【6 1 、猪【7 1 、猫8 1 、兔【9 】、骡子【1 0 】、马【1 、大鼠【1 2 】等动物的体细胞克隆后代也 相继诞生。但是利用核移植技术制备克隆动物的效率比较低下，特别是以分化终端的 体细胞作为核供体时，几乎不能得到克隆动物。然而，在小鼠上，利用胚胎干 ( e m b r y o n i cs t e m ，e s ) 细胞与四倍体胚胎嵌合技术可以高效获得成年且有生殖能力的 完全由e s 细胞发育而来的小鼠i 2 0 】，即e s 小鼠。 e s 细胞是从附植前胚胎内细胞团( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 经体外分化抑制培养而 分离出来的，具有发育的多能性或者全能性的细胞，它在体外培养可以形成包含内胚 层、外胚层和中胚层在内的类胚体。国际上通用的e s 细胞系大多是从1 2 9 品系小鼠 中获得的。随着e s 细胞建系技术的日臻完善，从9 0 年代开始，陆续报道从 c 5 7 b l 6 2 h 、( c 5 7 b l 6 x c b a ) f 1 2 2 1 、b a l b c 2 3 1 、c 3 h h e 2 4 、c b a 2 5 1 、p 0 1 2 6 1 等品系 以及疾病模型小鼠d b a l l a c j t 2 7 1 、m r l ( 2 8 1 、t w 5 t w 5 1 2 9 1 、n o d t 3 0 l 等建立了e s 细胞系。 除小鼠外，在仓鼠【3 l 】3 1 、牛【3 2 3 6 】、猪 3 2 , 3 3 , 3 7 - 4 1 】、貂1 4 2 、兔 4 3 , 4 4 1 、大鼠【4 5 】、恒河猴4 6 1 、鱼 【4 7 1 、鸡【4 8 1 以及人类【协5 1 】等物种也建立了类e s 细胞系。 小鼠e s 细胞与四倍体胚胎有不同的发育潜能，在二者分别与二倍体胚胎所形成 的嵌合体中，四倍体胚胎仅参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系( 如绒毛膜外胚层、 滋养巨细胞等) 的生成，而e s 细胞广泛参与胚体、羊膜、尿囊、卵黄囊中胚层和绒 毛膜中胚层的生成，不参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系的生成【5 撕6 j 。如果采用 四倍体胚胎补偿技术，即将e s 细胞注入四倍体囊胚腔( 注射法) 或与四倍体桑椹胚聚 合( 聚合法) ，使二者的发育潜能互相补偿，就可以得到完全由e s 细胞发育而来的小 鼠【1 5 1 9 1 。 早在1 9 9 0 年，n a g y 等人就利用该技术得到了完全由d 3e s 细胞发育而来的小鼠 胎儿，但这些e s 小鼠都在围产期死亡，没有得到成年e s 小鼠【l6 1 。后来，n a g y 和 w a n g 等人却从r le s 细胞得到了成年有生殖能力的e s 小鼠，但效率很低( 1 7 一3 0 ) 1 7 - 1 8 】。e s 细胞的遗传背景的杂合度是影响e s 小鼠出生后存活的关键因素【l 圳， e g g a n 等人从3 4 4 枚四倍体胚胎与b 6 1 2 9 s f l 杂种e s 细胞的嵌合胚中得到了5 1 只成 年e s 小鼠( 1 4 8 ) ，而从3 1 2 枚近交系e s 细胞与四倍体胚胎的嵌合胚中仅得到了1 只成年e s 小鼠( o 3 ) 1 1 9 1 。四倍体胚胎的体内外发育能力也是影响e s 小鼠制备的关 键因素【1 4 , 5 2 , 6 7 ，如果嵌合胚中的四倍体细胞的分裂能力很有限，那么，嵌合胚的发育 能力必定会受到严重影响。不同遗传背景的四倍体胚胎的体内外发育能力有显著差 异，如在( c b a c 5 7 b l 撕) f l 四倍体胚胎中，有1 7 一4 2 的胚胎可以发育到妊娠 的第1 4 1 5 天，而大多数近交系四倍体胚胎最多发育至妊娠的第9 天。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 e s 小鼠与核移植小鼠都属于克隆小鼠【1 3 , 5 8 , 5 9 ，但制备e s 小鼠的效率高且操作简 便快捷，特别是聚合法，不需要昂贵的仪器设备、也不需要实验人员熟练的显微操作 技能，对胚胎的发育阶段也无严格限定，容易普及和推广，而且，核移植小鼠表现的 许多发育异常现象( 如胎3 l 巴大、溶血、羊水过多、胎盘肥大、呼吸衰竭、下颚发育 不全、皮肤肿胀、成年肥胖症、血液循环障碍等) 要比e s 小鼠严重很多【l s , 1 9 j 0 ，如在 e s 小鼠中没有发现成年肥胖症，胎儿出生重、胎盘重以及新生胎儿出现呼吸衰竭的 几率也都显著小于核移植小鼠【1 5 , 1 9 ，2 0 ，在9 0 个有关e s 小鼠的形态、生理和神经特征 指标中，只有体重和血液红细胞压积比正常小鼠略高，其余指标均正常 2 0 1 。另外，由 核移植技术克隆的小鼠，它们只是核型一致，胞质类型却不一定相同，而e s 小鼠也 不存在这个问题【1 3 l 。e s 小鼠的生长发育比核移植小鼠更趋于正常，它是一种更为有 效的小鼠克隆方法。 1 2e s 小鼠的用途 随着人类基因组图谱的完成，对基因功能的了解成为新一轮生物医药知识产权市 场的主要内容。我国目前虽然有许多单位通过基因芯片手段克隆了大量基因，但由于 缺乏功能研究的支持，特别是缺乏像小鼠模型这样的最有力的功能研究结果的支持而 不能抢占专利市场。通过对e s 细胞进行遗传修饰( 如基因打靶) 并采用四倍体胚胎补 偿技术，可以迅速获得完全由e s 细胞发育而来的突变个体【删，这为研究基因功能和 构建人类疾病模型小鼠提供了重要途径。例如，利用传统方法要得到某一突变基因的 纯合体，首先由打靶e s 细胞获得嵌合体，随后让嵌合体与野生型个体交配得到突变 基因的杂合体，最后再通过杂合体之间的交配而得到纯合体，这一过程至少要经过3 个小鼠时代，约9 个月时间，如果还想再将另一个突变基因导入该纯合体，那么，该 纯合体与打靶小鼠的交配必然会导致纯合突变等位基因的分离，这又得花时间来纯合 基因。相比之下，通过多轮基因打靶技术，多个突变基因可以被整合在同一个e s 细 胞系中，每一步仅需2 4 周，然后利用四倍体胚胎补偿技术就可快速获得多基因突变 体小鼠。 1 3e s 小鼠组织嵌合度的检测 组织嵌合度检测的目的在于检测e s 小鼠是否由e s 细胞发育而来，目前常用的 是葡萄糖磷酸异构酶( g l u c o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e , g p i ) ，即g p i 生化位点多态检测 和微卫星位点多态性检测两种方法。 1 3 1g p i 检测 g p i 广泛存在于动物体内的所有组织细胞内，在糖代谢中，g p i 在糖酵解和糖异 生中都起非常重要的作用，主要催化六磷酸葡萄糖和六磷酸果糖的互变反应。在小鼠 2 s p b 蛋白在e s 小鼠中的表达分析 中，g p i 的基因位于第7 染色体上，是近交小鼠遗传检测中常用的一个生化标记基因。 在现有的小鼠品系中，g p i 位点只出现了g p i a 、g p i b 、g p i c3 种等位基因【2 0 6 l 】，多态 性非常有限。根据3 个等位基因在不同小鼠品系中的片段大小不同，从而得出结论。 n a g y 等利用葡萄糖磷酸异构酶( g p i ) 生化多态位点分析发现：绝大多数e s 小鼠是完 全由e s 细胞发育而来的，在出生的6 只i c m - 4 n 嵌合体小鼠中，只有1 只小鼠的血 液和尾尖可检测到四倍体胚胎来源的细胞，且比例少于5 ，其余5 只均未检测到有 四倍体细胞的存在；在1 4 只e s 一4 n 嵌合体小鼠中，只有3 只小鼠的血液和尾尖可 检测到4 n 来源的细胞，但比例都少于1 0 【1 6 1 。 1 3 2 微卫星检测 微卫星( m i e r o s a t e l l i t e , m s ) 是指d n a 基因组中小于1 0 个核苷酸的简单重复序 列，又称短串联重复( s h o r tt a n d e mr e p e a t , s t r ) ，是一种普遍存在于人类基因组的重 复序列，一般为2 6 个碱基重复，如( c a ) n 、( g t ) n 、( c a g ) n 等，尤以( c a ) n 重复 序列最为常见。其长度由重复单位的拷贝数决定，是一类呈高度多态的遗传标记，不 仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆，而且可用于遗传性疾病的 连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性，但突变率仅 为5x 1 0 - 4 _ 5x 1 0 5p 在家系中可以稳定地遗传，是一种很好的遗传标志，因此是一种 高灵敏度的分子分析方法【6 2 】。目前，在小鼠基因组中已公布了6 0 0 0 多个微卫星多态 位点，利用丰富的微卫星标记代替g p i 生化标记可以更加简便而精确地分析e s 小鼠 各种组织的嵌合度。 1 4e s 小鼠的呼吸衰竭征 所有的克隆动物都是不正常的，这是由于供体细胞基因组异常的表观遗传状态而 导致的，那些存活至成年或活的稍长的克隆动物只是比早死的克隆动物少一些异常而 已。在众多的克隆动物发育异常( 如胎儿肥大、溶血、羊水过多、胎盘肥大、呼吸衰 竭、下颚不全、皮肤肿胀、成年肥胖症、血液循环障碍等) 中，呼吸衰竭是导致新生 有活力的克隆动物( 有呼吸现象) 死亡的主要原因，e s 小鼠也不例外。哺乳动物在整 个妊娠期间，胎肺不行使呼吸功能，因此，肺的发育异常不会或不足以导致胎儿流产 或死亡，那些出生前就死亡的克隆动物可能主要是由于肺以外其他脏器的发育异常所 致，而肺的发育异常只有在克隆动物出生后才会表现出来，事实也证明了这一点，不 管是e s 小鼠，还是核移植动物，出生后死亡的一个主要原因就是呼吸衰竭。在我们 以前实验所得到的4 5 只新生e s 小鼠中，就有1 2 只出生后立刻表现进行性呼吸衰竭 现象，此外，在其他核移植动物中也发现了同样现象1 5 , 1 9 1 。 呼吸衰竭征是指新生有活力的e s 小鼠( 有短暂的呼吸现象) 不能发育至成年，在 出生后立刻表现进行性呼吸困难和青紫呼吸衰竭征象，其寿命不会超过l 小时，肺部 病理表现为肺泡扩张不全和肺泡壁增厚，这种呼吸衰竭征是导致新生e s 小鼠死亡的 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 主要疾病，并且，至今我们仍不清楚该病发生的原因。 1 5 呼吸衰竭征与肺表面活性蛋白b ( s p b ) 的关系 我们发现新生e s 小鼠呼吸衰竭征的临床和病理表现与人类儿科医学中的新生儿 呼吸窘迫综合征( n e o n a t a lr e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e , n r d s ) 非常相似【6 3 】。n r d s 的 临床表现为新生儿出生后已出现短暂( 数分钟至数小时) 的自然呼吸，继而发生进行性 呼吸困难、发绀、呻吟等急性呼吸窘迫症状和呼吸衰竭；病理表现为肺泡壁上附有嗜 伊红透明膜，肺泡壁和肺泡膈增厚，肺泡不张或扩张不全。有关研究已证实n r d s 是由于肺表面活性物质缺乏导致肺泡塌陷而引起的，发病率约0 5 ，病死率极高1 6 3 】。 这些关于n r d s 的研究提示我们：包括e s 小鼠在内的新生克隆动物的呼吸衰竭征很 可能也是由于肺表面活性物质的缺乏而导致的。 1 5 14 种肺表面活性蛋白 肺表面活性物质是由肺泡i i 型上皮细胞合成和分泌的一种磷脂蛋白复合体，磷脂 占9 0 ，蛋白成分仅占8 。蛋白成分中2 为肺特有的肺表面活性蛋白( s u r f a c t a n t p r o t e i n , s p ) ，磷脂的表面活性作用必须通过s p 的辅助才能完成。现已在小鼠发现4 种s p ：s p a 、s p b 、s p c 、s p d ，其中s p a 和s p d 是亲水性蛋白，s p b 和s p c 是疏水性蛋白。 。 s p a 主要由i i 型肺泡细胞及c l a r a 细胞合成和分泌。其肽链结构主要由二硫键连 接的富含半胱氨酸的n 端、重复表达g l y - x - y 的胶原样区、q 螺旋状的颈区及钙离子 依赖的c 型糖基识别区( c r d ) 4 个部分组成。s p a 的主要生理功能有：先天性防御 功能：可通过其多型的c r d s 识别细菌、真菌、病毒等感染性微生物的结合位点并与 之结合，从几个不同的途径实现宿主对呼吸道内微生物的防御作用晔螂】。参加免疫 调节：大量的离体实验结果显示，s p a 可调节包括巨噬细胞、单核细胞、中性粒细 胞、淋巴细胞、肥大细胞和树突状细胞等多种免疫细胞的功能，并可对释放细胞因子 和趋化因子启动获得性免疫反应，对抗病原体的侵袭7 0 】。维持肺内稳态：大量研 究显示，s p a 可以特异性地与二棕榈酰磷脂酰胆碱( d i p a l m i t o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ， d p p c ) ，对调节肺表面活性物质代谢和维持肺内稳态起着相当重要的作用。它可以抑 制肺表面活性物质的分泌；增强对气一液面磷脂的吸收，改善表面活性物质循环代谢 后的肺表面张力，并维持肺泡形态以防止塌陷；在渗出性肺水肿时亦能保证蛋白的分 泌：此外，它还能形成管状髓磷脂和其他一些表面活性物质【7 l 】。 成熟的肺泡s p b 是一种7 9 个氨基酸组成的疏水多肽，由含3 8 1 个氨基酸残基的前 体蛋白经蛋白水解酶加工而成，储存在板层状小体进而分泌入肺泡。它与表面活性磷 脂相互作用，形成稳定的单层体和双层体，减少表面张力、增加稳定性及扩展脂膜。 小鼠s p b 由位于6 号染色体上的一个单拷贝基因的7 个外显子编码，s p b 基因首先被 翻译成4 2k d a 的s p - b 前体蛋白，前体蛋白被糖基化以后，再经肺泡i i 型上皮细胞加工 4 s p b 蛋白在e s 小鼠中的表达分析 剪切成为具有表面活性作用的成熟s p - b 多肽( 8 7 k d a ) ，然后由内质网转移到高尔基复 合体，形成多囊状小体，最后包装形成板层状小体，其表达严格限于肺i i 型细胞和c l a r a 细胞。肺泡s p b 以富含半胱氨酸的寡聚物形式存在，其阳离子区紧密与磷脂头部相连， 产生亲水和疏水两个界面，从而使肺泡s p b 锚定于磷脂表面。s p b 与二棕榈酰卵磷 脂相互作用，促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，从而降低肺泡气一液界面的 表面张力、防止呼气末肺泡塌陷、增加肺顺应性、促进肺间质液体回流网。早产儿的 肺泡s p b 水平低时容易患呼吸窘迫综合征，若成人肺泡s p b 缺陷也可导致呼吸窘迫 综合征1 7 3 】。由于s p b 的特性，肺泡s p - b 已成为有效的表面活性剂的替代品，用于治 疗早产儿的呼吸窘迫综合征。 人类肺泡s p c 是由1 9 7 个氨基酸残基组成的以a 螺旋为主的前体蛋白。水解加工 后，成熟的肺泡s p c 是由3 3 3 4 个氨基酸残基组成的多肽，富含精、亮及异亮氨酸， 是蛋白质组中最疏水的蛋白质，可插入脂膜增加脂膜的延展性和脂类的重吸收。肺泡 s p c 被分泌到气体空间，与脂类囊泡相互作用导致溶解和融合，导致磷脂囊泡迅速 转换成磷脂片层。大多数的脂膜扩展区的蛋白质由活性的成熟肺泡s p c 组成，肺泡 s p c 与s p b 共同形成多囊体，进一步包装为板层状小体，与磷脂一同分泌进入气体 空间。肺泡s p c 是一种相对丰富的蛋白质，占表面活性物质的铴，特异性表达于i i 型肺泡上皮细胞。以非共价形式形成寡聚体，依靠棕榈油酸基团连接到肽链中的半胱 氨酸上。这些棕榈油酸能够在一层或多层磷脂之间游走，促进肺泡表面多层膜的形成， 肺泡s p c 的插入打断了磷脂的包装，增进了磷脂分子在膜层与囊泡之间的运动【7 4 j 。 二聚物、非折叠的和非螺旋的结构在肺泡s p c 中出现，尤其是非棕榈油化的肺泡s p c 的产生导致难溶的、淀粉样的纤维状蛋白产生，沉积在肺泡表面形成肺泡蛋白质病。 肺泡s p c 增进表面活性磷脂的再摄取，增进扩展性和磷脂的稳定性，促进表面活性磷 脂的代谢，作为替代品能够治疗早产儿呼吸窘迫综合征和肺泡水肿，调整与恢复肺泡 表面活性物质的功能成为急性呼吸窘迫综合征的治疗手段之一【7 5 j 。 s p d 和s p a 类似，同属于c 型凝集素大家族，二者均为多聚体结构，一级结 构由四部分组成：短的含半胱氨酸部分、胶原样片段、短的颈区和糖基识别功能域。 所不同的是s p - a 是一个花束样的十八聚体的大分子，而s p 。d 是一个“x ”状的十二 聚体的大分子。其基因定位及分子结构都与甘露糖结合蛋白相似，在1 0 q 2 2 2 3 ，可能 参与宿主防御机制【7 6 】。s p - d 能够介导革兰氏阴性细菌的凝集作用，如与埃希氏大肠 杆菌、肺炎克雷伯菌结合。s p d 可与病毒结合和聚集，如与流感病毒a 结合和聚集， 抑制它的血细胞凝集作用，还可以增加病毒与中性粒细胞的结合。此外s p d 由于糖 基识别功能域的作用，对中性粒细胞及单核细胞都有很强的化学趋化作用。有报道说 鼠的s p d 还可以通过增加氧自由基的产生而参与宿主防御，并且由于s p d 基因的 多态性而导致宿主对微生物的易感性不刚7 7 4 3 1 。 4 种s p 对维持哺乳动物的正常呼吸起着重要作用，其中，s p b 对于维持肺泡正 常功能尤为关键。 1 5 2s p b 蛋白与哺乳动物胎肺发育的关系 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 哺乳动物胎肺的发育可以分5 个时期：胚胎期、假腺期、小管期、囊状期和肺泡 期。人、绵羊和山羊胎儿至出生时肺的发育已基本完善，处于肺泡期；而兔、大鼠和 小鼠的胎儿至出生时肺的发育尚处于囊状期。肺泡表面上皮细胞的分化和气血屏障的 形成是肺发育的形态学标志。呼吸功能的建立，与i i 型上皮细胞的分化密切相关。i i 型细胞的分化标志有以下几点：糖原的变化；粗面内质网池扩张，并出现絮状物 质；多泡体出现及高尔基小泡增多；胞质内微管出现；腔面生成微绒毛；致 密小体内板层的出现等。对哺乳动物胎肺的发育，研究最多的是人和大鼠，其次是绵 羊、小鼠、兔、猕猴和山羊等。 有人研究发现【蚓，小鼠胚肺中i i 型细胞首先出现于假腺期( 胎龄1 4 2d 左右) 。 它们是这个时期衬以未来肺腺泡的唯一细胞类型。胎龄1 3 1 6 d 期间的早期胚肺中的 i i 型细胞呈矮柱状或立方形，具有大而近似圆形的胞核、一个发育完好的高尔基复合 体及许多伴随小泡、多泡体、致密体和大的顶端及基部糖原区域。肺表面活性物质由 肺泡i i 型上皮细胞合成，储存在板层小体中，再分泌至肺泡发挥作用，所以板层小体 是胎肺i i 型上皮细胞分化成熟的特征性标志，而糖原池大小，肺间质的毛细血管的开 放多少与胎肺成熟存在着一定的关系。 胎儿肺发育过程中，i i 型肺泡细胞( t y p ei ia l v e o l a rc o i l ) 是肺泡上皮的干细胞。i i 型肺泡细胞能分裂增殖并继续转化为i 型肺泡细胞( t y p eia l v e o l a rc e l l ) ；其本身也是 一种分泌细胞，分泌的肺泡表面活性物质( p u l m o n a r ys u r f a c t a n ，p s ) 与肺泡功能发育成 熟直接相关。s p 蛋白是肺泡p s 物质的特异性伴随蛋白，共分a 、b 、c 和d4 种亚 型，其可来源于呼吸道上皮c l a r a 细胞，主要为肺泡i i 型细胞所分泌博5 1 ，其中s p - b 蛋 白对于哺乳动物的呼吸功能起关键作用。t r f 1 是肺发育中一种具有组织特异性的核 转录因子，通过与i i 型细胞的s p 基因特异性结合，调控s p 蛋白的合成碍们。原始肺泡 期后，虽然i i 型细胞已经成熟并具有分泌s p b 蛋白能力，但并没有出现过强的反应， 可见，当胎肺还没有执行呼吸功能时，s p b 应以存储状态为主，或称为待分泌状态。 由此能否推测，一旦胎儿分娩出生立即开始呼吸，i i 型细胞将受到肺泡充气、牵拉等 动力学因素刺激，从而出现一个应激性s p 蛋白分泌高表达过程以满足肺泡功能的需 要。因此s p b 的不断合成和分泌是i i 型肺泡细胞发育至成熟的重要标志【8 7 1 ，从而使 得胎儿分娩后能够正常呼吸。 1 5 3 基因敲除小鼠的研究 通过基因敲除的方法研究s p - a 、s p b 、s p c 、s p d 四种基因的功能发现：s p - a 基因打靶小鼠肺组织的管状髓磷脂减少，对最小表面张力抑制作用敏感，并对由运动 或吸氧引起的应激敏感【8 8 9 l 】；s p c 基因打靶小鼠的肺表面活性蛋白的稳定性降低， 有明显的肺气肿、单核细胞渗透、上皮细胞发育不良及局限性肺炎 9 2 - 9 3 ；s p d 基因 打靶小鼠肺脏出现显著的脂质沉淀、型细胞增生变大、支气管周和血管周淋巴细胞 堆积等现象 9 4 - 9 6 ，但这3 种基因打靶小鼠都可以存活至成年，并且有正常的呼吸功能 和正常的s p b 表达。s p b 基因打靶小鼠和因突变而导致s p - b 基因缺失的新生儿在 6 s p b 蛋白在e s 小鼠中的表达分析 出生后都很快死于呼吸衰竭，但它们都有正常的s p a 、s p c 和s p - d 表达【9 7 - 9 9 。据 此我们推断：包括e s 小鼠在内的新生克隆动物的呼吸衰竭征很可能是由于s p - b 的 异常表达引起的。 1 6 本研究的目的、意义及主要内容 呼吸衰竭征是导致新生有活力的克隆动物( 包括e s 小鼠) 死亡的主要疾病，然而 我们至今仍不清楚导致该病发生的因素，也未见此类研究报道，但这种疾病的i 临床表 现和病理特征与人类儿科医学中的n r d s 非常相似，根据n r d s 的研究结果，我们 推测：s p b 基因的异常表达导致了该病的发生，因此，本研究主要以死于呼吸衰竭 征的新生e s 小鼠和各种对照组小鼠的肺脏为材料，检测s p b 在肺组织中的表达水 平，从蛋白水平上获得关于s p b 的异常表达导致新生e s 小鼠呼吸衰竭征的可靠依 据。而且，这种新生呼吸衰竭征e s 小鼠很可能是研究人类n r d s 疾病的理想动物模 型，利用它可深入揭示s p b 基因与人类n r d s 疾病的关系。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 实验动物 2 材料与方法 本实验所用实验动物分为4 组：1 2 只成年e s 小鼠( 遗传背景为 c 5 7 b l 6 x 1 2 9 s v ) ；1 2 只正常成年小鼠( 遗传背景同e s d , 鼠，为c 5 7 b l 6 x 1 2 9 s v ) ； 7 只死于呼吸衰竭的新生e s d 鼠( 遗传背景为c 5 7 b l 6 x 1 2 9 s v ) ；5 只正常新生小 鼠( 遗传背景同e s d , 鼠，为c 5 7 b l 6 x 1 2 9 s v ) 。其中、组作为对照组。 2 2 主要试剂 十二烷基磺酸钠( s d s ) 三羟甲基氨基甲烷( 嘶s ) 乙二胺四乙酸( e d t a ) 嘶s 饱和酚 三氯甲烷( c h l o r o f o l l l l ) 蛋白酶k ( p r o t e i n a s ek ) t a qd n ap o l y m e r a s e d n t p 微卫星引物 琼脂糖( a g r o s e ) 丙烯酰胺( a c t ) n - n 亚甲基双丙烯酰胺( b i s ) b c p r o t e i n a s s a yk i t 兔抗羊s p b 多克隆抗体 碱磷酶标记山羊抗兔i g g ( h + l ) p - - a c t i na n t i b o d y 预染蓝色蛋白质m a r k e r， 氯化硝基四氮唑兰溶液( n b t ) 5 溴4 氯3 吲哚磷酸二钠盐溶液( b c i p ) t e m e d 2 3 主要设备 s m z 6 4 5 体视显微镜 f o i s 冷光源 c c d 成像系统 8 s i g m a s i g m a s i g m a 天津灏洋生物制品科技有限公司 北京鼎国生物技术有限公司 m e r c kc o g e r m a n y 大连宝生物 大连宝生物 大连宝生物 北京鼎国生物技术有限公司 海泰克生物技术有限公司 海泰克生物技术有限公司 p i e r c e c h e m i e o n 北京中杉金桥公司 c e l ls i g n a l i n gt e c h n o l o g y 北京钧尧伟业生物技术公司 a l t f f e s c o a m e r s c o 上海生工 n i k o n 北京福凯仪器公司 q i m a g i n g s p - b 蛋白在e