生物技术本科毕业论文-不同浸种时间处理对湘棱豆种子萌发的影响.doc

学科分类号： 湖南人文科技学院本科生毕业论文题 目(中文)：不同浸种时间处理对湘棱豆种子萌发的影响(英文)：Effect on Germination of Xiang Leng Dou with Different Soaking Time Treatment姓 名： 学号 系 部： 生命科学系 专业年级： 生物技术09级 指导教师： 职 称： 副教授 湖南人文科技学院教务处制 目录摘 要1关键词1Abstract1Key words11.前言.2 1.1 课题研究背景21.2 研究的目的及意义32供试材料与方法42.1 供试材料42.2 所需仪器及试剂42.3 研究内容与方法 42.3.1种子发芽率测定42.3.2酶活性测定53结果与分析63.1 不同浸种时间下湘棱豆种子的发芽率比较63.2 不同浸种时间处理湘棱豆种子其保护酶活性比较73.3 湘棱豆种子保护酶与发芽率的关系73.3.1 湘棱豆种子POD活性与发芽率的关系73.3.2 湘棱豆种子CAI活性与发芽率的关系83.3.3 湘棱豆种子SOD活性与发芽率的关系84结论与讨论9参考文献10致 谢11诚信声明12湖南人文科技学院毕业论文不同浸种时间处理对湘棱豆种子萌发的影响摘 要：以湘棱豆种子为供试材料，分别用 8h、16h、24h的不同浸种时间对种子进行处理，测定各处理后的发芽率并分别测定不同浸种时间处理下湘棱豆种子的POD、CAT、SOD的酶活性，以探讨两者的相关性。结果显示，湘棱豆种子的POD、CAT、SOD 的酶活性与发芽率均随浸种时间的不同而发生改变，浸种时间过长或过短都会降低种子的发芽率。萌发期间POD、CAT 、SOD三种抗氧化酶的含量也随之发了变化。此研究表明了湘棱豆种子生命力的活性程度与POD、CAT 、SOD三种抗氧化酶活性有关。关键词：湘棱豆; 种子萌发; 过氧化氢酶; 过氧化物酶; 过氧化物歧化酶;发芽率Effect on the Germination of Winged bean Seeds with Different Soaking Time TreatmentAbstract: The winged bean seeds as the tested material, respectively, on the seeds were treated with 8h, 16h, 24h different soaking time, germination rate and enzyme activity of different soaking time treatment of winged bean seed Hunan POD, CAT, SOD were measured after each treatment, to investigate the relationship between. The results show, the enzyme activity of winged bean seed Hunan POD, CAT, SOD and germination rate increased with the soaking time had changed, too long soaking time or too short will reduce the germination rate of seeds. During germination of POD, CAT, SOD three kinds of antioxidant content also made changes. This study shows that the degree of activity of winged bean seed vitality of Hunan and POD, CAT, SOD three kinds of antioxidant enzymes activity.Keywords: The winged bean; seed germination; catalase; peroxidase; superoxide dismutase; germination rate1前言1.1 课题研究背景 湘棱豆，又名翼豆，是豆科蝶形花亚科，菜豆族，四棱豆属，广泛的分布在加纳、尼日利亚、斯里兰卡、印度尼西亚、马来西亚、巴布亚新几内亚、菲律宾等非洲及东南亚国家，种植历史悠久。湘棱豆可全身利用，其块茎可加工成食用粉，其质量比面粉优；种子可用以提取食用油、种子粉及相关蛋白质制品；花可用油煎食，其味鲜美同蘑菇；嫩叶可制成凉拌菜或汤，食味如菠菜；茎叶和荚壳则可作为优质饲料和绿肥，具有较大的经济价值1 。我国栽培湘棱豆主要以多年生的印尼品系为主，台湾、海南、广东、广西、云南、湖南、安徽等地都已试种成功，现已向全国范围内推广2。湘棱豆蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，富含不饱和脂肪酸，素有“金色豆子”美誉，其营养价值可与大豆相媲美。此外，湘棱豆含有黄酮、卵磷脂、硒等活性成分，有一定的药用价值，具有防衰老、抗癌、降血压、补血、明目及清热解毒等多项功效。因此，备受各国科学家的关注3。湘棱豆营养丰富，开发前景广阔。但是，现在国内外关于对湘棱豆的研究报道并不多，国内对湘棱豆的研究主要集中在引种栽培、农艺性状、营养素含量测定及加工特性上1。国外学者则把焦点聚集在湘棱豆的抗营养因子的研究上4。近几年来，湘棱豆逐渐走入普通消费市场，备受人们亲睐，成为蔬菜大家族中的新宠。因为湘棱豆对冠心病、动脉硬化、脑血管硬化、习惯性流产、口腔炎症、，泌尿系统炎症、眼疾等19种疾病均有良好的疗效。因此，有人称湘棱豆为二十一世纪健康食品、奇迹植物。湘棱豆富含维生素及多种营养元素，具有降压、美容、助消化等食用和药用价值，效果超出其他豆类，被誉为豆中之王5。近几十年来，美国、印度等70多个国家，对湘棱豆非常重视，并建立了专门的科研机构，召开了与之相关的国际性学术会议。在我国，湘棱豆亦被认为是营养价值高、用途广的蔬菜，很有发展前途，国内已数次组织人力在中国南方大量推广栽培，只要坚持不懈，在南方大量发展是顺理成章的事，但目前发展面积并不像人们预期的那样。这可能与湘棱豆的食用习惯不普遍，其用途未充分开发出来有关6。湘棱豆种子发芽是湘棱豆生长发育的起点，较高的发芽势和发芽率是培育壮秧的基础，直接关系到湘棱豆的产量，同时种子的发芽势和发芽率也是检测种子质量好坏的重要指标5。大量研究表明浸种时间过短或过长均不利于种子发芽6。浸种时间过短，种子吸水不足，种胚内部的蛋白质、酶等大分子和细胞器活化慢，种子萌动受到影响，因而不利于发芽；浸种时间过长，种子的无氧发酵现象比较严重，造成种子出苗率偏低7。种子吸水的过程同时也是内含物外渗的过程。随着浸种时间的延长,种子的内含物外渗量增加, 而且浸种时间越长, 物质外渗量越多。一般学者8认为, 与种子萌发有关的酶为SOD、POD、CAT 等保护酶。它们在清除活性氧、保持细胞膜稳定性方面起着重要的作用。能将逆境下形成的一些有毒物质氧化成无毒物质,从而在种子萌发过程中起到保护的作用。据相关研究表明，萌发率越高，种子中的酶活性也越高9。通过对相关文献资料的收集研究，近年来，四棱豆的资源开发、生理特征、营养价值、药用功能10研究等方面已有相关的报道。但是关于影响四棱豆种子萌发的因素如温度，盐度的研究却相当的少，尤其是不同浸种时间处理对四棱豆种子萌发的影响，及其萌发过程中过氧化物酶含量的变化还待进一步研究。通过对相关文献资料的收集发现，近年来，湘棱豆的资源开发、生理特征、营养价值、药用功能研究等方面已有相关的报道13。1.2研究的目的及意义综上所述湘棱豆值得大力推广栽培，开发利用可是湘棱豆种子的发芽率低是限制其栽培利用的一个瓶颈。目前关于影响湘棱豆种子萌发的因素的研究却相当的少，尤其是不同浸种时间处理对湘棱豆种子萌发的影响，及其萌发过程中过氧化物酶含量的变化还待进一步研究。因此本选题以四棱豆新品种湘棱豆为实验供试材料，以不同浸种时间对湘棱豆种子进行处理，通过测定湘棱豆种子的萌发率及种子萌发过程中酶活性的动态变化，以探明影响湘棱豆种子萌发的主要因素，从而达到为人工大量栽培湘棱豆提供理论指导和参考价值的目的。2 供试材料与方法2.1 供试材料 湘棱豆种子材料从怀化学院购买2.2 所需仪器及试剂（1） 仪器 SP723型分光光度计，冷冻离心机等（2）试剂 磷酸缓冲液、130 molL-1的甲硫氨酸、750 molL-1 氮蓝四唑溶液、100 molL-1EDTA-Na2溶液、20 u molL-1核黄素溶液、蒸馏水。30%H2O2、愈创木酚等溶液由湖南人文科技学院生命科学系购买。2.3 研究内容与方法2.3.1 种子发芽率的测定取一定数量的湘棱豆种子，选取粒大饱满大小色泽一致的种子，先用75%的酒精对其进行表面消毒后将其随机分为三组置于三个锥形瓶中，每组数量相同，放在恒温水浴锅中用25恒温进行浸种，浸种时间分别为8小时、16小时、24小时。浸种完成后将种子置于铺有双层湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿内100粒。运用恒温培养箱对种子进行温度的调控。每一组设置三个重复试验。培养期间根据情况对各培养皿补充蒸馏水，以此保持各测试梯度的相对稳定，每天需做到定时观察、补水，记录各组种子的发芽数，并测量种子萌发的长度。以胚根突出种皮的长度为种子一半时为作为种子发芽的标准，当连续 5d 内不发芽作为发芽结束期。在实验过程中要及时的挑出发霉的种子，所使用的培养皿、烧杯等均要以蒸汽干热法进行消毒，以防止其他因素影响实验结果。发芽率测定：方法参照赵云雨14指种子在发芽实验期内，正常发芽种子数占供试种子数的百分比。即，发芽率Gp（%）=（m/N）100% (m是全部正常发芽种子数，N是供试种子总数)根据每天的发芽记录以计算不同浸种时间下种子的发芽率。分析浸种时间对种子萌发的影响。2.3.2 酶活性测定（1）粗酶提取液的制备：待培养皿中湘棱豆种子胚根长到1cm 左右时, 分别从3个浸种时间处理的种子中随机选择萌发种子,取样后立即混合切碎, 称取0.1 g 放置到研钵中,加入10 mL 0.05 molL-1磷酸缓冲液( pH7.8) ，冰浴研磨1525s，于10000 rpm冷冻离心15 min，将悬浮液用一次性医用针筒吸出置于试管中，所获溶液即为粗酶提取液。（2）POD 活性的测定：方法参照李合生15 反应混合液液为100 mL 0.1 molL-1磷酸缓冲液( pH6.0) + 1 mL 30% H2O2 + 0.05 mL愈创木酚，测定时取酶液0.05 mL加3 mL反应液，混合后摇匀，立即在SP723型分光光度计下测定OD407值，每min读数1 次，共读5次，取反应呈线性部分的数值计算每分钟内的OD 值的变化，酶活性单位用(u/gFW/min) 表示。（3）CAT 活性的测定:方法参照李合生15反应液混合液为2 mL0.1 molL-1磷酸缓冲液( pH7.8 ) + 1mL0.08% H2O2 + 酶液0.2 mL，以磷酸缓冲液作为空白，用石英比色皿，每15 s测1 次OD240值，共测3 min。CAT 酶活性单位用mgg -1min -1 表示。以上指标的测定均重复3 次，对异常数据进行剔除。根据数据制定表格，得出结论湘棱豆种子萌发所需的最合适的浸种时间，以及在种子萌发的过程中CAT、POD等酶的活性的变化特点。（4）SOD 活性的测定:方法参照邹琦16 取0.05 mL的酶液加入试管中，以蒸馏水作对照，做2支对照管，分别加入磷酸缓冲液1.5 mL,130 mmolL-1的甲硫氨酸溶液0.3mL,750 molL-1的氮蓝四唑溶液0.3 mL,100molL-1的EDTA-Na2溶液0.3 mL,20molL-1 核黄素溶液0.3 mL和蒸馏水0.25 mL。混匀后将1 支对照管置于暗处，其他各管于4 000 Lx日光灯下反应20 min，以不照光的对照管作为空白，分别测定560nm 波长下的吸光度，SOD 酶活性单位用(u/gFW/min)表示。3 结果与分析3.1 不同浸种时间处理湘棱豆种子的发芽率比较（见表1）不同浸种时间对湘棱豆种子的发芽率和发芽势所产生的影响存在一定的差异（表1）。16 h的浸种处理种子发芽率较其他浸种时间理想，并且较长的浸种时间有提高发芽率的趋势。因为干种粒含水分较少，而水分又是种子发芽的一个必需因素，较短的浸种时间则不能使种子吸收足够的水分以使其快速发芽。24 h的浸种时间处理较16 h 处理的发芽率低，说明种子吸收水分时间过长也会影响其发芽率，这可能与浸种时间过长使种子中的营养物质被浸泡出来有关。表1 不同浸种时间处理湘棱豆的发芽率浸种时间 供试总数 发芽数 发芽率（h） （个） （个） （%） 8 100 32 32 16 100 48 48 24 100 40 40 图1 不同浸种时间处理湘棱豆的发芽率图1 不同浸种时间处理湘棱豆的发芽率3.2 不同浸种时间处理湘棱豆种子其保护酶活性比较（见图2） 不同浸种时间处理四棱豆种子，其酶活性存在一定的差异，浸种时间为8小时和24小时时的四棱豆种子的CAT、POD活性都较低。16小时的酶活性最高分别为60.72 u/gFW/min，32.48 u/gFW/min。SOD的活性则呈一直缓慢上升的趋势。 图2 不同浸种时间处理湘棱豆种子POD、CAT、SOD活性的比较3.3 湘棱豆种子保护酶与种子发芽率的关系（见表二）3.3.1 湘棱豆种子POD活性与发芽率的关系随着时间推移, 不同培养条件下湘棱豆种子中POD 活性会发生变化，浸种8小时的POD值较低,所测的的POD 活性为23.25 u/gFW/min , 而浸种时间16小时的POD 活性为32.48 u/gFW/min;浸种时间为24小时的POD 活性又下降为18.64 u/gFW/min 。而三个浸种时间处理下的四棱豆种子的萌发率分别是32 % 、48% 、40% 。经分析萌发率最高的浸种时间与POD活性最高的浸种时间一样。因此POD活性有利于种子的萌发。因为POD 是植物细胞内重要的保护酶之一，POD的活性越高，保护生物膜的功能就越强，抵御逆境损害的能力也就越强。3.3.2 湘棱豆种子CAT活性与发芽率的关系不同浸种时间对湘棱豆种子CAT活性的影响存在差异性。其中浸种时间为8小时的CAT酶活性较低, 浸种时间为16小时的CAT酶活性相对较高,之后浸种时间为24小时的CAT酶活性也较低。而四棱豆种子的萌发率最高的是浸种时间为16小时的时候，因此CAT的活性有利于种子的萌发在浸种期间，会产生过氧化氢，这种物质的积累对种子本身有毒害作用，过氧化氢酶具有分解过氧化氢的能力。一般过氧化氢酶活性高的种子，体内过氧化氢积累少，生活力较高，相反则较低。3.3.3 湘棱豆种子SOD活性与发芽率的关系 SOD酶在三个浸种时间的处理下其酶活性呈缓慢上升的趋势，说明这种酶活性强，持续时间较长，有利于种子的萌发。 湘棱豆种子保护酶与种子发芽率的关系（表二）浸种时间 CAT POD SOD 发芽率(h) （u/gFW/min） （u/gFW/min） （u/gFW/min） （%） 8 28.33 23.25 105.27 32 16 60.72 32.48 121.34 4824 36.54 18.64 165.64 404 结论与讨论影响湘棱豆种子萌发的因素很多，在湘棱豆栽培的过程中常遇到出芽率低，萌发迟缓。出苗少等问题。除了种子自身的原因之外，还与外界的因素温度、浸种时间相关联。根据以上研究结果发现,不同的浸种时间对湘棱豆种子的萌发有着明显的影响，浸种时间过短或过长都会降低湘棱豆种子的萌发率。本次实验中湘棱豆种子的最适浸种时间为16小时。湘棱豆种子的种皮比较坚韧, 表面光滑且略具蜡质, 这种结构对种子吸水十分不利, 因此浸种时间过短就不利于湘棱豆种子对水分的吸收,从而不利于其在萌发过程中的各种代谢反应。而浸种时间过长，会使其在萌发过程中产生的代谢产物过多积累而产生毒害,致使胚的生长受到阻碍而不利于种子的萌发,甚至有的种子还会发生霉变。因此保证湘棱豆种子合适的浸种时间对促进种子萌发和争取幼苗早生快发是具有重要意义的。在种子萌发的过程中，各保护酶均发生改变，如超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶等可以清除活性氧自由基，防止自由基的毒害，因此将它们称为保护酶系统。所有植物都具有抗氧化的过氧化酶系统，在环境发生改变时，过氧化酶的活力也会相应改变。浸种时间对种子的处理也是一样，在浸种时间相对较长时，SOD，POD，CAT 活性以及其保护性物质相互协调有效地清除逆境条件下一些代谢过程产生的活性氧，使活性氧维持在一个较低水平上，从而可以减缓活性氧积累，延缓种子的衰老、劣变。从实验中可看出，湘棱豆种子发芽活力与保护酶系统有一定关系。浸种时间较长时可引起SOD、CAT 活性升高。SOD、CAT 酶是保护种子劣变的重要酶类， POD 是植物细胞内重要的保护酶之一，POD 活性越高，保护生物膜的作用就越强，抵御逆境损害的能力也就越强。经过浸种时间处理后，其POD、 SOD、CAT活性有不同程度的变化。综合种子保护酶活性与不同浸种时间种子的发芽率可知，SOD、POD、CAT的活性越高，对种子组织的保护能力越强，但随着浸种时间的延长，外界温度等因素影响，酶活性势必有一个升高的阈值，超过这个阈值，保护酶也无法抑制种子内含物的衰老和劣变，继而种子中酶的活性也会相应降低。主要参考文献（不少于10篇）1全妙华湘棱豆的营养保健作用与开发利用J中国食物与营养，2006（3）：49-502王佩芝，许冠南一种有待开发的稀有蔬菜湘棱豆J中国蔬菜，1991（3）：30-323李娘辉，徐颂军.湘棱豆的价值和利用J.华南师范大学学报，1996，2：84-894傅翠真，王佩之.湘棱豆的营养价值及利用前景J.作物杂志，1994，5：37-385陈东明，全妙华.湘棱豆的开发利用价值及其高产栽培技术D.湖南农业科学，2005，4：21-226 刘壮，高玲，罗瑛，等.湘棱豆绿肥营养元素含量及品质评价J.热带农业工程，2010，33（3）：31-357陈立君,郭强,刘迎雪.不同温度对大豆种子萌发影响的研究J. 中国农学通报, 2010, 25 (10) : 140-1428覃柳燕，唐美琼，黄永才，等不同贮藏温度及时间对山豆根种子活力的影响J中国种业， 2011( 1) : 35-369张兆英不同贮藏条件下药用植物种子活力的研究D.中国优秀博硕学位论文全文数据库，2003，2：84-8910谢亚军，王兵，梁新华，等干旱胁迫对甘草幼苗活性氧代谢及保护酶活性的影响 J.农业科学研究，2008，4 :19-2211林植芳，李双顺，林桂珠水稻叶片的衰老与超氧物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系 J.植物学报，1984, 26(6) : 605-61512 陈刚普，王玉红，曹红委，等.无公害特菜湘棱豆高产栽培技术J.农业科技通报，2009（3）：147-14813 何永梅，刘红英.湘棱豆新品种及栽培技术要点J.北京农业，2007（10）：614 赵雨云. 浸种时间对大豆发芽的影响J.中国种业, 2007，10 : 41-4215李合生植物生理生化实验原理和技术M北京: 高等教育出版社， 2003: 167-17016邹琦植物生理学实验指导M.北京: 中国农业出版社，2000: 168-169致 谢时光飞逝，转眼四年的大学生活即将划上一个句号，而我的人生却只是到达了另一个起点，又将面对新的朋友伙伴。四年