光密度分析.doc

5光密度分析5光密度分析本小节的教学目的是引领您了解Image-Pro Plus的光强度校准和分析工具。在本练习中，您将：n 装入一幅凝胶示例图像并以光密度为条件来校准图像的强度标。n 从凝胶图像内的像素带获得光密度测量。n 建立一个入射光的基线测量。n 逆着入射光基线绘制DNA像素带的密度测量。n 捕获绘制的屏幕图像。n 存储到一个图像文件中以便于其它应用程序导入。 本练习大约需时15分钟。设置：如果您还未启动Image-Pro Plus，请先启动。当启动了Image-Pro Plus后，您即可按照下述操作步骤进行练习。重要：请为此次练习检查您的Image-Pro设置是否与本教学中对话框上的设置完全相同。如果Image-Pro 5.1中现在还保留有早期练习的一些设置，则Image-Pro 5.1中的设置可能会与本次练习所用到的设置不一致。n 装入图像在本练习中，您将修改Image-Pro Plus的强度标，从而将DNA凝胶示例图像的光强度值表示成光密度值（校准为一个标准的光密度曲线）。本图像是使用CDD照相机在光盒中拍摄的，在样例的后面有UV（紫外线）光源。1.从Image-Pro Plus文件夹下Images的文件夹中打开DNA.tif文件。DNA带空带DNA.tif图像窗口被打开。暗条纹（带）表明存在DNA。 2.从测量菜单中选择校准次级菜单，然后选择强度命令。出现强度校准 - dna.tif对话框。3.点击新建按钮以创建一个新校准。出现强度曲线并且在名称字段中出现Intensity Cal 0的名称。X轴代表原始强度值Y轴代表已校准值 名称字段可标识您将要创建的校准值的设置。您可将校设置保存下来，以便您再次需要时可方便地调用。强度曲线以图解的方式说明了强度标上校准发生变化时的效果。X轴描述的是原始的强度值(如，从图像上读取的值)，而y轴则反映了每次校准所发生的变化。4.输入UV Light作为新校准的名称。5.输入OD作为光密度的单位名称。X轴代表光强度Y轴代表光密度6.点击标准光密度旁的单选按钮。强度曲线的变化可反映出密度/强度间的关系。 光密度刻度反映了传输材料内光的衰减指数。正如您所看到的，光密度曲线与光强度刻度呈现出的是一个逆向关系。这意味着： 小的光强度值对应大的光密度值。 大的光强度值则对应小的光密度值例如，像素越暗，则材料越密集。继续本练习的下一个步骤：指定黑色和入射色阶。n 指定黑色和入射色阶在本练习中，您将建立反映黑色（表明不存在光）和光入射或白色（表明不存在材料）的色阶。在图像左上角的黑色圆形对象（黑点）是校准标准，将使用它来建立黑色色阶。此对象反映出了当没有光线通过它时，照相机所记录的光强度。当在光盒中用照相机进行拍摄时，在样品上贴了一个实心物体从而创建了此对象。在左侧的空白区域将用于建立入射级别或白色色阶。此区域反映了不存在材料时所记录的光强度，并且所有可能的光线都通过了照相机。您现在可输入级别值，或者点击相应的图像按钮以交互式地设置色阶。1.点击光强度校准对话框中的选项按钮。出现光密度校准对话框。2.点击黑色色阶组框中的图像按钮。出现黑色色阶消息框，同时在图像上，光标变成了十字光标。3.移动十字光标到左上角处的黑点上。当十字光标的中心位于黑色圆形的中心上时，点击鼠标左键，此时黑色色阶消息框中的读数变为8。再次出现光密度校准对话框，并且黑色色阶字段的数字变为8。4.点击入射色阶组框中的图像按钮。出现入射色阶消息框。光标变成了十字光标。 5.移动十字光标到图像左侧的空白区域。点击鼠标左键，同时入射色阶消息框中的读数变为121。再次出现光密度校准对话框，并且入射色阶字段的数字变为121。6.点击确定按钮。出现强度校准 - dna.tif对话框。密度曲线的两个端点反映了您刚刚输入的黑色和入射色阶。7.点击确定按钮。将关闭强度校准 - dna.tif对话框。继续本练习的下一个步骤：绘制带密度。n 绘制带密度在本练习中，您将要收集凝胶中一个DNA带的光密度测量，并使用谱线轮廓命令绘制出它的光密度。谱线轮廓可绘制图像上一个直线中每个像素的值。在本练习中，您将要定义一列像素（不是一条单一直线），然后沿着此列的长度绘制“平均”光密度值。1.从测量菜单中选择谱线轮廓命令。出现谱线轮廓 - dna.tif对话框，并且一条预定义的斜线被放置在DNA.tif图像窗口的左上角。注意：在本练习中，一些示例图像会以图表方式显示轮廓的统计值。在您的计算机中，这些统计可能不会出现。请不要理会这种差别，因为这种差别并不会对本练习的结果产生任何影响。 2.从谱线轮廓 -dna.tif对话框中，选择报告菜单，然后再选择厚垂线命令。在图像左上角出现一对预定义线。 3.再次点击报告菜单，确信选择了强度校准和范围/面积选项。4.从报告次级菜单中取消选定全尺寸选项。图表的Y轴被缩至轮廓线的最小值和最大值。 5.将直线对的宽度与图像中第二条DNA带的宽度匹配。将此直线对放置到第二条DNA带上，然后拖动最右边的定义线至第二条DNA带的右边缘。 重复上述步骤，将最左侧的定义拖动至第二条DNA带的左边缘。6.拉长直线对长度并使之与带的长度相同。将光标放置在列顶端的直线对之间。当光标变为垂直的双箭头光标时，拖动末端至DNA带的顶边缘。重复上述步骤，拖动下面的末端至DNA带的底边缘。完成后，您的定义直线对看上去应如下图所示：Image-Pro Plus将沿着带的长度测量和绘制平均光密度。您可查看反映带中材料光带的图表。最暗的（最密集）的光带会产生最高的峰值。继续本练习的下一个步骤：绘制逆向基线的光密度。n 绘制逆向基线的光密度在本练习中，您将定义一个空列以作为基线，然后绘制它与样例带的差异。1.移动定义直线对到一个空白带。将光标放置在定义线间的任何位置。当光标变为4方向光标时，拖动直线到当前DNA带右侧的空白带上。 注意：如果需要，可单独调整定义线以确保定义线完全位于空白带之内。不应让它们与DNA带的任何一端接触。反映基线的图表定义直线对在空白带上。选中复选框以创建一个参考对。2.在谱线轮廓 - dna.tif窗口中，选中参考复选框中的复选标记。定义直线对以虚线形式显示，并且Image-Pro Plus将它们的整个长度绘制为0。这将逆着其它可测量的轮廓创建一个基线。图表发生变化以反映新的（空白）光带数据。 3.将定义直线对放到第二个DNA带上。将光标放置在参考直线之间。当光标变为4方向光标时，点击鼠标左键。将根据参考对复制一个新的定义直线对，并且新的直线对覆盖在初始直线对上。如下图所示，拖动新直线对到第二个带上。 现在，图像上有两个直线对。在空白带内的虚线对表现为基线，而在DNA直线内的实心直线对则表现为测量对。基于基线对，图表也显示出了测量对所发生的变化。在下一步骤中，您要将图表复制为一个图像文件。继续本练习的下一个步骤：存储绘图到图像文件。n 存储绘图到图像文件在本练习中，您将要使用Image-Pro Plus的屏幕捕捉实用工具，将直线绘图保存为一个TIFF文件。一旦以TIFF格式保存了您的绘图，您便可以在字处理或桌面出版应用程序中粘贴或导入此绘图。1.从Image-Pro Plus的文件菜单中选择屏幕捕捉命令。出现屏幕捕捉选项对话框。 2.从捕捉选项组的选择列表框中，选择Client选项。可通过此选项将活动窗口中的内容复制到一个图像文件中（仅包括窗口内的像素，而不包括边框和标题栏）。此列表框中的其它选项用于捕捉整个屏幕、整个活动窗口或您指定屏幕的部分区域。3.选择文件夹c:ipwin5images。这使得Image-Pro Plus直接将捕捉的屏幕存储到此目录中。默认情况下，Image-Pro Plus会将捕捉的屏幕存储为前缀为GRAB的文件。在此练习中，您不必更改此命令规则，因而，Image-Pro Plus将会把您捕捉的屏幕存储为文件名为GRAB0000.tif的文件，并直接存储到c:ipwin5images目录下。4.点击确定按钮。将关闭屏幕捕捉选项对话框。5.按功能键。出现选择Window/Client对话框。 6.点击并拖动窗口选择器至谱线轮廓dna.tif窗口上。请使用鼠标来点击和拖动窗口选择器工具。当选择了谱线轮廓dna.tif窗口后，松开鼠标左键。Image-Pro Plus便读取谱线轮廓dna.tif窗口中的内容并根据窗口所包含的像素创建一幅图像。在Image-Pro Plus捕捉窗口内容时，会出现一个照相机图标，并且还会出现一个描述捕捉过程的进度条。捕捉的图像将被存储为GRAB0000.tif，并位于ipwin4images文件夹中。注意：您刚刚存储了一幅轮廓图表图像。此数据用于生成一个图表而不是此文件的一部分。要存储与此图表相关联的数据，请使用保存命令，此命令位于谱线轮廓dna.tif窗口的文件菜单中。更多信息屏幕捕捉您现在可象其它图像文件一样地使用此捕捉图像。.您可将此文件读入Image-Pro Plus以进行编辑、增强或与其它图像相合成。而且，您还可将它读入（或粘贴）字处理或桌面出版文档中。在本练习中，Image-Pro Plus将此图像存储为一个文件名为GRAB0000.tif的文件。随后存储到此目录中的屏幕图像将会具有同样的前缀GRAB，但将会为其分配一个新的连续数字（如，GRAB0001.tif, GRAB0002.tif等）。您也可以将前缀GRAB更改为其它前缀，如IPP。您可将捕捉屏幕数据存储为Image-Pro Plus支持的任何格式文件。如果您的应用程序不能识别TIFF格式文