基因打靶技术介绍.doc

基因打靶技术介绍摘要：基因打靶技术于20世纪80年代后兴起，是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术。它通过定向改变细胞或者生物个体遗传信息使得生物个体表达突变的性状，从而帮助人类理解生命现象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗手段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。目前,基因打靶技术在鼠胚胎干细胞中的应用已经很成熟。它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段。定义：基因打靶是指通过外源基因与受体细胞染色体基因组上的序列之间发生同源重组（基因同源重组是指外来的含已知序列的DNA片段通过同源关系与受体细胞基因组的相应片段发生交换、产生重组,并在受体细胞染色体上形成有活性的基因的过程）,将外源基因整合到某一定位点上,从而实现外源基因的定点整合、修饰和改造受体细胞遗传特性的技术手段。原理：首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供给研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。基因打靶主要步骤：(一)打靶载体的构建 基因打靶过程中，基因打靶载体的设计及构建是非常重要的，根据不同的目的，利用插人、删除、置换、修饰等手段对DNA序列进行重新构建。基因打靶载体包括靶基因的同源序列(目的基因)、用于筛选同源重组成功细胞的选择标记以及载体骨架三部分。根据双链断裂点位置的不同可分为插人和置换两种基本类型。插人型载体的断裂点在同源序列内，选择标记既可在同源序列内，也可在其外，重组的结果是将整个载体整合到靶位点上。由于打靶载体的插人干扰了靶基因的正常结构，从而使其失活。置换型载体的断裂点在同源序列的边缘或其外，选择标记在同源序列内，重组的结果是由载体上的同源序列取代内源靶序列。（二)打靶载体导入胚胎干细胞 外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。电穿孔法是目前最常用的方法，适用于多种细胞，由于脉冲对细胞的电穿孔是瞬间的可逆现象，一般不影响细胞的功能3。显微注射法需借助于显微注射仪，将外源基因准确注人到细胞中，命中率较高，但技术难度大。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。（三)基因打靶的筛选系统 由于外源基因与靶细胞DNA可以发生同源重组或非同源重组，而且同源重组的发生频率远比非同源重组的低，故对同源重组的筛选和检测，是基因打靶的重要步骤。目前筛选的方案有数种，如正负双向选择法、标记基因的特异位点表达法及聚合酶链反应(PCR)法。其中用得最多的是正负双向选择法:体外构建打靶载体时，在靶基因的同源序列之间插人新霉素抗性基因(neo)作为正筛选的标志，在同源序列与非同源序列之间插人单纯疤疹病毒一胸苷激酶基因(HSV一tk)作为负选择标志。含有neo基因的克隆可以在含以18的培养基中生长，tk基因可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，因而携有tk基因的克隆不能在含有丙氧鸟昔的培养基中生长。将打靶载体导人细胞后，若发生随机整合，neo和tk基因会同时整合至基因组中，随机整合的细胞将被杀死，而发生同源重组的细胞tk基因被删除，仅有neo基因整合人基因组，在药物G418和丙氧鸟苷的双重筛选下仍能存活。（四）鉴定 观察被击中细胞的生物学特性, 并进行分子生物学检测可以用特异PCR 方法鉴定, PCR引物一端以基因组DNA 的特定基因座为模板, 另一端以导入的外源基因为模板, 这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。对经PCR鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆。基因打靶技术的应用：基因功能和基础理论研究方面 首先,基因打靶通过定点改造基因组中的特定基因,有可能在细胞水平上研究特定基因的功能和调控机制。从定点突变的干细胞获得突变基因型个体,为在生物体整体水平了解基因的胚胎发育和生理功能提供了可能。分子免疫方面 可用基因打靶观察某一基因对免疫细胞发生发展的影响。例如,Manjunath等用基因打靶技术破坏了CD43基因,结果提高了T淋巴细胞的粘附性,为进一步观察和探讨一些免疫机制奠定了基础。在病理模型方面 自Garrod发现Alkaptonuria遗传病以来,研究者们发现,许多遗传病都是由于单个基因的突变引起的。用基因打靶技术对小鼠或其它哺乳类动物中此类单基因进行定点突变,就可以为人类该基因缺陷或突变所致的遗传病建立精确的动物模型,为了解这些遗传病的病理生理生化特性及寻找适当的药物和治疗手段,目前为止,已得到Lesch-NyhanSyndrome,Cystic fibrosis和Gaucheris等多种病理模型。在基因治疗方面 据统计,到1998年为止,正在进行的临床基因治疗方案有278项。但是,近年来的研究表明,外源基因的导入有可能导致一些与预想目的相悖的结果,如使正常基因失活或激活原癌基因等,所以,要想利用基因打靶技术用于疾病治疗,造福人类,还需要不懈的理论研究和实践检验。转基因动植物和生物反应器方面 转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动植物体内,使外源基因与动植物本身的基因整合在一起,实现体内表达,从而培养出转基因动植物的技术。其特点是可以使动植物增加某一功能或某一产物,但是,由于转基因在动植物细胞基因组中的整合是随机性的,所以,它的发展和应用受到了一定的限制。如果应用基因打靶技术将会把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中,定点改造原有基因的功能,使转基因动植物和生物反应器的研制更为精确。基因打靶技术的优缺点：优点：1，宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞； 2，能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上并对宿主染色体进行精细改造； 3，新引入基因随染色体DNA 的复制而稳定复制。缺点：1，命中率低； 2，转化率低； 3，非同源重组随机插入干扰； 4，同源系列要求高。基因打靶技术的意义： 基因打靶技术是80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术.它具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点.它是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法.这项新的技术无论在基础理论研究领域还是在实际应用中都有着美好而广阔的前景.细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因打靶技术则是遗传工程中的另一重大飞跃.基因打靶技术