表达载体的构建【PPT】 .ppt

中国海洋大学科学馆319 一表达载体介绍二构建表达载体的基本步骤三载体构建具体范例四构建表达载体注意事项 中国海洋大学科学馆319 一表达载体的介绍 1 载体的分类 1 1按进入受体细胞类型分 1 原核载体 2 真核载体 3 穿梭载体 中国海洋大学科学馆319 1 2按功能分成 1 克隆载体 通常都带一个松复制子 一个多克隆位点和一个筛选标记 目的在缩主细胞内复制形成大量的基因克隆 被克隆的基因不表达 2 表达载体 就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件 如启动子 rbs 终止子等 使目的基因能够表达的载体 是否含有表达系统元件 即启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号 这是用来区别克隆载体和表达载体的标志 中国海洋大学科学馆319 二构建表达载体的基本步骤 引物设计 目的基因 cds区 的克隆 目的基因进行酶切 质粒进行酶切线性化 电泳 胶回收纯化 a遵循引物设计原则 b引物两端加入酶切位点 c保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体mcs上 能够正确读码 一般先用pcr扩增带酶切位点的目标基因 然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收 中国海洋大学科学馆319 模板与线性化质粒连接 转化到大肠杆菌dh5 鉴定 pcr 测序 酶切 通过pcr选出阳性克隆 测序鉴定表达载体是否构建成功 将表达载体导入表达菌株 中国海洋大学科学馆319 三载体构建具体范例 大菱鲆ghr基因构建入pegfp载体中 中国海洋大学科学馆319 1 ghr从大菱鲆cdna模板中扩增 5 非翻译区 3 非翻译区 cds区 初次pcr引物设计 外引物 内引物 中国海洋大学科学馆319 2 分析酶切ghr基因酶切位点 将ghr基因mrna序列的cds区 蛋白编码区 导入dnaman软件中 进行酶切位点分析 中国海洋大学科学馆319 3 引物的设计 引物直接在ghr编码区起始和末端设计 然后在引物5 端加上相应的酶切位点 特别注意 1 因为需要与gfp融合表达 所以下游引物要去掉终止密码子tga2 不要改变gfp表达的编码框 forward5 atgccactaagcacagctg 3 gaattc cc reverse5 tcagttcacagagtggca 3 ccgcgg acgc 中国海洋大学科学馆319 4 ghrpcr扩增 纯化 ecori和sacii酶切 纯化5 质粒提取纯化 ecori和sacii酶切线性化 低浓度琼糖电泳 胶回收纯化6 模板与线性化质粒连接7 转化感受态大肠杆菌8 鉴定 pcr 双酶切和测序鉴定 中国海洋大学科学馆319 四构建表达载体注意事项 1 尽可能除去无关的dna序列从而增加载体容量 2 选择表达载体时 要根据所表达蛋白的最终应用考虑 如为方便纯化 可选择融合表达 如为获得天然蛋白 可选择非融合表达 融合表达时在选择外源dna同载体分子连接反应时 对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰 3 选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列 否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开 4 在惠赠或交换的质粒中确定mcs的正确性 否则会造成错读密码子 中国海洋大学科学馆319 3对照的设立为验证双酶切是否成功 可做如下对照 1 酶切反应时加各单酶分别切两管 用同一种buffer 跑胶 看单切的两管是否成线性 如两管均成线性可初步判断双酶切成功 做转化时 也要进行对照 2 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应 这个对照可进一步看双酶切是否成功 如果长出克隆 说明很有可能只进行了单酶切 如没长出克隆 则证明双酶切成功 3 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物 进行转化 这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 4 设原始质粒为对照 意为检测整个操作过程中是否有误 中国海洋大学科学馆319 使用时 直接删除本页