（水生生物学专业论文）鱼腥藻7120中all1723基因的鉴定、性质及功能研究.pdf

论文题目： 鱼腥藻7 1 2 0 中a 1 1 1 7 2 3 基因的鉴定、性质及功能研究 学科专业：水生生物学 学位申请人：陈伟伟 指导教师：王全喜教授 摘要 鱼腥藻7 1 2 0 是一种丝状体蓝藻，含营养细胞和异型胞，营养细胞能进行光 合作用，异形胞可进行固氮作用，所以常被作为研究光合和固氮作用的模式生物 之一。2 0 0 1 年，k a z u s ad n a 研究所完成对鱼腥藻7 1 2 0 全基因组的测序，随后 该物种中许多基因产物的功能也被相继测定，然而，仍有部分基因功能未被鉴定， 如a 1 1 1 7 2 3 的基因，对它的了解仍局限在生物信息学预测的结果，认为该基因产 物是个可能的醛缩酶。 碳碳合成是有机化学中最重要的反应之一，由酶催化的碳碳合成由于其具有 立体选择性催化底物的能力而被广泛应用于有机化合物的合成。在这个领域，由 于醛缩酶催化的醛缩反应被应用于糖类、多羟基抗生素及其它许多具有生物活性 的化合物的合成，因此近年来醛缩酶家族被很多学者关注。在醛缩酶家族中，最 具代表性的是果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶，它能催化果糖1 ，6 二磷酸、3 一磷酸甘油 醛和磷酸二羟丙酮之间的可逆反应。果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶参与了生物体很多 重要的代谢反应，是卡尔文循环中固定c 0 2 后第一个催化由3 c 化合物转化为6 c 化合物的酶，处于第一个分支点上，同时它也是控制光合作用速率的重要酶之一。 其次它也参与了糖酵解反应，这个代谢过程中果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶的作用和 卡尔文循环中正好相反，是将6 c 化合物转为3 c 化合物。另外它也参与了糖异 生、磷酸戊糖途径等，它是生物体进行有氧代谢与无氧酵解的关键酶之一。 因此本研究对鱼腥藻7 1 2 0 中这一可能的醛缩酶基因a 1 1 1 7 2 3 的功能进行了鉴 定，并迸一步对其酶学性质与蛋白功能进行分析。结果显示，无论是生物信息学 还是实验的手段均鉴定a 1 1 1 7 2 3 基因产物是果糖一l ，6 一二磷酸醛缩酶；a l l l 7 2 3 基因 产物在p h 8 0 时活性最高，添加0 2 r a m 的m 9 2 + 时能极大地提高其活性，而l m m 的e d t a 会完全抑制其活性：利用同源重组获得a 1 1 1 7 2 3 基因的敲除和过表达的 突变株，并在d n a 水平上鉴定正确，以便进一步的功能鉴定。 关键词：鱼腥藻7 1 2 0 ；a 1 1 1 7 2 3 基因；鉴定；性质；功能研究 论文类型：应用基础 t h e s i st o p i c ：i d e n t i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fg e n ea l l17 2 3 p r o d u c tf r o mt h ea n a b a e n as p s t r a i np c c 712 0 p r o f e s s i o n a ld i s c i p l i n e s ：h y d r o b i o l o g y d e g r e ea p p l i c a n t ：c h e nw e i w e i i n s t r u c t o r ：p r o f w a n gq u a n x i a b s t r a c t a n a b a e n as p p c c712 0i saf i l a m e n t o u sc y a n o b a c t e r i aw i t hv e g e t a t i v ec e l l sa n d h e t e r o c y s t s v e g e t a t i v ec e l l sa r ef o rp h o t o s y n t h e s i sw h i l eh e t e r o c y s t sa r ef o rn i t r o g e n f i x a t i o n s oa n a b a e n as p p c c712 0i so f t e nu s e da so n eo ft h et y p es p e c i e st o r e s e a r c ht h ep h o t o s y n t h e s i sa n dn i t r o g e nf i x a t i o n t h ep h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dg e n e t i cb a c k g r o u n d so fa n a b a e n as p p c c7 12 0a r er e l a t i v e l y c l e a rb e c a u s eo fi t ss i m p l el i f es t y l ea n dl o n g - t e r mh i s t o r yo fh u m a nc u l t u r e d a f t e r k a z u s ad n ar e s e a r c hi n s t i t u t ec o m p l e t e dt h ew h o l eg e n o m es e q u e n c i n go f a n a b a e n as p p c c7 1 2 0i n2 0 0 1 ，t h eg e n o m i cr e s e a r c hb e g a n m u c ho f t h ef u n c t i o n a l g e n ep r o d u c tw a sd e t e r m i n e d h o w e v e r , t h e r ei ss t i l lap a r to fg e n et h a th a sn o tb e e n i d e n t i f i e d ，s u c ha sg e n ea 1 1 17 2 3 w i t hb i o i n f o r m a t i c s ，t h ep r o d u c to ft h eg e n ei s p r e d i c t e d a sa p o s s i b l ea l d o l a s e c a r b o n - c a r b o nb o n df o r m a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e a c t i o n sf o ro r g a n i c c h e m i s t r y t h ee n z y m e sc a t a l y z ec a r b o n - c a r b o n b o n df o r m a t i o na r eu s e da s b i o c a t a l y s t si no r g a n i cr e a c t i o n sb e c a u s eo ft h e i ra b i l i t yt oc a t a l y z es t e r e o s e l e c t i v e r e a c t i o n s i nt h i sa r e a ，a l d o lc o n d e n s a t i o n sc a t a l y z e db ya l d o l a s e sa r ew i d e l yu s e di n t h es y n t h e s i so fs u g a r s ，p o l y h y d r o x ya n t i b i o t i c s ，a n dm a n yo t h e rb i o l o g i c a l l ya c t i v e c o m p o u n d s t h e r e f o r e ，a l d o l a s e sa r ei n c r e a s i n g l y a t t r a c t i v ea sb i o c a t a l y s t sa n d e s p e c i a l l yi m p o r t a n t f o rc a r b o h y d r a t eb i o s y n t h e s i s a m o n gt h em o s ts t u d i e d r e p r e s e n t a t i v e s o ft h i s g r o u pe n z y m e s a r e f r u c t o s e - 1 ，6 一b i s p h o s p h a t ea l d o l a s e s f r u c t o s e 一1 ，6 一b i s p h o s p h a t ea l d o l a s ec a t a l y z e st h er e v e r s i b l ea l d o lc o n d e n s a t i o no f d i h y d r o x y a c e t o n e p h o s p h a t e ( d h a p ) a n dg l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e ( g a p ) i n c a l v i nc y c l e ，g l y c o l y s i sa n dg l u c o n e o g e n e s i s i nc a l v i nc y c l e ，i t c a t a l y z e st h e c o m p o u n d sf r o m3 ct o6 ca f t e rc 0 2f i x a t i o n i ti sa tt h ef i r s tb r a n c hp o i n ta n da tt h e s a m et i m e ，i ti sa l s oi m p o r t a n tt oc o n t r o lt h er a t eo fp h o t o s y n t h e s i s s e c o n d l y ，i ta l s o p a r t i c i p a t e d i nt h eg l y c o l y s i sr e a c t i o nw i t ht h eo p p o s i t er o l et h a tc a t a l y z e dt h e c o m p o u n d sf r o m3 ct o6 c i ti sa l s oi n v o l v e di ng l u c o n e o g e n e s i s ，p e n t o s ep h o s p h a t e w a y s ，a n di ti so n eo ft h ek e ye n z y m ei nt h eo r g a n i s m sw i t ha e r o b i ca n da n a e r o b i c g l y c o l y s i sm e t a b o l i s m t h i ss t u d yf i r s ti d e n t i f i e dt h ep r o d u c to fg e n ea l l17 2 3i na n a b a e n as p p c c7 12 0 a saf r u c t o s e 一1 ，6 - d i p h o s p h a t ea l d o l a s e ，a n dt h e ns t u d i e di t sc h a r a c t e r i z a t i o n sa n d f u n c t i o n t h er e s u l t sa sf o l l o w s ：t h ep r o d u c to fg e n ea l l17 2 3i sac l a s si i f r u c t o s e 一1 ，6 - b i s p h o s p h a t ea l d o l a s eb yb i o i n f o r m a t i c sa n de x p e r i m e n t ；t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so ft h ea c t i v i t yo fp r o d u c to fg e n ea l l17 2 3i s p h 8 。0 ，a d d e d0 2 m m m 9 2 + ，b u ti t sa c t i v i t yc a nb ei n h i b i t e db ylm me d t a ；t h em u t a n to fa l l17 2 3 m & a 1 117 2 3 0w a so b t a i n e d ，w h i c hc a nd ot h ef u r t h e rr e s e a r c ho ft h ea l l17 2 3f u n c t i o n a n a l y s i s k e yw o r d s ：a n a b a e n as p p c c7 12 0 ；g e n ea 1 117 2 3 ；i d e n t i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n ； f u n c t i o n a la n a l y s i s a m p a m p b p b s a c d n a c m c m k a n k a n 。 d n t p e b e d t a h k b m i n o d p c r r m i n s s d s t r i s p d c - a m p r l - a o 7 1 2 0w t 符号与缩写表 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a m p i c i l l i nr e s i s t a n t 氨苄青霉素抗性 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 c h l o r a m p h e r 6 c o lr e s i s t a n t 氯霉素抗性 k a n a m y c i n 卡那霉素 k a n a m y c i nr e s i s t a n t 卡那霉素抗性 d e o x y f i b o n u c l e o t i d e 脱氧核糖核苷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 h o u r 小时 k i l o - b a s e p a i r 千碱基对 m i n u t e 分钟 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 s e c o n d 秒 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s 一 ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 a l i17 2 3 基因敲除鱼腥藻7 1 2 0 突变株 a i l l 7 2 3 基因过表达鱼腥藻7 1 2 0 突变株 w i l dt y p ea n a b e a n as p p c c7 1 2 0 野生型鱼腥藻7 1 2 0 声明 上海师范大学硕士学位论文 论文独创，生声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：商竹日期：厶矽， 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 硪许新虢鹚吼丁2 上海师范大学硕士学位论文1 文献综述 1 文献综述 1 1 蓝藻( b l u eg r e e na l g a ) 蓝藻也称蓝细菌，是一类能够进行光合作用的原核生物，蓝藻属于蓝藻门 ( c y a n o p h y t a ) ，约1 5 0 属，2 0 0 0 余种，通常按形态可分为单细胞蓝藻、丝状体 蓝藻和群体蓝藻。蓝藻作为原核生物，它没有真正意义上的细胞核，没有叶绿体 及线粒体等细胞器的分化。蓝藻具有极强的环境适应能力，它们广泛分布于自然 界中，这是由于蓝藻可以形成多种形式的细胞以适应环境的变化，如形成可以固 氮的异形胞( h e t e r o c y s t ) 、几乎处于休眠状态的厚垣孢子( a k i n e t e s ) 及可以游动 扩散的藻殖段( h o r m o g o n i a ) ( 钟泽璞等，2 0 0 0 ) 。在代谢上，蓝藻可以进行以水 为最初电子供体的放氧光合作用，这与高等植物的光合作用很相似。在固碳途径 上，蓝藻以卡尔文循环的三碳途径为主，但有2 0 的碳是以四碳形式固定的，所 以蓝藻对c 0 2 的利用效率要比大多数三碳途径绿色植物高。此外，有些蓝藻具 有分化的异型胞，有固氮和放氢的功能。 由于蓝藻在细胞结构( 包括超微结构) 、生态学、生理学、生物化学、遗传 学的独特性质及培养方式简单等优点而备受藻类学、分子遗传学、植物系统发育 等许多学者的重视，被广泛地应用于光合作用、，生物固氮、叶绿体起源以及植物 进化等生物学研究除此以外，蓝藻还具有重要的经济价值：如可作为外源基因的 表达宿主用于生产基因工程药物或环保；有些蓝藻可供食用，如淡水生的葛仙菜 ( n o s t o cc o m m u n e ) ，发菜( n o s t o cf l a g e l i f o y m e ) i 地木耳及海生的海雹菜 ( b r a c h y t r i c h i a ) 等；近几年发现有的蓝藻可以开发为保健品，如螺旋藻( s p i r l i n a ) 。 但另一方面，有些种类在夏秋季节水温较高时，突然大量繁殖，产生水华。由于 细胞分解消耗氧气并产生毒素，结果引起鱼类及贝类大量死亡，对淡水养殖危害 ( 严戴等，1 9 9 5 ；李春盛，1 9 9 8 ) 。因此开发蓝藻的应用潜力及控制其危害是必须 同时重视的两个方面。 1 1 1 鱼腥藻7 1 2 0 ( a n a b a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0 ) 鱼腥藻7 1 2 0 ( a n a b a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0 ) ( 见图1 1 ) 隶属于蓝藻纲 ( c y a n o p h y c e a e ) 、念珠藻目( n o s t o c a l e s ) 、念珠藻科( n o s t o c a c e a e ) 、鱼腥藻亚 科( a n a b a e n o i d e a e ) 、鱼腥藻属( a n n a n a e n a ) 。 文献综述 上海师范大学硬士学位论文 鱼腥藻7 1 2 0 是一种丝状体淡水蓝藻藻丝没有分枝。营养细胞呈圆角矩形。 能够进行完整的光合作用。藻体含异形胞，可以进行固氮作用，因此，可以在无 碳无氮的培养基中自养生长。由于其简单的生活方式。因此具有很长的人工培养 历史，人类对其生理生化特征和遗传背景了解的都比较清楚。在八十年代至九十 年代韧建立了较完善的遗传分析系统，是一维生物体细胞分化研究的模式之一。 自1 9 8 4 年w o r k 等建立了鱼腥藻7 1 2 0 的基闳接舍转化系统厉，已成为藻类基固 二i = 鞋中一种较成功的可进行基因操作的模式藻种，被世界上很多实验室广泛用干 各种研究工作中，尤其是在微藻基因工程研究，目前已经成功地转入井表达了多 个外源基因，具有广阔的应用前景。 ，”：埝一一| _ i 曩乏鎏l 图1 1 鱼腥藻7 1 2 0 f i s j la n o b a e n as p s t r a i n p c c7 1 2 0 1 1 2 蓝藻基因组研究概况 | l 于蓝藻结构简单、繁殖迅速便于进行基因操作，在进化上义处于细菌与高 等植物的过渡期，吸引了报多科学家对蓝藻基因组的研究。日本k a z u s ad n a 研 究所于1 9 9 6 年公布了s y n e c h o c y s t i ss p s t r a i np c c 6 8 0 3 的基困组序列t ”，这是第 一个被渊定的蓝藻基因组全序列。此后鼬郾鞭d n a 研究所又完成了黼妇肼 s p p c c7 1 2 0 、t h e r m o 叩e c h o c o c c u s e l o n g a t e s b p - i 等蓝藻的基因组全序列测定， 其他研究机构也开展了一些相关工作有关蓝藻组数据库基因组信息及蓝藻基因 组计划见表l - l 和表i 2 。 上海师范大学硕士学位论文1 文献综述 表1 - 1 蓝藻数据库基因组信息 t a b l e1 - 1c y a n o b a c t e r i ag e n o m ei m f o r m a t i o ni nc y a n o b a s e ( h t t p ：b a c t e r i a k a z u s a o r j p c y a n o ) 3 i 文献综述上海师范大学硕士学位论文 4 表1 - 2 蓝藻基因组计划 t a b l e1 2c y a n o b a c t e r i ag e n o m ep r o j e c t s ( h t t p ：b a c t e r i a k a z u s a o r i p c y a n o ) 上海师范大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 3 鱼腥藻7 1 2 0 ( a n n a n a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0 ) 的基因组研究 鱼腥藻7 1 2 0 是继集胞藻6 8 0 3 之后第二个完成全基因组序列测定的蓝藻 ( k a n e k oe la 1 ，2 0 0 1 ) 。鱼腥藻7 1 2 0 基因组大小为6 4 m b ，另外含有六个内源 性质粒，分别为：a l p h a ，4 0 8 ，1 0 1 b p ；b e t a ，1 8 6 ，6 1 4 b p ；g a m m a ，1 0 1 ，9 6 5 b p ； d e l t a ，5 5 ，4 1 4 b p ；e p s i l o n ，4 0 ，3 4 0 b p ；z e t a ，5 ，5 8 4 b p 。 随着鱼腥藻7 1 2 0 全基因组序列测定完成后，后基因组时代拉开了序幕，很大 一部分鱼腥藻7 1 2 0 基因的功能被鉴定。然而，还有很多基因的功能尚未确定，如 7 6 2 b p 代码为a l l l 7 2 3 的基因，它的产物在c y a n o b a s e a z 被预测为是一个可能的醛缩 酶，但至今尚未有人证实这一点；另一方面，醛缩酶是一种非常重要的生物催化 剂，能可逆地催化醛缩反应，完成碳碳合成，在生物体生理生化反应和有机化学 合成方面有着不可代替的作用。 1 2 果糖一1 ，6 一二磷酸醛缩酶( f r u c t o s e 一1 ，6 - b i s p h a t ea l d o l a s e ) 果糖一1 ，6 一二磷酸醛缩酶( f r u c t o s e 一1 ，6 - b i s p h a t ea l d o l a s e ，f d p a l d ) ( e c 4 1 2 1 3 ) ，其系统名为d 果糖一1 ，6 二磷酸d 一甘油醛3 - 磷酸裂合酶( d f r u c t o s e 一1 ， 6 - d i p h o s p a t ed g l y c e r a d e h y d e 一3 - p h o s p h a t el y a s e ) ，它是由m e y e r h o f 等于19 3 6 年在 兔子的肌肉中首次发现的( m e y e r h o f f e ta 1 ，19 3 6 ) 。至今为止，果糖一1 ，6 - 二磷酸醛 缩酶能催化以下三个反应： 果糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶能将d 一果糖1 ，6 二磷酸催化生成3 磷酸甘油醛和磷 酸二羟丙酮： f b pf 兰g 舢) + d h a p 果糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶也能以果糖1 一磷酸为底物，生成磷酸甘油醛和磷酸二 羟丙酮。 f m pf 当g a p + d 地心 除了这两个可逆的醛缩反应之外，在植物以及c y a n o p h o r a p a r a d o x a 的蓝质 体中的果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶还可以催化d h a p 和赤藓糖4 一磷酸( e 4 p ) 可逆 缩合生成景天庚酮糖一l ，7 一二磷酸( s u b p ) ( f l e c l m e re ta 1 ，1 9 9 9 ) ： a l d e 4 p + d h a p 一s b p 1 文献综述上海师范大学硕士学位论文 因此，果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶既是糖无氧酵解又是有氧氧化代谢过程的重 要酶系之一，与葡萄糖、果糖、赤藓糖代谢关系密切，也与糖原异生作用有关 ( g e f f i a u te ta 1 ，19 9 5 ) 。 1 2 1 果糖一1 ，6 一磷酸醛缩酶的来源 从上世纪3 0 年代果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶被第一次发现到9 0 年代，人们在 不少生物体内发现了这种酶，并对它们的分类、性质及结构有了初步的了解，但 直到9 0 年代后人们更为深入地研究后才了解这类酶是糖代谢中处于将己糖催化 生成丙糖的关键性位置，也是这个反应的限制性酶，这点引起更多的学者对它们 的关注( g e f f i a u te ta 1 ，1 9 9 5 ) 。到目前为止，人们已于2 l 类，近两千种生物体内 发现了这种酶，包括细菌( s a u v ee ta 1 ，2 0 0 1 ，u j i t ae ta 1 ，1 9 8 2 ，h i l le ta 1 1 9 7 6 ) 、原 生动物( g a l k i ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 、藻类( w i l l a r de ta 1 ，19 6 8 ) 等原核生物及真菌( l e w i se t a 1 ，19 7 3 ) 、酵母( g i a e v e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 、绿色植物( b r o o k se ta 1 ，19 6 6 ，a n d e r s o ne ta 1 ， 19 7 2 ) 、高等动物( t a y l o re ta 1 ，19 4 8 ，r i c h a r de ta 1 ，19 6 1 ) 等真核生物。在绿色植物 中，它存在于叶绿体和细胞质中，分别参与卡尔文循环和糖酵解的作用( a n d e r s o n e ta 1 ，1 9 7 2 ) 。而在动物中，果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶广泛存在于脑、心脏、肌肉、 胃肠道及卵巢中，主要参与糖酵解和糖异生作用( k h a ne ta 1 ，1 9 9 9 ，h o r e c k e re ta l 。， 1 9 7 2 ) 。 1 2 2 果糖一1 ，6 磷酸醛缩酶的分类 根据催化机制的不同，r u t t e r 将果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶分为两大类( r u t t e r , 19 6 4 ) 。i 类果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶其活性部位的赖氨酸残基与羰基底物f b p 或 d h a p 形成受硼氢化物的抑制( l e b h e r ze ta 1 ，1 9 6 9 ) 的s e h i f f 碱中间体，随后 转变成烯胺中间体进而立体选择性地进攻醛受体实现对底物的活化( l u b i n ie ta 1 ， 1 9 7 9 ，l a ie ta 1 ，1 9 7 4 ，l e e se ta 1 ，1 9 9 3 ，m o r r i se ta 1 ，1 9 9 3 ，j e a ne ta 1 ，2 0 0 5 ，) 。这类 酶主要存在于真核生物体内，如高等植物及动物。在光和植物中，这类醛缩酶分 别存在于叶绿体和细胞质中，它们行使着不同的生理功n 匕( t a y l o re ta l 。，1 9 4 8 ) ；而 在脊椎动物中，它们具有三种同工酶( h o r e c k e re ta 1 ，1 9 7 2 ) ：a l d o l a s ea 在肌肉中 表达；a l d o l a s eb 在肝脏、肾脏、胃及肠道中表达，既参与糖酵解又参与糖异生； a l d o l a s ec 在脑、心脏及卵巢中表达，主要参与糖酵解。在细菌、藻类等一些低 等生物中也发现这类酶存在( t h o m s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ，s c h u r m a n ne ta 1 ，2 0 0 1 ，t h o r e l l 6 上海师范大学硕士学位论文 1 文献综述 e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，只是它们与典型的i 类果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶在基因序列上仅有很 小的相似性，所以人们也把这类酶归为i 类a 果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶( s i e b e r se t a 1 ，2 0 0 5 ) 。有文献报道在古细菌中也发现有这类酶存在，由于它活性位点上存在 着s c h i f f 碱中间体所以最初被归为i 类，然而它的碱基序列和其它物种的i 类醛 缩酶有很明显的不同，这一点引起了一些学者对它起源问题的注意，所以他们把 这类酶归到了第1 i i 类( e s b e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。l 类果糖一1 ，6 二磷酸醛缩酶的蛋白分子 量约为1 6 0 k d a ，大约有3 6 0 个氨基酸，它们是由几个( p a ) 8 桶型结构的单体所组 成。在真核生物中总是为四聚体，而在原核生物中为单聚体或者二聚体( j e a ne ta 1 ， 2 0 0 5 ，p l a u m a n ne ta 1 ，1 9 9 7 ，朱文渊等，1 9 9 8 ) 。由于这类醛缩酶的活性中心并没 有金属离子占据，所以其活性不需要依赖金属离子，而金属汞能强烈抑制这类醛 缩酶的活性( w i l l a r de ta 1 ，19 7 5 ) 。 相反地，i i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶主要分布于比较低等的生物中，如原生 动物、细菌、藻类等，在一部分真核生物如酵母、真菌中也有报道。1 9 4 3 年w a r b u r g 和c h r i s t i a n 发现f e 2 + 能提高这类酶的活性( w i l l a r de ta 1 ，19 6 8 ) ，之后人们发现在 它们的活性位点上连系羟基和羰基的是二价金属离子( z g i b ye ta 1 ，2 0 0 0 ，z g i b ye t a 1 ，2 0 0 2 ，h a l le ta 1 ，1 9 9 9 ) ，一般是z n 2 + ，所以这类酶的活性必需依赖于二价金属 离子。除了z n 2 + 外，c 0 2 + 、m 9 2 + 甚至是m n 2 + ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 都能提高它们的 活性。而对于一些藻类，除二价金属离子，添加适量的半胱氨酸也可大大增强这 类酶的活性( w i l l a r de ta 1 ，1 9 6 8 ) 。金属汞能轻度抑制这类醛缩酶的活性( w i l l a r d e t a i ，1 9 6 8 ) ，而一定浓度的e d t a 可完全抑制它的活性( p l a t e r e ta 1 ，1 9 9 9 ，q a m a re t a 1 ，1 9 9 6 ，z g i b ye ta 1 ，2 0 0 2 ) 。目前对于i i 类醛缩酶的催化机理有多种说法，最近 d r e y e r 等( d r e v e re ta 1 ，19 9 6 ) 研究了一类用于模拟磷酸二羟丙酮酯二烯醇化过渡 态的含抑制剂的磷酸a l d o l 酶的晶体结构，可以较好的论证i i 类醛缩酶的催化机 理。根据碱基序列的不同，i i 类果糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶还可继续分为a 型和b 型， 一般来说，a 型的n 末端会比b 型多至少7 个氨基酸序n ( s a u v ee ta 1 ，2 0 0 1 ， n a k a h a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。通常大多数i l 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶都是a 型，它们 参与糖酵解与糖质新生代谢，主要存在于g c 较高的革兰氏阳性菌中，如大肠 杆菌、肺结核分枝杆菌、蓝氏贾第鞭毛虫等- 和y 原生动物；另外，在真核生 物如啤酒酵母( w i l l a r de ta 1 ，1 9 6 8 ) 体内发现的i i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶也都是 7 1 文献综述上海师范大学硕士学位论文 a 型的。其余- d , 部分i i 类果糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶为b 型，它们参与糖质异生 代谢，主要存在于g c 较低的革兰氏阳性菌中，如藻类( w i l l a r de ta 1 ，1 9 6 8 ) 、水 生嗜热菌( s a u v ee ta 1 ，2 0 01 ) 、棒状杆菌( u j i t ae ta 1 ，19 8 2 ) 及嗜热脂肪芽孢杆菌( h i l l e ta 1 1 9 7 6 ) 等少数的0 和p 一细菌中。通常i i 类果糖一1 ，6 一二磷酸醛缩酶的蛋白分子 量比i 类要大得多，它们也是由几个( 0 【) 8 桶型结构的单体组成，每个单体的活 性区域都占据了个二价金属离子。其中a 型一般是二聚体( g i a e v e re ta 1 ，2 0 0 2 ) ， 而b 型有二聚体( b i o t ae ta l 。，1 9 9 6 ) 、四聚体( g i a e v e re ta 1 ，2 0 0 2 ) ，集胞藻6 8 0 3 中 的i i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶是八聚体( n a k a h a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 广 c h _ = c r 4 ) o h 一身04 扒、 d 鼍p f 穗旨旧t 妇1、o p o ， 一帕4 卜；一h ：神n ” 哪喾o - xf 璺：曩4 哪罗弋。0 = 。：z 4 。o ， o 1 唧蚋 要 f p 燃h ， 叁? 图1 - 2 根据催化机制的不同，果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶的分类 f i g l 一2t h et y p e so f f r u c t o s e 一1 ，6 - b i s p h a t ea l d o l a s eb a s i co ni t sc a t a l y s i sm e c h a n i s m 虽然这两类醛缩酶催化了相同的反应，并且它们的单体都遵循( 1 3 a ) 8 桶型结 构，但是它们催化反应的机制、氨基酸序列的同源性( b l o me ta 1 ，19 9 6 ) 、存在的 物种及聚合物的形式都不相同。之前提及在一些比较低等的生物体内发现两类果 糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶均存在( s a n c h e ze ta 1 ，2 0 0 2 ，k r o t he ta 1 ，2 0 0 5 ) ，但是它们行 使的功能是完全不同的，如将集胞藻6 8 0 3 中的l 类果糖1 ，6 一二磷酸醛缩酶敲除， 可以得到存活的突变株，而敲除了l i 类之后却无法得到突变株，这说明了i i 类 果糖一1 ，6 一二磷酸醛缩酶在集胞藻6 8 0 3 中执行了主要的生理功能( n a k a h a r ae ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。 由此可以推测这两类醛缩酶是由同一个( 1 3 a ) 8 桶型结构的单体向两个独立的 方向进化( n a g a n oe ta 1 ，2 0 0 2 ，m a r s he ta 1 ，1 9 9 2 ) ，而在进化的程度上r i c h a r d ( r i c h a r de ta 1 ，19 6 1 ) 提出i i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶要远远早于i 类，而一开始 r 上海师范大学硕士学幢论文 i 文献综述 这两类酶都来源于单细胞的绿藻，这两类酶分别存在的物种也为这种理论提供了 证据。 幽卜3 两类聚暗1 6 - 二磷酸醛缩酶单体的( 8 ，咄桶型结构。 f 培i - 3 ( 1 h b m e ts t m c t m e o f t h e f h m 眦e i ，6 - b i s p h a l e a l d o l 嬲e 1 2 3 果糖- l 6 磷酸醛缩酶的结构 人们对于i 类果旗i 6 - = 磷酸醛缩酶的结构了解比较透彻删a 哪i a 帅e t 柚。1 9 9 7 ) ，这是由于t a y l o r 等在研究兔子肌肉细胞的这类酶时发现它占了肌肉可 溶性蛋白的3 ，可以很容易把它分离纯化出来，继而研究它的性质( t a y l o r 就e 1 ， 1 9 4 8 ) 。另一方面，人们对l 类醛缩酶的研究历史相对较长，后来人们又分别将 大肠杆菌及兔子肌肉细胞中分离出来的i 类醛缩酶培养成结晶，进而确认了它们 的蛋白结构。 g i l m o r e 和m i c h e l s 等在研究了1 4 种i 类果糖，l ，6 - 二磷酸醛缩酶之后发现它 们之间都具有很高的同源性，比如人肌肉中醛缩酶的3 6 3 个氨基酸中仅仅只有4 个和兔子肌肉的醛缩酶的氟基酸不同，这可以推出这类醛缩酶在进化的过程中初 级结构具有很强的保守性( g i l m o r ec ta l ，1 9 9 3 ) 。1 9 8 8 年s a w y e r 等( s a w y e re te l ， 1 9 8 8 ) 又提出了用一种模型来表示这类醛缩酶的结构，后来的x 射线晶体衍射证 实了他们的观点，发现无论是人肌肉( s y g u s h e ta 1 ，1 9 8 n 兔子肌肉( g a m b l i n c ta i ， 1 9 9 0 ) 或者果蝇( h e s t e re t 柚，1 9 9 1 ) 中的这类醛缩酶基本有着同样的结构。相对地， 对类果糖1 6 - - - - 磷酸醛缩酶的晶体结构了解甚徽，所以其结构也远没有i 类 来得清楚。 蜜 1 文献综述 上海师范大学硕士学位论文 1 2 4 果糖1 ，6 磷酸醛缩酶的功能 1 2 4 1 果糖1 ，6 磷酸醛缩酶参与的代谢 果糖1 ，6 - 二磷酸醛缩酶的主要功能是催化己糖的合成或分解。它参与了包 括卡尔文循环、糖酵解、糖异生及磷酸戊糖途径等几乎一切生物体生存和维持正 常生理活动所需的代谢反应( 王镜岩等，2 0 0 2 ) 。其中卡尔文循环和糖酵解是两个 互逆的代谢过程，卡尔文循环是光合作用中暗反应的一部分，是光合碳同化的一 条最重要的途径，包括三个阶段。果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶参与了第三阶段：核 酮糖1 ，5 一二磷酸的再生。在这个阶段磷酸二羟丙酮在磷酸丙糖异构酶催化下转 化为3 磷酸甘油醛，然后再与磷酸二羟丙酮在果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶的催化下 转化为果糖1 ，6 二磷酸。由此看来，果糖。l ，6 - - - 磷酸醛缩酶是卡尔文循环中固 定c 0 2 后第一个催化由3 c 化合物转化为6 c 化合物的酶，处于第一个分支点上， 同时它也是控制光合作用速率的重要酶之一a 而糖酵解是指葡萄糖在无氧条件下生成丙酮酸的过程，主要包括两个阶段。 在第一阶段葡萄糖经磷酸化及重排后转化为果糖6 磷酸，后又经磷酸果糖激酶 催化生成果糖1 ，6 二磷酸，此时就需要依赖果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶催化，生成 3 一磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，由此可以看出，在这个代谢过程中果糖1 ，6 二磷 酸醛缩酶是将6 c 化合物转为3 c 化合物。 一开始，人们认为i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶比i i 类更能催化己糖的合成。 这是因为在一些真核生物中，i i 类果糖1 ，6 二磷酸醛缩酶只能参与以糖类为来源 ， 的糖酵解作用，而当来源是非糖类的糖异生过程却只能依靠l 类醛缩酶催化 ( s t r i b l i n ge ta 1 ，1 9 7 3 ，f i s c h e re ta 1 ，1 9 8 2 ，s c a m u f f ae ta 1 ，1 9 8 0 ) 。后来j a m e s 等认为 在生物体内，这两类醛缩酶在合成己糖上功能是等同的。这是因为大多数生物无 论是以糖类还是非糖类为营养来源的生存条件下只