（食品科学专业论文）γ亚麻酸产生菌深黄被孢霉细胞膜通透性调控的研究.pdf

y 一亚麻酸产生菌深黄被孢霉细胞膜通透性调控的研究 摘要： y 一亚麻酸( g l a ) 有众多的的保健功能，目前采用微生物方法对其进行的 研究主要集中在诱变和培养条件得优化方面。本文重在应用物理、化学方法对深 黄被孢霉突变株细胞膜通透性进行调控，以获得更高的g l a 产量。 一 以深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) a s 3 3 4 1 0 为出发菌株，经i n ，、l i c l 复合 诱变处理，随机筛选后复筛，最终获得一株突变株s h f i 】- 1 3 。其种子发酵两天， 摇瓶发酵8 天时，生物量和总脂量分别达2 1 6 6g l ，1 2 6 5g l ，在同等条件 下比出发菌株分别提高了8 8 4 和3 6 6 1 。气相色谱分析其油脂组成，y 一亚麻 酸含量为6 3 9 ，产量为0 8 1 9 l ，产量较对照样提高4 4 6 4 。连续传代多次， 其产量性状无显著变化。 以深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) s t 矾j - 1 3 为出发菌株，经d e s 诱变处理， 最终获得一株突变株s 盯u - 1 3 3 。其种子发酵两天，摇瓶发酵8 天时，生物量和 总脂量分别达2 5 3 0g l ，1 1 9 5g l ，在同等条件下比出发菌株( 2 1 0 8g l ， 1 0 8 8g l 分别提高了2 0 0 2 和9 8 3 。气相色谱分析其油脂组成，y 一亚麻酸 含量为6 9 9 ，产量为0 & i g l ，产量较对照样( 0 6 7 9 l ) 提高2 5 3 7 。连续传代 多次，其产量性状无显著变化。 通过物理化学方法调控或通透性突变株的选育，改变细胞膜通透性，促进细 胞外营养物质进入细胞内或者细胞内代谢产物分泌到胞外，克服胞内产物的抑制 作用，从而增强目标产物的代谢通量。 以深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) s h f u - 1 3 为出发菌株，经物理化学方法 对发酵菌体进行膜通透性的调控，可以提高菌体对营养成分的利用，最终确定低 频超声波4 m i r a 与制霉菌素0 0 5 m l 的添加有利于y 一亚麻酸产率的提高。其种子 发酵两天，摇瓶发酵8 天时，气相色谱分析其油脂组成，y 一亚麻酸含量为6 7 1 和6 7 3 ，产量为0 6 4 9 l 和0 6 7 9 l ，产量较对照样提高1 8 5 1 和2 4 0 7 关键词：物理化学诱变；通透性；超声波；两性霉素b ；制霉菌素 r e s e a r c h i n go f t h ec e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t yc o n t r o lo n g l a p r o d u c e ds t r a i nm o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a a b s t r a c t ： g i l ah a sm a n yf u n c t i o n si nh e a l t hc 勰h o w e v e r , m a n yr e s e a r c h e r e m p h a s e s o nt h em u t a n t i o no fs t r a i n sa n dh o wt oo p t i m i z et h ec u l t u r en l c d i u l 3 1 t h er e s e a r c h a p p l i e dp h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o r d st oe h a n g et h ec e l lm c n a b l a n ep e r m e a b i l i t y , i n o r d e rt om a 幺et h e1 i g h e fo u t p u to fg l a ai n l l t a n t $ 1 1 , a i ns h f u 一1 3w a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e dw h e nt h eo r i g i n a ls i r d i l l m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aa s 3 3 4 1 0w a st r e a t e db yi i va n du aa sm u t a t i n ga g e n t t h e b i o m a 豁i su pt 02 1 6 6 啦w h i c h 罐8 8 4 h i g h e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a l $ 1 1 。d i n w h i l et h ep r o d u c to ft h et o t a ll i p i ai su pt o1 2 6 5 班，w h i c hi s3 6 6 1 h i g h e rt h a n t h a ti nt h eo r i g i n a ls r d i l lm y c e l i u m a n a l y s i sb yg a sc h r o m a t o g r a p hi n d i c a t e dt h e c o n t e n t o f g l a i n t h e l i p i d i s 6 3 9 w h i l e t h e p r o d u c t o f i t i s u p t o o 8 1 9 r t w h i c h i s 4 4 6 4 h i g h e rt h a nt h a to fl t a eo r i 百n a ls i i r i l l a f t e rp a s s i n go n m a n yt i m e s ，t h e r e w e r c1 1 0d i s t i n c tc h a n g e so i lt h ep r o d u c t i o n am i l t a n ts t l d i ns i - i f i j - 1 3 - 3w a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e dw h e nt h eo r i g i n a ts l r a i n m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a $ t t f u - 1 3w a st r e a t e db yd e sa sm u t a t i n ga g e n t t l a eb i o m a s s i su pt o2 5 3 0g 儿w h i c hi s2 0 0 2 h i g h e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls w i t i l lw h i l et h e p r o d u c to ft h et o t a ll i p i di su p 幻i1 9 5 9 1 l w h i c hi s9 8 3 h i g h e rt h a nt h a ti nt h e o r i g i n a l $ 1 1 d j nm y c e l i u m a n a l y s i sb yg a se l a r o m a t o g r a p hi n d i c a t e dt h ec o n t e n to f g l ai nt h er , p i di s6 9 9 w h i l et h ep r o d u c to fi ti s 叩幻0 8 4 9 l , w h i c hi s2 5 3 7 h i g h e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls w a i n a f t e rp a s s i n go i lm a n yt i m e s ，t h e r ew c l en o d i s t i n c tc h a n g e s0 1 1t h ep r o d u c t i o n t h ee n h a n c eo fp e r m e a b i l i t yc o u l di m p l o y et h ee x c h a n g i n gr a t eo fn u t r i e n t s 矗nt h ec u l t u r em e d i u mi n t oc e l l ；0 1 1t h eo t h e rb a n d 曲【em e t a b o f i t e sa i eo u to ft h e m c m b r a l l c , e ，a l lo fw h i c hc o u l de n h a n c em e t a b o l i cf l u xo ft h ea i m e dp r o d u c tb y p e r m e a b l em u t a t i o na n ds o m ep b y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d s t h ee n h a n c eo fp e r m e a b i l i t yc o u l di m p r o v et h ee x c h a n g i n gr a t eo fn u l r i e n t s f r o m t h e c u l t u r e n l 司l i u l n i n t o c e l l ，w h i c hg o u i d g n h a n c e m e t a b o l i c f l u xo f t h e a i m e d p r o d u c tb yg o l l l ep h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d s a n a l y s i sb yg a sc h r o m a t o g r a p h i n d i c a t e d t h e c o n t e n t o f g l a i n t h e p i i d 面6 7 i a n d 6 7 3 w h i l e t l i e p r o d u c t o f l t i s u pt o0 6 4 9 la n d0 6 7 9 lw h i c hi s 1 8 5 1 a n d2 4 0 7 h i g h e rt h a nt h a to fm e o a g i m ls t r a i n k e y w o r d s ：p h y s i c a l a n dc h e m i c a l m u t a t i o n ；p e r m e a b i l i t y ；u l l r a s o u n d ； a m p h o t e r i e i nb ：n y s t a f u n g i n 上海水产大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 ) 学位论文作者签名：客魑i 女肺 扫期：溯年月，日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密增 学位论文作者签名：触 日期：叼年渊泪 指导教师签名：耖 日期如岈年厶月瑁 上海水产大学硕士学位论文 第一章前言 1 1g l a ( 1 r - 亚麻酸) 的结构和性质 g l a ( y 一亚麻酸g a m m al i n o l e n i ca c i d ，g l a ) ，化学式为c l 出3 d 0 2 ，分子量为 2 7 8 ，属n - 6 系列多不饱和脂肪酸，化学名为：反6 9 ，1 2 一十八碳三烯裂n ，分子结 构如下； 它是无色油状液体，不溶于水，易溶于石油醚、乙醚、正己烷等非极性溶剂中， 在高温条件下极易氧化，在碱性条件下易发生双键位置构型的异构化反应，形成 共轭多烯酸2 。碱异构化的性质可应用于紫外光谱法定量测定y 一亚麻酸州。 1 2g l a 的生理功能 e x 戈移 i 血0 h 址 c ll l l 阳瑚叫_ 曲喇嘲叫l 时h 骼置 图1 多不饱和脂肪酸在人体内的代谢途径嗍 f i g 1 m e t a b o l i c p a t h w a y o f p u f a s i n h u m a n b o d y 【5 l 在上世纪7 0 年代中期，d y e r b e r g 等a 旧发表的一份流行病学调查资料显示，同 属于丹麦领地的格陵兰岛爱斯基摩人( e s k i m o s ) , t , 血管病率远低与丹麦内地居民。 前者饮食以鱼、海豹等海洋动物为主，后者则是典型的高脂肪、高胆固醇肉类食 物。后来发现，爱斯基摩人的膳食组成中含有丰富的多不饱和脂肪酸，因此推测 该人群心血管病发病率低与大量摄入多不饱和脂肪酸有关忉。8 0 年代初，s i e s s 嘲 1 上海水产大学硕士学位论文 证实了海洋动物油脂在人体内具有抗血小板凝聚作用，至此人们才普遍意识到， 多不饱和脂肪酸不仅在生物膜的结构和功能上起作用，而且还有更重要的生物活 性。 多不饱和脂肪酸在哺乳动物体内合成如图1 所示，由亚油酸转化两种亚麻酸， 其中g l a 可形成二高一y 一亚麻酸( d h g l a ) 和花生四烯酸( a r a ) ，进一步转 换为前列腺素( p r o s t a g l a n d i n s , p c , s ) 、血栓素( t h r o m b o x a n e s ，t x ) 、白细胞三烯 ( l e u k o n i e n e s ，l t ) 等重要衍生物，作为人体必要脂肪酸参与细胞膜的组成、调节细 胞的生理生化活性等一系列作用。研究表明g l a 有防治心血管疾病、增强人体的 免疫、抗肿瘤、抗多种炎症等功效凹。 ( 1 ) 抗肿瘤作用 多不饱和脂肪酸具有明显的抗脂质氧化作用，可减轻过氧化脂质对细胞的损 伤。研究已经确认了g i 。a 对乳腺癌、肺癌、肝癌、子宫癌、皮肤癌、卵巢癌、前 列腺癌细胞等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用1 阻1 4 1 。 ( 2 ) 抗粥样硬化作用和治疗高血压 高血脂、高胆固醇是动脉粥样硬和化和冠心病发病的诱因。g l a 和人体内的 代谢产物( a r a 、p g e ) 可使血液中的甘油三酷( t g ) ，总胆固醇f r c ) 、极低密度脂 蛋白( v l d l ) 和低密度脂蛋白l ) 降低，高密度脂蛋i ；i ( i - i d l ) 升高，并且能抑制血 小板的聚集和动脉粥样斑块的形成。在临床上可用于防治冠心病、心肌梗死等疾 病陋切。 此外，g l a 代谢产物前列腺素( p g e 2 ) ，作为血压调节物质p g e 2 能够通过激活 血管平滑肌腺昔酸环化酶，增n c a m p 水平而舒张血管，调节机体水和电解质代谢 或与其它血管活性激素相互作用等方式来参与血压调节0 6 1 。 ( 3 ) 抗菌作用 g i 。a 对多种革兰氏阴性菌、阳性菌等生长有抑制作用。抑菌作用可能和g l a 进入细胞壁后，结合或插入细胞膜，改变膜的流动性和生理性质。研究证实：g l a 可抑制铜绿假单胞菌、大肠杆菌掣1 r l 。 ( 4 ) 抗蛐 v 感染作用 k i n c h i n g t o n 等人的研究表明：在添加t 一亚麻酸锂的培养基中培育4 d 后，大约有 2 上海水产大学硕士学位论文 9 0 的被h 1 v 感染的细胞被杀死，同时未被感染的对照组细胞只损失了2 0 。在添 加抗氧化剂v e 后，l i g l a 的毒性明显降低，所以l i g l a 被认为对 玎慢性感染细 胞的选择性杀伤效果可能与膜脂过氧化状态的变化有关1 羽。 ( 5 ) 其它方面作用 g l a 还具有增强免疫力、抗多种炎症、抗脂质过氧化、延缓皮肤老化、抑制 溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用3 1 蚴。随着对其生理功能研究的不断深 入，g l a 不仅在强化与保健食品中有重要的应用而且在药品、高级化妆品的制 造等方面也具有非常广阔的前景。 1 3 合成g l a 的代谢途径 1 3 1g l a 的合成途径 葡萄w ( g l u c o s e ) l r h m ( p , ) r u 、，i ca c i d ) 乙融似卜c o r - - 酸单酰a c p ( m a i o n y ia c p ) l 。 棚酬p r d 哪 硬脂酸( s t e a ca c i d ) i 油烈o l e i ca c i d ) 亚油酸( l i n o l e i ca c i d ) ll 3 上海水产大学硕士学位论文 g l a 的合成历程见图2 ，脂肪酸的合成由乙酰辅酶a 转化为丙二酸单酰c o a ， 在脂肪酸合成酶系( f a s ) 的作用下合成不同碳链长度的脂肪酸，直至棕榈酸。棕 榈酸在线粒体脂肪延长酶系可以继续延长，或者在脂肪酸脱氢酶的作用下形成双 键，脱氢和碳链的延长可交替进行 2 3 1 。g l a 的生物合成是以饱和的十八酸为脱氢 底物，依次在9 、1 2 和6 月目肪脱饱和酶转化为油酸( o a ，c 1 8a 9 ) 、亚油酸( l a ， c l sa 9 。1 2 ) 和y 亚麻酸( g l a ，c 1 一一2 ) 。特别指出，脱氢的过程并不是以游 离脂肪酸的状态为底物，而是以c o a 结合或以脂酰基结合的形式转化的臻凋。 脂肪酸合成受到乙酰c o a 羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸酶的调控，柠檬酸 可激活乙酰c o a 羧化酶，有利于脂肪酸的合成厕。但多不饱和脂肪酸的调控尚 不明确，但与脱氢酶有着密切的关系。 1 3 2g l a 的资源状况 许多植物具有合成g l a 所需的脂肪酸脱氢酶，因而可以合成g l a 等多不饱和 脂肪酸。植物种子是获取g l a 的主要来源。目前在已知的8 0 多种高等植物种子油 中含有一定量的g l a t z t 】，尤其是胚芽中最高。月见草( o e n o t h e r ab i e n n i ) 种子油 是目前g l a 的最大来源，种子中含有约为o 2 的g l a 。此外，还有紫草科玻璃苣 ( b o r a g eo f f i c i c i n a l i s v l ) 。黑醋粟( b l a c kc u r r a n t ) 等种子油中含有较高的g l a 。但 此种资源由于易受到气候、地域和季节的限制和生长周期较长的问题，而不能满 足市场对其的需求。 1 9 4 8 年，a l b r e c h t 等首先发现了在拉克须霉( p h c o m y c e sb l a k e s l e a u s ) 菌丝体脂 肪中含油y 亚麻酸，且含量高达1 6 。此后陆续报道了被孢霉属( m o r l i e r e l l a ) ， 根霉属( r h i z o p u s ) ，小克银汉霉属( c u n n ia r r l a l l a ) ，毛霉属( m u c o ：) ，枝霉属 ( t h a m n i d i u m ) 等菌株可产g l a 。目前国内外用于工业化生产所采用的菌株，主要 是被孢霉属的深黄被孢霉( m o r t i e r e u ai s a b e l l i n a ) i 篮- z g 。 藻类中研究中发现纯顶螺旋藻( & p l a n t e n s i s ) 和巨大螺旋藻( m a x i m a ) 中 g l a 含量相当高，占总脂肪酸的2 0 3 0 【m 1 1 。 4 上海水产大学硕士学位论文 1 4 微生物合成g l a 研究现状 相对于月见草等植物提取g l a 来说，微生物合成g l a 的方法具有不受环境季 节的影响、生产周期短和成本低等优势，成为国内外研究的热点。 最早采用微生物生产油脂开始于1 9 4 4 年油脂资源枯竭的德国，s t a r k y 发现油脂 酵母属咖c b 9 的酵母可以生产油脂【3 2 】，随后人们又对斯达利油脂酵母 ( l i p o m y c e s 肋咖) 产油培养条件进行了研究。而y 一亚麻酸发酵法生产的研究工作在 日本和英国率先开展。日本工业技术院化学技术研究所从1 9 7 6 年开始利用丝状真 菌生产油脂的研究工作，他们在被饱霉属中发现了油脂含量高并富含p 亚麻酸的菌 株，建立了高密度培养法制造含t 亚麻酸的油脂及生产t 一亚麻酸的方法。此后，日 本的资生堂公司、出光石油化学公司以及英国的一家公司相继采用发酵法商业化 生产t 亚麻酸。目前生产的菌丝体油脂含量已达3 5 以上，脂肪酸中r - 亚麻酸的含 量己达1 8 左右，发酵法生产的1 ，亚麻酸产品己广泛用于药品、保健食品和高级化 妆品的生产。我国对微生物发酵法生产y 亚麻酸的研究起步较晚，目前仅有上海工 业微生物研究所、天津南开大学微生物系等几家单位在近年来开展了研究工作， 但这些研究仍处于实验阶段，仅有上海工业微生物所进行过5 0 0 l 发酵罐生产y - 亚 麻酸的小型试验，结果菌体脂肪酸中1 ，亚麻酸的含量仅为8 。目前国内水平同日 本、英国相比有较大差距，主要表现在菌株产生t 一亚麻酸的水平较低，还不能商品 化生产口3 - 划。 目前主要集中在对菌体的油脂含量和g i a 产量为对象，开展了育种、条件优 化和基因工程的研究工作，但对于发酵过程中通过通透性调控促进g l a 合成的报 道尚不明确。 1 4 1 代谢控制育种 ( 1 ) 切断或减弱支路代谢：通过切断或减弱非所需的脂肪酸的合成的支路代谢途 径，使更多的磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰c o a 、亚油酸生成所需的不饱和脂肪酸。根 据报道，采用d 亚麻酸缺陷、花生四烯酸缺陷、二十碳五烯酸缺陷型突变株，均 有助于y 亚麻酸的提高孤3 4 - 3 s l 。 5 上海水产大学硕士学位论文 【2 ) 挑选脂肪粒大，密度高的突变株：对菌株镜检可观察到菌丝体内存在折光性 很强的液滴脂肪酸。挑选脂肪粗大，密度高的突变株，有助于多不饱和脂肪 酸产量的提高。 ( 3 ) 解除反馈抑制调节：通过选育对所需的不饱和脂肪酸结构类似物抗性突变株或 耐高浓度所需不饱和脂肪酸的突变株，可以解除反馈抑制，使得代谢更加流畅， 从而提高产量。如报道，y 亚麻酸的类似物l 1 限r 抗性突变株和耐高浓度y 亚麻酸 突变株，均能不同程度地解除y 亚麻酸的反馈抑制。 ( 4 ) 强化能量代谢：细胞内的a t p 水平高时，在细胞质中合成的乙酰c o a 被用于脂肪 酸的生物合成。若细胞内a t p 水平降低、则脂肪酸的生物合成终止。因此提高菌体 细胞内i p 的水平有利于脂肪酸的合成。选育呼吸抑制剂( 丙二酸、氰化钾、亚砷 酸等) 抗性突变株，a d p 磷酸化抑制剂( 羟胺、2 ，4 一= 硝基酚等) 抗性突变株，抑 制能量代谢的抗生素( 缬氨霉素等) 抗性突变株均有助于多不饱和脂肪酸产量的提 高。 ( 5 ) 增加前体物的合成：菌体生物合成多不饱和脂肪酸与h m p 、d 仰途径直接有关。 增强如江p 途径n a i ：d p h 的数量增多。有利于不饱和脂肪酸产量的提高。过量的磷 酸盐或通气不足会使m 佃途径增强，而产蚰n a d p h 的加讧p 途径受阻，导致不饱和 脂肪酸的合成降低。通过选育对单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突变 株，均有利于加强麟p 途径从而增加花生四烯酸及y 一亚麻酸生物合成的前体 物，有利于目的产物的高产。 ( 6 ) 选育低温生长的突变株：细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白 质组成，脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的流动性 也就越大，即微生物生长的温度也就越低。据报道，选育在相对低温( 1 5 ) 条件下 生长良好的突变株，结果其y 亚麻酸的产量提高了1 4 倍。 ( 7 ) 选育耐高糖的突变株：在代谢调控发酵中，常采用耐高渗透压突变株。在一定 范围内，y 一亚麻酸的产量随糖的浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体 生长，降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变株，可使菌体高效率地利 用葡萄糖从而提高y 亚麻酸的产量。 ( 8 ) 选育特异性的脱氢( 脱饱和) 酶活性强的突变株：6 _ 一脱氢酶是微生物合成y 6 上海水产大学硕士学位论文 一亚麻酸的关键酶之一二其活性的高低复接与y 亚麻酸或花生四烯酸含量的高低 密切相关，可采用1 1 c 酶活测定法来反映t 脱氢酶的活性。t 1 为一种无色的 氧化还原剂能被6 一脱氢酶还原成红色的物质。红色越深，表明菌体内的6 一脱氢酶活力越高，y 一亚麻酸的积累也越多。 1 4 2 培养条件 ( 1 ) 培养基：不同碳源对不饱和脂肪酸的生物合成有着极大的影响。一般来说， 葡萄糖是生物合成不饱和脂肪酸的最佳碳源。黄建忠等利用深黄被孢霉( m o r t i e - r e l l ai s a b e l l i n a ) 变异种m o l 8 合成卜亚麻酸的以葡萄糖、淀粉和双糖为碳源对产脂 肪酸影响的研究表明以葡萄糖为碳源时可以获得最大的生物量6 6 4 和较高的碘 价8 9 4 ，而淀粉效果最差 3 6 - 3 9 。 氮源来源的不同对总脂量和多不饱和脂肪酸的相对含量的影响各不相同。一 般来讲，无机氮源有利于多不饱和脂肪酸的合成。 此外，c n 的比率对多不饱和脂肪酸的产量也有重要的影响。一般情况下，高 的c n 比率有利于丝状真菌脂质的积累，当氮源消耗至较低浓度对，油脂的合成量 急剧加强，而过量的氮源不利于油脂合成。但是碳氮比率过高，则脂质中的多不 饱和脂肪酸含量将会下降4 0 4 2 】。 ( 2 ) 其它促合成因子：某些金属离子和非表面活性剂等有促进多不饱和脂肪酸的合 成，提高产量的作用。黄建忠等研究发现，7 _ , 1 1 2 + 在一定浓度下可以刺激去饱和酶的 活性，可提高油脂的不饱和度。关洁文等采用5 l 发酵罐研究了醋酸盐、非表面活 性试剂、铁离子和植物油对被孢霉发酵生产亚麻酸的影响的研究发现培养基中添 加2 的橄榄油和0 5 m l l - 1 的吐温2 0 可使生物量和亚麻酸提高2 0 ，最终十亚麻酸 产量可达到2 0 8g l - 1 。 ( 3 ) 温度：温度对产不饱和脂肪酸的微生物的生物量和脂肪酸含量和组分有着重要 的影响。一般2 5 - 3 0 较高的温度有利于真菌的生长。低温条件下细胞增加多不饱 和脂肪酸的形成来提高细胞膜的流动性，因此低温有利于不饱和脂肪酸的积累， 特别利用低温生长的突变株发酵长链高不饱和脂肪酸产生。 ( 4 ) 其它因素：除了上述条件，茵龄、接种量、培养基p h 值、添加前体物、光照 7 上海水产大学硕士学位论文 和通气量等也会影响多不饱和脂肪酸的产量 4 2 硼。 去饱和的反应需要氧，因此增加溶氧量将有利于多不饱和脂肪酸的合成。培 养基的p h 值对不饱和脂肪酸的产量也有所影响。文献报道产g l a 被孢霉m 1 4 ，以 培养基的最佳初始p h 值为4 5 - 5 5 。而用高山被孢霉发酵e p a 的选用p h 为6 - 7 。随着 酸性代谢产物的积累，培养基p h 值下降，多不饱和脂肪酸的也会产量降低。吴继 军等利用添加缓冲剂来延长菌体处于较适p h 值的时间以期提高菌体产量及油脂产 量的研究表明，添加缓冲剂可提高菌体产量对油脂含量有一定的影响，但对不 饱和度的影响不大。 1 4 3 通透性调控与微生物代谢和生长 微生物的代谢和生长与膜对进出的化合物的选择通透性直接相关【蛔，提高细 胞膜的通透性对直接利用游离或固定化细胞进行生物转化反应十分重要【4 7 】。影响 细胞膜的通透性的诸因素中，最重要的是膜蛋白及其影响下的物质转运机制焖。 细胞膜的通透性是由包括整合的膜蛋白在内的运输系统来保证的。整合的膜蛋白 的特点是有一串强疏水的氨基酸序列区域，与膜磷脂的脂肪酸侧链相互作用，使 整合膜蛋白具有特异性。虽然所有的运输系统都有跨膜成分，但是有些系统还需 水溶性蛋白亚基来协助发挥全部的催化作用。生物膜上普遍存在着离子通道，通 过通道的电子流完全是由电化学势能差来驱动的，其对离子底物显示出了不同程 度的选择性【鲫1 。 细胞内累积的某一代谢产物浓度超过一定限度时，细胞会自然地通过反馈阻 遏限制其进一步合成。在实际研究和生产过程中，可采取生理或遗传学手段，改 变细胞膜的通透性，使胞内的代谢产物快速渗漏到细胞外，从而降低细胞内代谢 物浓度，解除末端代谢物的反馈抑制和阻遏，便可提高发酵产物的产量1 5 0 】。细胞 膜通透性改变亦有利于营养物质进入细胞，促进代谢。 1 4 3 1 遗传学调控方法 从遗传学的角度来看，一般可通过限制与细胞膜成分合成有关的营养因子浓 一8 上海水产大学硕士学位论文 度或筛选细胞膜组成成分合成不足的生理缺陷型突变株，使细胞膜的通透性改变。 选育温度敏感型、生物素缺陷型、油酸缺陷型或甘油缺陷型突变株，阻碍磷脂的 生物合成，当磷脂合成减少到正常量的5 0 左右时，细胞变形，会造成某些代谢产 物的外溢。如谷氨酸发酵，通过选育生物素缺陷型菌株，生成不完整的细胞膜， 初级代谢合成的谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中【5 1 饲。诱变选育获得的青霉 素高产菌株中，有些突变株就是由于改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更易透过 细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，增 加了合成青霉素的前体物，最终使青霉素的产量有所提高例。 1 a 3 2 物理调控方法 ( 1 ) 低频超声波 超声波有很强的生物学效应，它的作用机制分为热作用、空化作用和机械传 质作用。 超声致膜通透性改变存在阈值，阈值剂量主要决定于声强和辐照持续时间。 而与脉冲长度、工作周期( d u t yc y c l e ) 关系不大，但脉冲长度有一最低极限值， 只 有大于此值的超声辐照才可能提高膜通透性。超声辐照致膜通透性最大的剂量并 不是其致死阈值或其以上剂量，而是亚致死剂量【5 知。 李标5 囝等研究发现，一定强度的超声间断加载对阿氏假囊酵母( e a s h b y i i ) 的 生长有一定的促进作用，并使核黄素的开始分泌时间从9 6h 缩短到6 0h ；同时发现， 发酵9 6h 后加载，能有效提高核黄素的产量至0 3 4 6m g l ，非常显著地高于对照 组。李柏林跚等在微生物发酵制备庆大霉素的研究中，使用在线低频超声波处理， 改变菌丝体胞壁对庆大霉素的吸附性能，使部分被胞壁吸附的庆大霉素释放到发 酵液中，从而解除胞内产物的抑制作用促进产物合成。 ( 2 ) 电磁脉冲 脉冲电磁场的作用机理分为电场作用和电离作用。电场作用：每个细胞膜内外 都有一定的电位差，在外加电场的作用下，膜内外的电位差会增大，通透性会增 加，细胞发生渗透，继续适度处理，当电磁场达到一定值时，细胞膜就发生不可 修复的破裂这种现象称为电穿孔。电离作用：高强度电磁场的存在使得电解质电 9 上海水产大学硕士学位论文 离后的阴、阳离子更加活跃，能够更好的通过本以透性提高的细胞膜。改变膜内 外物质的分配，从而起到有利代谢的目的。目前，国外主要研究高强度电脉冲场 下细胞的电穿孔效应，其磁场强度一般大于1 0 5 v m 脉冲时间一般为l 驴一l o - 3 s t s 甸 代群威1 5 鲫等通过对在外加静磁场和正常情况下培养大肠杆茵生长情况的对比分 析，发现试验条件下所选磁场对大肠杆茵有明显促进生长的作用，茵落计数结果 表明磁场越强作用效果越明显。由于电磁脉冲处理是通过将细胞或组织打孔，从 而释放出胞内产物，因此电流的选择应根据可使细胞穿孔的电压及处理时间等因 素来定。 1 4 3 3 化学调控方法 ( 1 ) 抗菌素药物 细胞膜是药物进入多种胞内生物靶分子的必经之路，药物能够改变膜的流动 性破坏膜上蛋白质完成正常功能时所需的条件；有的通过特异的结合引起膜完整 的功能性紊乱使得离子和一些水溶性小分子从细胞内溢出造成细胞死亡；也有的 通过与膜外层蛋白非特异的结合，从而改变突触膜对离子的通透性而引起的变化 产生药效，当然有时一种药物可以增加另一种药物对膜的通透性嘲。 ( 2 ) 有机溶剂 有机溶剂透过细胞壁与细胞膜的脂质体进行内反应，破坏细胞膜的结构和脂 质体的流动性，使细7 胞膜失去原有的对胞内外物质传递的调控能力，从而提高 细胞膜的通透性。常用的有机溶剂有甲苯、d m s o 、氯仿、戊二醛等。这种方法经 常应用于酵母细胞【4 】。吐温、c 1 6 或c 1 8 饱和脂肪酸等表面活性剂则是通过拮抗不 饱和脂肪酸的生物合成，形成磷脂不足的细胞膜从而提高细胞膜对某些物质的通 透性钢。 ( 3 ) 渗透压调节 这是一个添加化学试剂，改变物理性质( 渗透压) 的调控方法。细胞与外部环 境本身存在着n a + 、心平衡，即稳定的渗透压，当处于失衡状态时，细胞膜的通 透性必将随之变化。s m i t h t 6 2 3 等对细胞内泻花碱的研究表明，在微生物发酵过程中， 向培养基中加入无机盐n a c l 、k c i 和有机盐山梨醇等可以增强培养基的离子强度 1 0 上海水产大学硕士学位论文 即改变渗透压，营养物质或代谢产物在胞内外进行新的分配。欧杰 6 3 1 等在野油菜 黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 胞膜离子通道透性对黄原胶的影响研究中提 出了重点对n a k 泵进行了调控，通过胞内外n a + 、对离子浓度的变化协助某些细 胞中的大分子物质的转运，从而使黄原胶的合成向正方向进行。 ( 4 ) 金属离予 日本人奈良岱1 1 发现i v l n 2 + 离子对产氨短杆菌核苷酸的细胞膜通透性起着关键作用。 m n 2 限量时可引起细胞形态变化，造成细胞和膨胀等异常形态，细胞膜亦发生变 化，非常专一的细胞膜通透性被破坏，5 - 肌苷酸发酵所用与补救途径的酶分泌到 培养基中，肌苷酸合成的前体次黄嘌呤和5 磷酸核糖也分泌到培养基中结果在细 胞外合成肌苷酸，此外由于细胞膜通透性的改变，通过全合成途径生成的肌苷酸 也被分泌到细胞外。 ( 5 ) 辅酶 生物素作为辅酶参与脂肪酸的合成进而影响磷脂的合成，在此基础上也可以 选择生物素缺陷型突变株 5 2 1 。 由于不同来源的细胞膜其化学组成不尽相同，因而对某种细胞膜通透性有影 响作用的化学试剂不一定适合于另一种细胞膜，因此具体选择何种化学方法还要 具体分析。 1 5 本研究的内容和意义 y ，亚麻酸( y - l i n 0 1 e n i ca c i d ，g l a ) 是i 1 6 系列的多不饱和脂肪酸，它是花生四 烯酸( a r a ) 、前列腺素( p g ) 、血栓素a 2 ( t x a 2 ) 和自三烯( l t ) 的直接前体，作 为人体必需脂肪酸参与细胞膜的组成，具有调节细胞的生理生化活性等一系列作 用。研究表明g l a 有降血脂、抗血栓、增强人体免疫、抗肿瘤、抗多种炎症等功 效，已在医药和食品等领域得到了广泛的应用。利用微生物发酵法具有不受原料 和气候限制、生产周期短、成本低和易于提取的优点，因此，成为了国内外研究 的热点，研究主要集中在培养条件和菌种选育等方面。而目前这些研究的观察焦 点往往关注高产菌种的选育和培养基的优化，但对于发酵过程中通透性调控对深 黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) 次级代谢的影响尚无关注。诱变选取的突变株作 1 1 上海水产大学硕士学位论文 为通透性调控试验菌株，从育种开始到发酵过程进行通透性调控。通过分析菌体 干重、总脂量以及脂肪酸含量变化，来探讨不同调控方法对g l a 合成变化的影响， 将对阐明g l a 合成的调控机理进一步提供依据，为明确其调控机理奠定了基础。 本文以目前国内外工业化生产所采用的深黄被孢霉( m o r t i e r e l l a i s a b e l l i n a ，a s 3 3 4 1 0 ) 为出发菌株，主要的研究内容如下： ( 1 ) 采用物理化学方法诱变，获得g l a 突变株。 ( 2 ) 以具有良好遗传稳定性的突变株为试验菌株，以简洁直观的菌体发酵分 析指标值来考察探讨不同调控方法( 依据已有的文献报道) 对于茵体生 长和代谢的影响。 ( 3 ) 在以上研究的基础上，选取一些对g l a 合成影响显著的因素，来考察在 这些因素下不同培养时间段和调控剂量的应用对三大参数( 菌体干重、 总脂量以及脂肪酸组成) 的影响，来研究通透性调控对g l a 的代谢的影 响，确定最适方法与调控剂量，为进一步微观研究膜形态的变化与次级 代谢的关系打下基础。 1 2 上海水产大学硕士学位论文 第二章u v 、l i c l 诱变深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，a s 3 3 4 1 0 ) 选育y 一亚麻酸突变株 目前国内外真菌发酵生产g l a _ ：e 要处于菌种筛选及通过诱变和优化发酵条件 提高产量的阶段。主要诱变剂有紫外线、氯化锂和脱饱和酶抑制剂以及d e s 等，紫 外线复合氯化锂是一种操作简便，效果较好的诱变方法，已经成功应用于多种不 饱和脂肪酸产生菌诱变育种，有效提高了产量。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) a s3 3 4 1 0 。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 斜面培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基( p d a ) ( 2 ) 诱变培养基： 含有u a 的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，“a 用量分别为0 3 、o 4 、0 5 ，1 2 1 ，2 0 m i n 灭菌。 ( 3 ) 摇瓶种子培养基( g l ) 葡萄糖6 0 ，酵母膏5 ，蛋白胨1 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 5 ， k 4 2 p 0 42 ，m g s 0 40 3 ，n a c l1 。1 2 1 ，2 0 r a i n 灭菌， ( 4 ) 摇瓶发酵培养基( g l ) 葡萄糖，酵母膏2 ，( n 凰) 2 s 0 4 0 7 ，k i - 1 2 p 0 42 ， m 茚0 40 3 ，n a c l 0 5 ，n a a c 3 ，c a c l 2 0 。7 ，1 2 1 ，2 0 m i n 灭菌。 1 3 上海水产大学硕士学位论文 2 1 3 诱变方法 取活化1 4 天后纯化的试管斜面菌种，用5 m l 生理盐水水洗斜面孢子于无菌空试 管，震荡，制成单孢子悬浮液，然后梯度稀释至l 酽。分别取0 2 m l 涂, 布于含有o 3 ( 8 个) 、0 4 ( 8 个) 和o 5 ( 8 个) l i c l 的p d a 培养皿上，1 5 w 紫外灯，距离3 0 c m 分别照射0 5 r a i n 、l m i n 、2 m i n 、4 m i n 、6 m i n 、8 m i n 、1 0 m i n 时间，然后避光3 0 培养7 1 4 天，待长出菌落后计数，计算致死率t 6 4 - 7 o 。 2 1 4 培养条件 种子培养：用2 5 m l 无菌蒸馏水洗斜面孢子( 接种量5 ) ，倒入装液量 2 0 ( 5 0 w _ u 2 5 0 m l ) 的三角瓶中，于2 8 c ，1 8 0 r r a i n 振荡培养2 d 。 发酵培养：接种量5 ，装液量2 0 ( 5 0 m l 2 5 0 m l ) ，于2 8 c ，1 8 0 r r a i n 振荡培养 8 d 。 2 1 5 生物量测定 以菌体干重作为生物量( b i o m a s s ) ：过滤菌体，并用蒸馏水洗涤2 0 次，于 7 0 烘干2 h 恒重后称重。 2 1 6 油脂的抽提 索氏抽提( 乙醚萃取) ，获得t l 值( t o t a ll i p i d s ，总脂肪) 。 2 1 7 油脂组分的气相色谱分析 ( 1 ) 样品处理：脂肪酸甲酯制备( b f 3 催化) 取样品1 - 2 滴，置于1 0 m l 的具塞试管中，加a , 0 5 m o l l 的k o h 甲醇溶液4 m l ， 充入氮气于6 5 恒温水浴加热3 0 m i n 皂化，再加入1 2 一1 4 b f a 甲醇溶液2 m l ， 充入氮气于6 5 恒温水浴加热5 - 1 0 r a i n 甲酯化，加入正己烷l m l 和饱和n a c i 溶 液2 m l , l 荡取上清液进样口删。 1 4 上海水产大学硕士学位论文 ( 2 ) 气相色谱条件： a g i l e n t6 8 9 0p l u s ，毛