大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介.doc

1 CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现1。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵2，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解3。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：型，型和型，其中以型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂2。受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑4，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等5。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点6。2 CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分6。型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解6（图2）。Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)7。当外源噬菌体或质粒首次入侵时，宿主菌通过识别PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到CRISPR基因座中，形成新的间隔序列。正常情况下CRISPR基因座的表达水平很低8，但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时，CRISPR基因座的表达水平快速上调，首先转录形成前体crRNA(pre-crRNA)，随后在tracrRNA的指导下，由Cas9和核酸内切酶RNase加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA。成熟的crRNA与tracrRNA形成crRNA:tracrRNA复合物，并结合Cas9形成核糖核蛋白复合物，crRNA上的间隔序列与外源DNA的原间隔序列互补配对，从而引导具有核酸内切酶活性的Cas9对DNA双链进行特异性切割。图1 宿主菌获得新间隔序列的机制6Fig.1 New spcacer of CRISPR acquisition图2 型CRISPR-Cas系统表达及降解外源遗传物质的机制6Fig.2 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break3 双质粒CRISPR-Cas9基因敲除系统本实验中采用双质粒CRISPR-Cas9系统5对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除，涉及到的两个质粒分别为pCas和pTargetF（图3）。该系统将crRNA:tracrRNA复合物融合为人工设计的sgRNA(single guide RNA)（图4），省去了将pre-crRNA加工为成熟crRNA的步骤，只需设计长度为20 nt，与靶序列互补的N20序列。pCas包含cas9基因及其原始启动子，将Cas9导向pTargetF的pMB1复制子的sgRNA-pMB1，提高编辑效率的-Red重组酶基因(gam、bet和exo)，卡那霉素抗性基因kanR和温敏复制子repA101。pTargetF包含sgRNA序列，N20序列，pMB1复制子和壮观霉素抗性基因aadA。首先向待敲除菌株中电转入pCas，通过L-阿拉伯糖(L-arabinose)诱导，使重组酶Gam、Bet和Exo表达。Gam能与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其活性，防止对外源DNA的降解。Exo为核酸外切酶，可以结合在双链DNA末端，从5向3降解DNA单链，产生3突出端。Bet能结合在3突出端上，保护其不被降解，并介导DNA互补链的退火9。然后将外源DNA敲除片段和含有N20序列的pTargetF-X（X代表待敲除的目的基因）同时电转入宿主细胞。其中，外源DNA敲除片段由目的基因的上游同源臂和下游同源臂融合而成（图5）。设计引物时，对上游同源臂的反向引物和下游同源臂的正向引物进行修饰，使其能反向互补，第一步PCR将上下游同源臂片段分别扩增出来。第二步PCR将上下游同源臂片段共同作为模板，利用两者间存在反向互补序列，能在退火时形成一段重叠链并延伸，从而实现融合。pTargetF-X转录形成的sgRNA通过N20序列与目的基因的同源序列相互配对，引导与之结合的Cas9识别靶序列进行切割，形成DNA双链断裂。随后通过同源重组，依靠外源DNA敲除片段对断裂的DNA进行替换10，从而使目的基因缺失。对于宿主细胞中pTargetF的去除，向培养基中添加异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导pCas转录形成sgRNA-pMB1，结合Cas9对pTargetF的pMB1复制子进行切割破坏。去除pTargetF而含有pCas的菌株可直接进行下一轮的敲除。对于无抗菌株的获得，将菌株于42下过夜培养，即可去除温敏质粒pCas。 图3 质粒pCas和pTargetF22Fig.3 Plasmid pCas and pTargetF图4 将crRNA:tracrRNA复合物融合为sgRNAFig.4 Construction of sgRNA图5 重叠PCR构建融合片段Fig.5 Construction of fused fragment by overlap extension PCR参考文献: 1 Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene productJ. Journal of Bacteriology, 1987, 169 (12): 5429-5433.2 Brouns S J J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotesJ. Science, 2008, 321 (5891): 960-964.3 李聪, 曹文广. CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展J. 生物工程学报, 2015, 31 (11): 1531-1542.4 刘妮, 陆沁, 刘娟, 陈航. CRISPR/Cas系统最新研究进展J. 生物技术通报, 2017, 33 (2): 53-58.5 Jiang Y, Chen B, Duan C, et al. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 systemJ. Applied & Environmental Microbiology, 2015, 81 (7): 2506-2514.6 方锐, 畅飞, 孙照霖, 李宁, 孟庆勇. CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术J. 生物化学与生物物理进展, 2013, 40 (8): 691-702.7 Mojica F J, Dez V C, Garca M J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence systemJ. Microbiology, 2009, 155 (3): 733-740.8 Pougach K, Semenova E, Bogdanova E, et al. Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coliJ. Molecular Microbiology, 2010, 77 (6): 1367-137